CN106435020A - 用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用试剂盒 - Google Patents

用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用试剂盒，属于RT‑PCR检测技术领域。本发明的试剂盒含有一对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明还提供了检测不同基因型传染性支气管炎病毒的方法。本发明试剂盒和检测方法具有高特异性、高灵敏度、高效率、通用性好、低成本的特点，可在6.5h内对临床病料进行快速鉴别诊断，本发明为IBV的早期快速诊断和开展分子流行病学调查提供技术手段，以更好地指导养禽生产中对该病的防控。

Description

用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用试剂盒及其应用。
背景技术
传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)属冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)，有囊膜单股正链RNA病毒，基因组约为27.6kb。IBV基因组编码四种必需结构蛋白：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和小膜蛋白(E)。N蛋白是位于膜内的磷酸化核心多肽，分子量约46ku，磷酸化后的分子量约51ku。N蛋白基因序列较保守，主要作用是与病毒RNA结合形成核衣壳，能特异性地结合到引导RNA上，并且能诱导细胞介导的免疫应答和交叉反应性ELISA抗体。
IBV血清型多并且不同血清型毒株之间仅有部分或无交叉保护作用，所以即使免疫IB疫苗，本病仍可发生，给养禽业造成很大危害。IBV引起鸡的临床症状和病理变化复杂多样，造成的损伤主要表现为破坏呼吸道黏膜的完整性，感染IBV可诱发其它条件性疾病混合感染(如支原体、新城疫、慢性呼吸道病等)以及引起大肠杆菌、沙门氏菌等继发感染，且IB临床症状与禽流感(AI)、新城疫(ND)、鸡传染性喉气管炎(ILT)具有一定的相似性，给IB的诊断带来困难。因此，快速准确地检测IBV，是预防和控制IB的关键。国际上已经建立的诊断方法很多，如血清学方法有细胞中和试验、ELISA、血凝和血凝抑制试验等，这些方法虽已属常规技术，但具体应用到IBV检测中，或因IBV型间抗原差异大而降低敏感性，导致漏检；或因常规血清学方法本身的缺陷而呈现假阳性，造成误检。而传统的病毒分离方法，对采集病料的时机和病料的新鲜程度要求较高，且检测周期往往要几周以上，具有明显的局限性。
RT-PCR技术是一种快速、敏感、特异的分子生物学检测方法。80年代该技术的产生给病毒检测提供了一种新的选择，在检测各种病毒中得到了广泛应用。IBV众多血清型中的序列同源性存在一定差异，且不断有新的变异株产生，这为检测IBV带来了技术困难。
发明内容
本发明的第一个目的在于，克服现有技术的障碍，为保证较高的IBV检出率和检测结果的准确性，本发明针对IBV核蛋白N基因的保守序列设计了通用检测引物，可用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒。
本发明的第二个目的在于提供检测不同基因传染性支气管炎病毒的试剂盒。
本发明以NCBI数据库中IBV-YN(GenBank：F893452)基因组序列作为参考，上游引物在26235nt-26254nt之间，下游引物在27045nt-27064nt之间。在众多备选的引物中，经过多次筛选，比对试验，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的引物对。
本发明提供的优选的引物对，其序列为：
上游引物为5’-GGTATAGTGTGGGTT(G/T)CTGC-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物为5’-AGCTGTGCATTGTTCCTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。
提取样本总RNA并进行反转录(RT)合成cDNA后，利用上述引物进行聚合酶链式反应(PCR)，采用下列反应程序：起始变性94℃5min，30个循环(94℃45s，57℃45s，72℃50s)，最后经过72℃10min延伸，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出目的条带则证明为IBV阳性，否则为阴性。
本发明提供了上述通用性引物对在制备检测传染性支气管炎病毒血清型试剂盒中的应用。
含有SEQ ID NO.1-2所示通用性引物对的检测试剂属于本发明的保护范围。
含有SEQ ID NO.1-2所示通用性引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。
