CN111826463A - 用于五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒检测的引物探针组合、试剂盒及其应用 - Google Patents

用于五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒检测的引物探针组合、试剂盒及其应用 Download PDF

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杜寿文
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Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用于建立同时检测黄热病毒(YFV)、拉沙病毒(LASV)、汉坦病毒(HTV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)及登革热病毒(DENV)的极速检测引物探针组合、试剂盒及其应用。本发明具备很高的灵敏度和特异性，其建立的方法与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，具有很好的应用前景。

Description

用于五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒检测的引物探针组合、 试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及用于五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒检测的引物探针组合、试剂盒及其应用。
背景技术
通过近年来我国对新发突发传染病，尤其是严重急性呼吸道综合征(severeacute respiratory syndrome，SARS)、甲型H1N1流感、输入型埃博拉、中东MERS、寨卡等的防控经验表明，快速诊断在病毒性传染病的预防和控制中发挥着越来越重要的作用。这些诊断试剂从方法学上讲，主要分为两大类，即免疫学诊断和分子诊断。免疫学诊断技术一般是以抗原抗体特异性反应为基础的检测技术，主要包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫层析技术以及最近发展的以化学发光法、时间分辨荧光分析法等为代表的新型检测技术。而分子诊断则是病毒核酸为对象的病原快速检测技术，早期的分子诊断技术是采用核酸杂交技术对目的核酸进行检测，而随着分子生物学的发展，多种扩增放大技术被应用于临床诊断中。将低拷贝的靶序列成对数级放大扩增，同时采用比放射性探针更灵敏的非放射性检测系统(如电化学发光系统、实时荧光系统等)，大大提高了核酸检测的敏感性，并减少了放射性物质的使用。这其中的代表技术是以荧光系统为代表的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR)。该方法具有的诸多优点如快速准确、髙通量、高敏感性，模板污染可能性低，不需要再进行电泳检测等都为它的推广奠定了基础，现在已经广泛应用于医学诊断、出入境检疫、基础研究，特别是医学和分子生物学等研究领域。
而传统的荧光定量PCR方法尚存在试剂价格高，检测时间长、无法达到真正的即时检验(point-of-care testing,POCT)，不能实现便携、可移动及现场快检的要求。而微流控芯片技术作为近年来新用于检测的新型技术，可以弥补以上不足。该技术的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。探针和靶分子的作用是主动式的，因而大大增强敏感性，提高反应速率。针对病原微生物基因组的特征性片段、染色体DNA的序列多态型、基因变异的位点及特征等，设计和选择合适的核酸探针，经PCR扩增后检测，就能获得病原微生物种属、亚型、毒力、抗药、致病、同源性、多态型、变异和表达等信息，为疾病的诊断和治疗提供一个很好的切入点。
登革病毒(Dengue virus,DENV)是有囊膜的正链RNA病毒，通过虫媒传播，属于黄病毒科黄热病毒属。共分为DENV1-4共4个血清型，每种血清型又存在多种基因型。自上世纪五十年代，登革热在全球范围广泛蔓延，每年新增病例约为3900万，全球化进程也加快了该病的流行进程。登革热病毒直径为50nm，成熟病毒粒子含有衣壳蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E三个结构蛋白，多个C蛋白包裹病毒基因组RNA形成病毒核衣壳。依赖患者年龄、状态等不同因素，病程表现存在差异。但大多数临床感染均呈现发热症状，称为登革热。严重疾病状态会出现毛细血管通透性增加的特征，进而导致血浆渗漏，从而导致血流动力障碍和登革休克综合征(DSS)。如果不治疗，严重疾病可能导致个体死亡率提高至20％，但经专业及时的处置和液体替代治疗，死亡率可以降低到不到1％，因此，做到快速准确对登革热病毒实现早诊断、早发现、早治疗十分关键。
黄热病也是一种经蚊虫传播的急性传染病，主要由黄热病病毒感染造成人类患病，该病毒是黄病毒科的重要成员之一。该病毒仅能通过趋血蚊和伊蚊体感染人类和非人灵长类，在18世纪对人类健康造成了严重危害，由于蚊虫管理和疫苗的出现，有效控制了该病的发展，但本世纪初，该病卷土重来，造成了全球多地散发流行。黄热病病毒具有嗜内脏性及嗜神经性，临床以高热、头痛、黄疸、蛋白尿、相对缓脉和出血等为主要表现，具有死亡率高及传染性强的特点，已纳入世界卫生组织规定之检疫传染病之一。目前最普遍的诊断程序是基于抗YF抗体建立的IgMELISA检测方法，检测过程需要数小时，但存在与登革热等病毒的交叉反应，误导疾病的判断进而影响了疾病的早期干预，所以亟需更为快速准确的诊断方法出现。
基孔肯雅热是另一种新发虫媒传染病，该病由基孔肯雅病毒(CHIKV)引起，以发热、皮疹及关节疼痛为主要特征。本病主要流行于非洲和东南亚地区，近年在印度洋地区造成了大规模流行。CHIKV属于披摸病毒科甲病毒属的森林脑炎抗原复合群，直径约70nm，有囊膜，含有3个结构蛋白(衣壳蛋白C，包膜蛋白E1、E2)和四个非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4)，基因组为不分节段的正链RNA，长度11～12kb。与其他虫媒传染病相比，感染基孔肯雅热病毒的患者85％以上出现明显的临床症状，表现为感染后3-5天高热达39℃，血液病毒含量迅速提升至109拷贝/mL。急性感染通常持续1周，直到IgM出现时病毒血症才结束。发烧后，患者发生严重的肌痛和关节痛；甚至严重影响行动，因此多发性疼痛是诊断基孔肯雅热病毒血症的重要指征，预测准确率高达80％，皮疹等在该病中也经常出现，重要的是目前尚无有效的治疗药物和疫苗，所以对环境中和传染源该病毒的监控更有助于基孔肯雅热的控制和管理。
