CN103614489A - 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种准确、灵敏、快速地检测登革热核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法，适合对登革热病毒(I，II，III和VI型)的定性检测。本发明试剂盒中含有恒温扩增反应液、阳性对照和阴性对照。首先，通过交叉引物恒温扩增靶核苷酸序列的方法，将提取的登革热病毒RNA在60℃恒温下扩增90分钟；其次，扩增后的产物与恒温扩增反应液中两条分别带生物素(Biotin)和异硫氰酸荧光素(Fitc)标记的探针杂交，其结果显示在核酸试纸条上；最后，通过与阳性、阴性对照的对比分析得出检测报告。本发明的试剂盒检测特异性好，灵敏度高、重复性好，无需复杂仪器便在可在2小时内可完成对样本的快速检测，亦可同时满足高通量和低通量的检测要求。

Description

一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种针对登革热病毒核酸的快速检测技术，适合对登革热病毒(I，II，III和VI型)的定性检测。
背景技术
登革热是由登革热病毒所引起的一种传染病，它是由属于黑斑蚊(也称艾迪斯蚊、伊蚊)的白线斑蚊(Aedes albopictus)与埃及斑蚊(Aedes aegypti)先叮咬患者后，成为“病媒蚊”，其它健康的人可能因这只病媒蚊叮咬而感染。有可能出现极度疲倦及抑郁症状，偶然病者会恶化至登革溢血热，并进一步出血、休克，甚至死亡。登革热产生的并发症往往是病人致死的主因。一般来说登革热主要分布在热带及亚热带地区。
登革热病毒广泛分布在北纬25度与南纬25度间，至1980年止，全球亚热带地区，有活动性登革热病毒传播的国家多达61个；广泛流行于全球热带及亚热带的60多个国家和地区，每年超过一亿人受感染，25亿以上的人受到威胁。登革病毒的传播现已经成为热带、亚热带地区严重的公共卫生问题。登革热影响所有年龄的人，但是大部分的登革溢血热却发生在年龄15岁以下的儿童。
近年来的发展起来针对登革热病毒的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在登革热病毒的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前登革热病毒检测的主要方法，目前国内市场上已经有了关于登革热病毒核酸定量检测试剂盒。
FQ-PCR虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器，且容易造成假阳性等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确、灵敏、快速地检测登革热核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。
登革热病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒，包括如下部分：
a)RNA提取液：德国QIAGEN RNA提取试剂盒(Qia-14162)
b)恒温扩增反应液：
包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermol buffer、MgSO4、dNTPs溶液、1×RNA secure、Bst DNA聚合酶(8U)、AMV逆转录酶(1U)和DEPC水，其中：
所述的外围引物分别为：
正向外围引物序列为5’-ACTATGCTGCCTGTAGCTCC-3’；
反向外围引物序列为5’-CTGGAATGATGCTGAGGAGAC-3’；
所述的两条探针的序列分别为：
正向5’端生物素(Biotin)标记探针：5’-Biotin-CACTACGCCATGCGTACAGC-3’
反向3’端异硫氰酸荧光素(Fitc)标记探针：5’-AGCGTCAATATGCTGTTTTTTG-Fitc-3’：
所述的扩增交叉引物分别为：
扩增反向引物5’-GGGAGGCCACAAACCATGGAGCAGGATCTCTGGTCTTTCC-3’
扩增正向引物5’-GCAGGATCTCTGGTCTTTCCGGGAGGCCACAAACCATGGA-3’
所述的1×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH8.8。
所述试剂盒还包括阳性对照模板，该阳性对照模板为含有登革热病毒POLYPROTEIN基因片段的转录产物。
本发明还提供一种采用上述试剂盒检测登革热病毒核酸的方法，包括下列步骤：
a)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA；
b)将步骤a)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应90分钟；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板，所述阳性对照模板为含有登革热病毒POLYPROTEIN基因片段的转录产物，所述阴性对照模板为DEPC水；
c)将反应后的PCR管放置到防污染核酸检测装置(专利号：ZL200610109620.4)中进行检测，15分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有登革热病毒。
本试剂盒为交叉引物恒温扩增靶核苷酸序列的方法及其应用(专利号：ZL200810134583.1)的应用，其核酸扩增的工作原理如图1所示。