进一步地，本发明的试剂盒其PCR阶段的工作程序为：94℃5min；94℃45s，57℃45s，72℃50s，30个循环；72℃10min。
本发明的上述试剂盒是对待测样本进行RT-PCR检测后，扩增产物若有830bp大小的条带，则待测样本中含有传染性支气管炎病毒。
本发明还提供了一种检测不同基因型传染性支气管炎病毒的非诊断目的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA，反转录，得到cDNA；
(2)利用SEQ ID NO.1-2所示通用性引物对对步骤(1)的cDNA进行PCR扩增，根据扩增结果判断待测样本中是否有传染性支气管炎病毒。
其中，步骤(2)中阳性样本扩增的目的片段为830bp。
本发明的优点在于，1)扩增的目的片段位于IBV的N蛋白的高度保守区，长度为830bp，敏感性好、操作方便、对不同基因型的IBV均有较好检出(通用性)；2)将IBV病毒样本cDNA进行10倍系列稀释后，发现进行100000倍稀释后利用本方法仍能检测到IBV特异性条带，表明该方法具有较高的灵敏度；3)该方法对其它常见禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒和禽传染性喉气管炎病毒的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该方法亦具有良好的特异性；4)本发明方法适用于养禽生产中进行IBV的检测，具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，可在6.5h内对临床病料进行快速鉴别诊断，克服了传统检测方法耗时较长的缺点，对IBV的早期快速诊断以及分子流行病学调查研究提供了可靠的技术手段。
附图说明
图1是最佳扩增引物筛选电泳结果。点样顺序为M：Marker III；1：引物1(830bp)；2：引物2(837bp)；3：引物3(785bp)；4：引物4(704bp)。
图2是RT-PCR反应最佳退火温度筛选电泳结果。点样顺序为M：Marker III；1：55℃；2：56℃；3：57℃；4：58℃；5：59℃。
图3是RT-PCR反应最佳循环数筛选电泳结果。M：Marker III；1：28循环；2：29循环；3：30循环；4：31循环；5：32循环；6：33循环。
图4是根据IBV S1基因所绘制的遗传进化树，图中●显示不同基因型的IBV代表性毒株，用于本发明方法的IBV通用性检测。
图5是对不同基因型传染性支气管炎病毒进行检测的电泳结果。点样顺序为M：DNAMaker II；P：阳性对照；N：阴性对照；1：4/91；2：T株(肾型标准株)；3：YN株(YN-like)；4：M41(M型标准株)；5：JS株(QX-like)；6：GD株(TW-like)。
图6是该引物检测传染性支气管炎病毒的灵敏度电泳结果。点样顺序为M:DNAmaker II；P:阳性对照；N：阴性对照；1：cDNA稀释10倍；2：cDNA稀释102倍；3：cDNA稀释103倍；4：cDNA稀释104倍；5：cDNA稀释105倍。
图7是对其它常见禽病病原进行检测的电泳结果。其中M：DNA Maker II；P:阳性对照；N：阴性对照；1：H5亚型禽流感病毒；2：H7亚型禽流感病毒；3：H9亚型禽流感病毒；4：新城疫病毒(NDV)；5：传染性法氏囊病毒(IBDV)；6：禽呼肠孤病毒(REOV)；7：禽腺病毒(FAdV)；8：禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)。
图8为文献中记载的引物检测IBV结果图，样品顺序：M：Marker II；P：阳性对照；N：阴性对照；1：cDNA稀释10倍；2：cDNA稀释102倍；3：cDNA稀释103倍；4：cDNA稀释104倍；5：cDNA稀释105倍。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下列实施例中常规的实验方法，参见Sambrook等编写的分子克隆。仪器的使用参照仪器操作说明。LEGEND MICRO 17R低温台式离心机，为Thermo公司产品；VS-1涡旋振荡器购自鼎昊源科技有限公司；TL-2010S组织研磨震荡器购自鼎昊源科技有限公司。反转录酶(Reverse Transcriptase)200U/μl(Promega)、核酸酶抑制剂(Rnase Inhibitor)50U/μl(Takara)、5倍体积的反应缓冲液(5×Reaction Buffer)、dNTP混合物2.5mM和随机引物(Random Primer)500μg/ml(Promega)，购自北京爱普锐晟科技有限公司；DEPC处理水，购自北京明豪至远有限公司。Marker II DNA Ladder购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，购自北京诚茂兴业科技发展有限公司；MINI-Smart小型台式离心机为HERO公司产品；HW·SYII-KP3型电热恒温水槽购自北京长风仪器仪表公司。