近年来，随着新技术的应用和新型病毒的发现，汉坦病毒及其相关疾病的研究得以飞速发展。汉坦病毒归属布尼亚病毒科，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，基因组包括L、M、S3个片段，分别编码L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核蛋白，肺综合征(HPS)和肾综合征出血热(HFRS)是该病毒主要引起的两种临床疾病。与啮齿动物有关的汉坦病毒是引起亚洲和欧洲HFRS和美洲的HPS的主要病原，在中国，每年HFRS报告病例多达1万例，其发病率和死亡率都很高。但汉坦病毒是布尼亚病毒科内唯一不通过虫媒传播的病毒，近期的一些研究也表明蜱螨对汉坦病毒传播的影响作用。
沙粒病毒(Lassa fever virus，LASV)是沙粒病毒科的原型病毒，是多形的囊膜病毒，直径范围从50nm到300nm，包含约10.5kb的单链双节段双义RNA基因组。病毒转录和复制发生在细胞质中。沙粒病毒是拉沙热的病原体，1969年在尼日利亚何塞高原首次提出，西非是该病毒的自然疫源地，但周边地区也多次发现该病，表明其疫病区范围正在逐渐扩大。拉沙热主要通过啮齿动物传播，大多数LASV感染无症状或轻度，约20％的感染导致中度至重度疾病，潜伏期长达21天，逐渐出现发热，头痛，肌痛，关节痛，呕吐，腹泻，血液中的肝酶水平升高，甚至出现淋巴结肿大和/或结膜或粘膜表面的出血，提示预后不良。孕期LASV感染，孕产妇死亡率约20％，胎儿死亡率接近100％。儿童感染可因其广泛水肿，腹胀和出血等“婴儿肿胀”综合症。目前研究证明，如果疾病早期给药，广谱抗病毒药物利巴韦林似乎可以减少疾病对拉沙热患者的伤害，因此，快速可靠诊断对于降低拉沙热发病率和死亡率至关重要。
鉴于上述重要节肢/啮齿媒介传播病毒的危害，目前尚缺少高通量的快速检测方法，对于以上几种重要节肢/啮齿媒介传播病毒感染的临床诊断，多以临床症状及流行病学资料作为依据，而确诊需用病毒分离培养、血清学检测及病毒核酸的分子生物学检测等实验室诊断。在这些方法中，基于荧光定量的病毒核酸检测最为常用。而传统的荧光定量PCR方法尚存在试剂价格高，检测时间长、无法达到真正的即时检验(point-of-care testing,POCT)，不能实现便携、可移动及现场快检的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒检测的引物探针组合、试剂盒及其应用，具体提供一种快速、高效、高通量和高灵敏度检测YFV、LASV、HTV、CHIKV以及DENV的方法以及检测试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物探针组合，包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
(3)、荧光探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
(4)、如(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(5)、与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合二：
(6)、上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和
(7)、下游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
(8)、荧光探针具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或
(9)、如(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(10)、与(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合三：
(11)、上游引物具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；和
(12)、下游引物具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；和
(13)、荧光探针具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；或
(14)、如(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(15)、与(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合四：
(16)、上游引物具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；和
(17)、下游引物具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和
(18)、荧光探针具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；或
(19)、如(16)、(17)或(18)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(16)、(17)或(18)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(20)、与(16)、(17)或(18)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合五：
(21)、上游引物具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；和
(22)、下游引物具有如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；和
(23)、荧光探针具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；或
(24)、如(21)、(22)或(23)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(21)、(22)或(23)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(25)、与(21)、(22)或(23)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
所述引物探针组合中，序列如表1所示：
表1
Figure BDA0002539415140000061
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个或6个。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂和/或试剂盒中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为节肢/啮齿媒介传播病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述节肢/啮齿媒介传播病毒为黄热病毒(YFV)、拉沙病毒(LASV)、汉坦病毒(HTV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)或登革热病毒(DENV)中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒检测的扩增条件为：