在本发明提供本试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物引物和两条检测探针。本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠AMV逆转录酶的逆转录特性，将RNA模板反转录成DNA，再依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。
交叉引物的核酸恒温扩增反应中包含以下几个步骤：
1.交叉正向引物CPF中的PFs与模板DNA中PFa互补，启动DNA合成，使得PRa被引入到所扩增的产物中。
2.外围引物DP1s与PFa前端DP1a序列互补，通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，一边置换CPF合成的能与CPR和DP2a结合的单链产物(结构3)，一边与模板DNA形成双链产物(结构2)。
3.在结构3中，DP2a通过链置换型DNA聚合酶向前延伸，置换出由CPR所延伸的单链产物(结构5)，同时合成与步骤2中由CPF延伸所产生单链DNA形成双链产物(结构4)。而结构5相对起始的DNA模板，多了PRs和PFs两个片段序列。
4.单链结构5中的3’端的PFa和PRs可分别与CPF中的PFs和CPR中的PRa互补结合，可在链置换型DNA聚合酶的作用下延伸和置换出相应的单链产物。延伸产物相对结构5来说又增加了一个PFs区域(结构8)。
5.因此，扩增引物CPF和CPR的不断杂交和延伸，不仅使得结构5的长度不断的加长从而引入更多CPF和CPR3’端互补区域，同时也置换出了各种可与CPF和CPR3’端互补的单链产物。
6.通过CPF和CPR的不断杂交延伸和DNA聚合酶的链置换作用，使得DNA拷贝数不断的增加，从而达到基因扩增的效果。
7.在不同的扩增产物中存在能同时与两条分别带生物素(Biotin)和异硫氰酸荧光素(Fitc)标记的探针杂交的扩增产物(结构13，结构14)。这样的杂交产物可在核酸试纸条呈阳性。
在本发明提供的登革热病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了登革热病毒核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出101拷贝，可以满足快速检测登革热病毒的要求。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1.特异性好，灵敏度高步骤简单，可重复性高；
2.反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；
3.整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；
4.可同时满足高通量和低通量的样品检测；
5.整个反应过程不需要复杂的仪器。
附图说明
图1交叉引物恒温扩增的反应原理图
图2实施例3得到的检测登革热病毒的特异性的检测结果
图3实施例4得到的检测四型登革热病毒的检测结果
图4实施例5得到的检测登革热病毒的灵敏度的检测结果
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施中未注明具体实验条件和方法。
实施例1本发明试剂盒的组成与配制
a)RNA提取试剂：德国QIAGEN RNA提取试剂盒(Qia-14162)
b)反应液：两条外围引物(0.05μmol)，两条探针(0.5μmol)，和两条交叉引物(0.5μmol)，1×Thermol buffer，MgSO4(6mmol)，dNTPs溶液(0.4mmol)，1xRNA secure，Bst DNA聚合酶(8U)，AMV逆转录酶(1U)和DEPC水，总反应液体积为16μl。其中：
所述的外围引物分别为：
正向外围引物：5’-ACTATGCTGCCTGTAGCTCC-3’；
反向外围引物：5’-CTGGAATGATGCTGAGGAGAC-3’。
所述的两条探针的序列分别为：
正向5’端Biotin标记探针5’-Biotin-CACTACGCCATGCGTACAGC-3’；
反向3’端异硫氰酸荧光素(Fitc)标记探针5’-AGCGTCAATATGCTGTTTTTTG-Fitc-3’。
所述的扩增交叉引物分别为：
反向引物5’-GGGAGGCCACAAACCATGGAGCAGGATCTCTGGTCTTTCC-3’；
正向引物5’-GCAGGATCTCTGGTCTTTCCGGGAGGCCACAAACCATGGA-3’
1×Thermol buffer的组成：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4.0.1％Triton X-100。
所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。
c)阳性对照：含有登革热病毒POLYPROTEIN基因[NCBI Gene ID：1494449]的RNA片段。
阳性对照的制备步骤：利用一条外围引物和带有T7启动子的另一条外围引物以登革热病毒的基因组RNA模板进行RT-PCR扩增获得目的基因；用Promega的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过Promega的RiboMAXTM Large Scale RNAProduction Systems转录出目的RNA片段。用分光光度计测A280定量并稀释至106拷贝／μl，-20℃保存。
d)阴性对照：DEPC水。
实施例2用本发明试剂盒检测登革热病毒核酸的具体方法
a)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA；