本发明实施例中选用的生物材料如下：禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒和禽传染性喉气管炎病毒，传染性支气管炎病毒4/91型、T株(肾型标准株)、M41(M型标准株)、YN株(YN-like)、JS株(QX-like)、GD株(TW-like)均由中国农业大学动物医学院保藏和提供。
实施例1用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用性引物的设计
参照NCBI数据库中IBV-YN(GenBank：F893452)基因组序列并筛选引物。在众多备选的引物中，经过多次筛选，比对试验，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，经反复筛选和验证，最终获得4组备选引物对，继续对四组引物对进行实验，选择最优化的引物对。表1中的引物1、2、3、4组引物对均为针对同一个靶基因的引物，它们的位置邻近。各引物扩增电泳结果如图1所示。选择扩增目的条带最亮，无非特异性杂带的引物对1为最佳引物，上游引物在GenBank登录号为F893452的26235nt-26254nt之间，下游引物在27045nt-27064nt之间。
表1用于检测不同基因型IBV备选引物序列
本发明提供的优选特异性引物对，其序列为：上游引物为5’-GGTATAGTGTGGGTT(G/T)CTGC-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物为5’-AGCTGTGCATTGTTCCTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。
实施例2检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR检测方法最佳退火温度的摸索
1、检测样品的预处理
(1)组织样品处理：取100mg脏器组织样品加入0.5ml灭菌生理盐水并用研磨器进行研磨混悬，组织悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测分析。
(2)泄殖腔或口咽拭子样品处理：将拭子样品加入0.5ml灭菌生理盐水并用涡旋振荡器振荡混悬，样品悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。
2、样品总RNA的提取
参照Trizol RNA提取试剂盒(Invitrogen)说明书进行提取。
3、反转录为cDNA
在0.2ml离心管内加入下列成分：RNA溶液4μl，随机引物1μl，轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反应缓冲液4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制剂1μl，反转录酶0.5μl，DEPC处理水7.5μl，轻轻混匀，37℃作用1h，得到样本cDNA。
4、PCR检测
利用实施例1最终确定的引物对进行聚合酶链式反应(PCR)，设计不同的退火温度梯度(55℃、56℃、57℃、58℃和59℃)对IBV进行RT-PCR。
在0.2ml离心管中加入下列成分：
轻轻混匀后，以不同的退火温度分别进行如下反应：94℃预变性5min，94℃45s，(55℃、56℃、57℃、58℃和59℃)45s，72℃50s，进行30个循环，循环结束72℃延伸10min。
PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe。取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为20-30分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带则证明为传染性支气管炎病毒检测阳性，否则为传染性支气管炎病毒检测阴性。
电泳结果如图2所示，57℃为扩增目的条带最亮，结合退火温度过高不利于引物与模板结合，所以选择该温度为最佳温度。
实施例3检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR检测方法最佳循环数摸索
检测样品的预处理、样品总RNA的提取、反转录为cDNA参见实施例2对应的方法。利用实施例1和2确定的条件，设计6个不同的循环数(28、29、30、31、32和33)对IBV进行RT-PCR。
轻轻混匀后，以不同的循环数分别进行如下反应：94℃预变性5min，94℃45s，57℃45s，72℃50s，进行不同的循环个数(28、29、30、31、32和33)，循环结束72℃延伸10min。电泳结果如图3所示，30个循环数扩增目的条带条带与更多循环数亮度相似，且没有非特异性杂带，能节省时间、提高检测效率，因此选择其为最佳循环数。
实施例4检测不同基因型传染性支气管炎病毒的RT-PCR检测方法的建立
检测样品的预处理、样品总RNA的提取、反转录为cDNA参见实施例2对应的方法。