Figure BDA0002539415140000062
。
本发明还提供了病毒检测的试剂盒，包括所述的引物探针组合以及常用的助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒检测的所述病毒为节肢/啮齿媒介传播病毒。在本发明的一些具体实施方案中，所述节肢/啮齿媒介传播病毒为黄热病毒(YFV)、拉沙病毒(LASV)、汉坦病毒(HTV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)或登革热病毒(DENV)中的一种或多种。
在上述研究的基础上，本发明还提供了病毒检测的试剂盒，包括所述的引物探针组合以及常用的助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为重要节肢/啮齿媒介传播病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重要节肢/啮齿媒介传播病毒为黄热病毒(YFV)、拉沙病毒(LASV)、汉坦病毒(HTV)、基孔肯雅热病毒(CHIKV)以及登革热病毒(DENV)中的一种或多种。
本发明提供的试剂盒具备很高的灵敏度和特异性，其建立的方法与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，具有很好的应用前景。本发明提供的检测方法选用美康基因提供的不同病毒的检测试剂盒，利用其生产的基于微流控芯片技术和具有独特快速反应体系及创新性温控模块研制的极速荧光定量PCR仪，通过选择不同组合、优化反应条件、规范实验流程、建立质控标准，建立可同时检测五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒的快速检测技术平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例2中YFV的特异性检测结果；
图2示本发明实施例2中LASV的特异性检测结果；
图3示本发明实施例2中HTV的特异性检测结果；
图4示本发明实施例2中CHIKV的特异性检测结果；
图5示本发明实施例2中DENV型的特异性检测结果；
图6示本发明实施例3中YFV、LASV、HTV、CHIKV以及DENV的灵敏性检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种用于五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒检测的试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明还提供了YFV、LASV、HTV、CHIKV以及DENV的极速检测方法，包括如下步骤：
核酸提取(配合Hs480加热离心机使用)
1)取样品50μl加入5μlFastLyseL4，震荡混匀；
2)将混匀后的样本置于HS480加热离心一体机中95℃加热2min，5000rpm离心2min，上清可直接作为模板用于RT-PCR扩增；
3)阳性对照与阴性对照与待测样本同步进行处理。
二、PCR试剂配制
1)配制PCR反应液：预先混合极速PCRbuffer1(68μl)与极速PCR酶系(17μl)(比实际反应管数多2个，避免加样过程中发生损耗，混合时避免产生气泡)；
2)各取5μl上述混合液分装至PCR反应管(15管)中，分别加入2μl相应的引物探针，编号并充分混匀；(注意：使用前确保极速PCRbuffer1和引物探针混合液充分溶解)。
三、加样
1)取已处理好的样品RNA、阳性对照、阴性对照各3μl分别加入到相应的PCR反应管中；
2)取8μl终混合液垂直加入PCR扩增芯片中，盖上芯片盖，移至扩增检测区。建议芯片加样顺序如下：
表2
01 YFV(PC) 09 HTV(待检样品RNA)
02 YFV(NC) 10 CHIKV(PC)
03 YFV(待检样品RNA) 11 CHIKV(NC)
04 LASV(PC) 12 CHIKV(待检样品RNA)
05 LASV(NC) 13 DENV(PC)
06 LASV(待检样品RNA) 14 DENV(NC)
07 HTV(PC) 15 DENV(待检样品RNA)
08 HTV(NC) 16 水
四、PCR扩增检测
1)将PCR扩增芯片插入Mokobio UltraFast LabChip Real-time PCR V280中进行扩增检测。
2)循环参数设定：
表3
Figure BDA0002539415140000091
3)仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM通道，内标荧光信号选择Cy5通道。
本发明建立的方法与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，若推向临床，具有很好的应用前景。
本发明提供的用于五种呼吸道病毒检测的试剂盒及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
以下实施例均按照常规实验条件中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1重复性检测
以稀释10倍的各病毒阳性对照作为待检样品进行重复性检测，共重复检测3次。
一、核酸提取(配合Hs480加热离心机使用)
1)取样品50μl加入5μl FastLyse L4，震荡混匀；
2)将混匀后的样本置于HS480加热离心一体机中95℃加热2min，5000rpm离心2min；
3)离心结束后，取上清即为样品RNA，编号；
4)阳性对照、阴性对照与待测样本同步进行处理。
二、PCR试剂配制
1)配制PCR反应液：预先混合极速PCR buffer1(68μl)与极速PCR酶系(17μl)(比实际反应管数多2个，避免加样过程中发生损耗，混合时避免产生气泡)；
2)各取5μl上述混合液分装至PCR反应管(15管)中，分别加入2μl相应的引物探针，编号并充分混匀；(注意：使用前确保极速PCR buffer 1和引物探针混合液充分溶解)。
三、加样
1)取已处理好的样品RNA、阳性对照、阴性对照各3μl分别加入到相应的PCR反应管中；
2)取8μl终混合液垂直加入PCR扩增芯片中，盖上芯片盖，移至扩增检测区。建议芯片加样顺序如下：
表4
Figure BDA0002539415140000101
Figure BDA0002539415140000111
四、PCR扩增检测
1)将PCR扩增芯片插入Mokobio UltraFast LabChip Real-time PCR V280中进行扩增检测。
2)循环参数设定：
表5
Figure BDA0002539415140000112
3)仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM通道，内标荧光信号选择Cy5通道。