b)取标本RNA作为模板加入到装有反应液的PCR管中，在60℃进行扩增反应90分钟，其中标本RNA4μl，反应液16μl；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板；
c)将反应后的PCR管放置到防污染核酸检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果。当样本中含有登革热病毒核酸时，试纸条的检测线上呈阳性；
反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要2个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。
实施例3本发明试剂盒检测登革热病毒的特异性
按照实施例2的方法同时检测甲型H3N2、甲型H5N1、季节性流感B、登革热病毒、甲型H9N7、甲型H1N1流感、人季节型流感H1N1。其检测结果如下表1(图2示)：
序号 名称 检测结果
1 甲型H3N2 -
2 甲型H5N1 -
3 甲型H9N7 -
4 甲型H1N1流感 -
5 季节性流感B -
6 登革热病毒 +
7 人季节型流感H1N1 -
表1：登革热病毒的特异性检测结果
注：“-”表示阴性，“+”表示阳性
从表1测试结果可见，用本发明试剂盒检测登革热病毒核酸特异性好，具有很强的专一性。
实施例4用本发明试剂盒检测四型登革热病毒(I，II，III和IV型)
按照实施例2的方法检测登革热病毒(I，II，III和IV型)。其检测结果如下表2(图3示)：
序号 名称 检测结果
1 登革热病毒(I型) +
2 登革热病毒(II型) +
3 登革热病毒(III型) +
4 登革热病毒(IV型) +
5 阴性对照 -
表2：四型登革热病毒的检测结果。
注：“-”表示阴性，“+”表示阳性
从表2测试结果可见，用本发明试剂盒可以检测四型登革热病毒核酸，并且具有很强的准确性。
实施例5用本发明试剂盒检测登革热病毒核酸的灵敏度
提取培养的登革热病毒的RNA，对其进行定量，分别稀释至浓度为104拷贝／微升、103拷贝／微升、102拷贝／微升、101拷贝／微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测登革热病毒核酸的灵敏度。结果如图4所示，图中1-5分别表示104拷贝／微升、103拷贝／微升、102拷贝／微升、10拷贝／微升、1拷贝／微升，6是阴性对照，可以发现该试剂盒的最低检出量是10个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测登革热病毒的要求。
Figure ISA0000094632320000011
Figure ISA0000094632320000021
Figure ISA0000094632320000031

Claims (5)

1.一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于包括：1)登革热病毒核酸通用型恒温扩增反应液：两条外围引物(0.05μmol)、两条探针(0.5μmol)、两条交叉引物(0.5μmol)、1×Thermol buffer、MgSO4(6mmol)、dNTPs溶液(0.4mmol)、1×RNA secure、Bst DNA聚合酶(8U)、AMV逆转录酶(1U)和DEPC水；2)阳性对照：含有登革热病毒POLYPROTEIN基因的RNA片段；3)阴性对照：DEPC水。 
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所述的反应液中的两条外围引物分别为： 
外围正向：5’-ACTATGCTGCCTGTAGCTCC-3’ 
外围反向：5’-CTGGAATGATGCTGAGGAGAC-3’。 
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所述的反应液中的两条探针分别为： 
正向5’端Biotin标记探针：5’-Biotin-CACTACGCCATGCGTACAGC-3’ 
反向3’端Fitc标记探针：5’-AGCGTCAATATGCTGTTTTTTG-Fitc-3’。 
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所述的反应液中的两条交叉引物包含分别为： 
正向引物：5’-GCAGGATCTCTGGTCTTTCCGGGAGGCCACAAACCATGGA-3’ 
反向引物：5’-GGGAGGCCACAAACCATGGAGCAGGATCTCTGGTCTTTCC-3’。 
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所述的登革热病毒阳性对照含有286bp的登革热病毒POLYPROTEIN基因CDS序列，序列如下： 
AAACTATGCTGCCTGTAGCTCCACCTGAGAAGGTGTAAAAAATCTGGGAGGCCACAAACCATGGAAGCTGTACGCATGGCGTAGTGGACTAGCGGTTAGAGGAGACCCCTCCCTTACAAATCGCAGCAACAATGGGGGCCCAAGGCGAGATGAAGCTGTAATCTCGCTGGAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCCCGAAACAAAAAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCACAGAACGCCAGAAAA。 
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