采用下列反应程序：起始变性94℃5min，30个循环(94℃45s，57℃45s，72℃50s)，最后经过72℃10min延伸，PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe，取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为20-30min，电泳结束后将凝胶块置于紫外凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带长度为830bp则证明待测样品为IBV检测阳性，否则为检测阴性。
利用上述方法分别对不同基因型(图4所示)IBV进行检测，结果均有较好的检出，如图5所示，表明本方法具有良好的通用性。
实施例5检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR检测方法的敏感性检测
按照实施例4建立的方法进行。
将cDNA溶液进行10倍系列稀释，稀释度为10、102、103、104和105倍，分别以稀释后的模板按如下体系进行PCR反应。
在0.2ml离心管中加入下列成分：
轻轻混匀后，进行如下反应：94℃预变性5min，94℃45s，57℃45s，72℃50s，进行30个循环，循环结束72℃延伸10min。
利用上述方法分别对传染性支气管炎病毒进行检测，结果显示对反转录的传染性支气管炎病毒cDNA稀释105倍后，仍能检测到病毒DNA，如图3所示，表明本方法具有良好的敏感性。
实施例6检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR检测方法对禽常见病病原的特异性检测
1、利用实施例4建立方法对其它常见的禽病病原：禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒和禽传染性喉气管炎病毒进行检测，结果如图4所示，结果显示，除阳性对照外，其他实验对象皆为阴性，表明本方法在检测禽类常见的其他病原体过程中，实施例4建立的方法针对不同基因型IBV具有良好的特异性。
2、本发明方法与现有技术方法的比较
根据中华人民共和国国家标准(GB/T 23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术)中推荐的检测IBV的通用引物序列，如下：
IB-3'-290-F：GGAAGATAGGCATGTAGCTT
IB-3'-290-R：CTAACTCTATACTAGCCTAT
IB-M-740-F：CCTAAGAACGGTTGGAAT
IB-M-740-R：TACTCTCTACACACACAC
进行检测实验，发现如下不足：(1)上述引物仅能检测到稀释104倍后的IBV cDNA，其敏感性低于本发明引物(105倍)。如图8所示。(2)上述国标中使用的反转录酶为AMV，比本发明引物使用的反转录酶M-MLV贵5倍，无疑提高了检测成本；(3)上述国标中使用两对引物进行双重PCR，操作比本发明方法复杂，成本高。可见与现有技术相比，本发明引物特异度强、灵敏度高，使用本发明方法进行IBV检测，操作更加简便、成本显著降低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用性引物对，其特征在于，所述引物对的靶基因为传染性支气管炎病毒N基因的保守序列。
2.一种用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用性引物对，其特征在于，其核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1-2所示的序列。
3.权利要求1或2所述通用性引物对在制备检测传染性支气管炎病毒试剂盒中的应用。
4.含有权利要求1或2所述通用性引物对的检测试剂。
5.含有权利要求1或2所述通用性引物对的试剂盒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：94℃5min；94℃45s，57℃45s，72℃50s，30个循环；72℃10min。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，对待测样本进行RT-PCR检测后，扩增产物若有830bp大小的条带，则待测样本中含有传染性支气管炎病毒。
8.一种检测传染性支气管炎病毒的非诊断目的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA，反转录，得到cDNA；
(2)利用权利要求1或2所述通用性引物对对步骤(1)的cDNA进行PCR扩增，根据扩增结果判断待测样本中是否有传染性支气管炎病毒。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中阳性样本扩增的目的片段为830bp。
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