五、结果
表6重复性检测数据统计结果
Figure BDA0002539415140000113
共重复检测了3次，结果Ct值变异系数(CV)基本均≤5％，重复性较好。
实施例2特异性检测
分别以各病毒阳性对照作为待检样品进行特异性检测，检测方法同实施例1。
结果：各病毒阳性对照样品仅在对应的探针下呈阳性，其余均呈阴性，特异性较好，结果如图1～图5所示。
实施例3敏感性检测
将试剂盒中的各病毒阳性对照(浓度均为1×105copies/ml)梯度稀释至1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml和1×101copies/ml，制备好后以此作为待测样品用对应的试剂盒进行敏感性检测。
具体实施步骤同实施例1。
结果：YFV、LASV、HTV、CHIKV以及DENV的检测限均不高于1×101copies/ml，结果如图6所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市人民医院，军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 用于五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒检测的引物探针组合、试剂盒及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctagaggtta gwggagaccc cc 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tccattttct ggcgttctgt 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acagcaggat ctctggtcty tccca 25

Claims (9)

1.引物探针组合，其特征在于，包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
(3)、荧光探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
(4)、如(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(5)、与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合二：
(6)、上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和
(7)、下游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
(8)、荧光探针具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或
(9)、如(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(10)、与(6)、(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合三：
(11)、上游引物具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；和
(12)、下游引物具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；和
(13)、荧光探针具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；或
(14)、如(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(15)、与(11)、(12)或(13)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合四：
(16)、上游引物具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；和
(17)、下游引物具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和
(18)、荧光探针具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；或
(19)、如(16)、(17)或(18)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(16)、(17)或(18)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(20)、与(16)、(17)或(18)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合五：
(21)、上游引物具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；和
(22)、下游引物具有如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；和
(23)、荧光探针具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；或
(24)、如(21)、(22)或(23)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(21)、(22)或(23)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(25)、与(21)、(22)或(23)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个或6个。
3.如权利要求1或2所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂和/或试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒为节肢/啮齿媒介传播病毒。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述节肢/啮齿媒介传播病毒为黄热病毒(YFV)、拉沙病毒(LASV)、汉坦病毒(HTV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)或登革热病毒(DENV)中的一种或多种。
6.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒检测的扩增条件为：
Figure FDA0002539415130000021
Figure FDA0002539415130000031
7.病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物探针组合以及常用的助剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒为节肢/啮齿媒介传播病毒。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述节肢/啮齿媒介传播病毒为黄热病毒(YFV)、拉沙病毒(LASV)、汉坦病毒(HTV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)或登革热病毒(DENV)中的一种或多种。
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Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102140530A (zh) * 2010-12-24 2011-08-03 中国检验检疫科学研究院 基孔肯雅病毒荧光定量pcr检测新方法及基孔肯雅病毒检测pcr体系
CN102277452A (zh) * 2011-08-18 2011-12-14 深圳国际旅行卫生保健中心 烈性传染病病毒检测试剂盒及检测方法
CN103305633A (zh) * 2013-06-14 2013-09-18 浙江国际旅行卫生保健中心 一种多重荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN103614489A (zh) * 2013-08-30 2014-03-05 狄飚 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN105087824A (zh) * 2015-03-04 2015-11-25 浙江省疾病预防控制中心 出血热相关病原体鉴别基因芯片的制备和用途
CN106755565A (zh) * 2015-11-20 2017-05-31 广东省疾病预防控制中心 一种基于荧光pcr法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒
CN106755571A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 博奥生物集团有限公司 一种用于检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的试剂盒
CN107151711A (zh) * 2017-06-26 2017-09-12 湖州市第人民医院 一种检测登革病毒和寨卡病毒的双重荧光定量rt‑pcr试剂盒
US20170335408A1 (en) * 2016-03-15 2017-11-23 Abbott Laboratories Methods and Systems of Multi-Assay Processing and Analysis
CN107893128A (zh) * 2017-11-09 2018-04-10 贵州医科大学 同时检测10种虫媒病毒的引物对组合、探针及应用
CN109338016A (zh) * 2018-11-06 2019-02-15 南通国际旅行卫生保健门诊部 拉沙病毒快速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合
CN109355433A (zh) * 2018-11-26 2019-02-19 南通国际旅行卫生保健门诊部 一种汉坦病毒极速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102140530A (zh) * 2010-12-24 2011-08-03 中国检验检疫科学研究院 基孔肯雅病毒荧光定量pcr检测新方法及基孔肯雅病毒检测pcr体系
CN102277452A (zh) * 2011-08-18 2011-12-14 深圳国际旅行卫生保健中心 烈性传染病病毒检测试剂盒及检测方法
CN103305633A (zh) * 2013-06-14 2013-09-18 浙江国际旅行卫生保健中心 一种多重荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN103614489A (zh) * 2013-08-30 2014-03-05 狄飚 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN105087824A (zh) * 2015-03-04 2015-11-25 浙江省疾病预防控制中心 出血热相关病原体鉴别基因芯片的制备和用途
CN106755565A (zh) * 2015-11-20 2017-05-31 广东省疾病预防控制中心 一种基于荧光pcr法联合检测登革热病毒及基孔肯亚病毒的试剂盒
US20170335408A1 (en) * 2016-03-15 2017-11-23 Abbott Laboratories Methods and Systems of Multi-Assay Processing and Analysis
CN106755571A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 博奥生物集团有限公司 一种用于检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的试剂盒
CN107151711A (zh) * 2017-06-26 2017-09-12 湖州市第人民医院 一种检测登革病毒和寨卡病毒的双重荧光定量rt‑pcr试剂盒
CN107893128A (zh) * 2017-11-09 2018-04-10 贵州医科大学 同时检测10种虫媒病毒的引物对组合、探针及应用
CN109338016A (zh) * 2018-11-06 2019-02-15 南通国际旅行卫生保健门诊部 拉沙病毒快速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合
CN109355433A (zh) * 2018-11-26 2019-02-19 南通国际旅行卫生保健门诊部 一种汉坦病毒极速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTIAN DROSTEN 等: "Rapid detection and quantification of RNA of Ebola and Marburg viruses, Lassa virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Rift Valley fever virus, dengue virus, and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR", 《J CLIN MICROBIOL》 *
黄晓霞 等: "病毒性出血热概述", 《中国国境卫生检疫杂志》 *

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