CN109338016A

CN109338016A - 拉沙病毒快速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合

Info

Publication number: CN109338016A
Application number: CN201811315478.8A
Authority: CN
Inventors: 陈�峰; 吴海磊; 杨庆贵; 杨国平
Original assignee: Nantong International Travel Health Care Clinic
Current assignee: Nantong International Travel Health Care Clinic
Priority date: 2018-11-06
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2019-02-15

Abstract

本发明公开一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合，所述的试剂盒，包括扩增试剂和对照试剂，所述的扩增试剂由混合含RT‑PCR反应液的检测试剂和16孔微流控芯片组成；所述的对照试剂包含阴性对照和阳性对照；所述的检测试剂成分为Buffer，2.0mM dNTPs，1U/μL Taq DNA聚合酶，2U/μL M‑MLV反转录酶、0.3U/μLRRI和拉沙病毒及内标基因检测引物探针。其解决现有技术中呼拉沙病毒检测灵敏度低、检测周期长、检测通量低的问题。

Description

拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及拉沙病毒检测试剂盒，具体涉及一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合。

背景技术

拉沙热病原为沙状病毒科的一种，是单链核糖核酸(RNA)病毒，拉沙热病毒是沙粒病毒科沙粒病毒属成员。病毒颗粒从圆形到多形，有囊膜，病毒包膜表面有"T"型突起，长度7-10nm，由病毒糖蛋白组成。病毒基因组RNA以环状核衣壳的形式存在于病毒粒子中，长度在400nm-1300nm之间。病毒粒子内部通常含有电子致密颗粒，在电镜下呈沙粒状红色，沙粒病毒就是因此而得名的，其电子致密颗粒是宿主的核糖体组分。

80％左右的人感染为无症状，其余病例为严重的多系统疾病，病毒侵袭身体的若干器官，如肝、脾和肾，拉沙热的潜伏期为6-21天。该病通常为渐进性发病，开始时出现发烧、全身虚弱和不适。几天后可能出现头痛、喉咙痛、肌肉疼痛、胸痛、恶心、呕吐、腹泻、咳嗽以及腹痛。严重者可发展到出现脸部肿胀，胸腔积水，口、鼻、阴道或胃肠道出血，以及低血压。也可能出现蛋白尿。晚期可见休克、癫痫发作、震颤、定向障碍和昏迷。25％的患者出现耳聋、其中半数在1-3个月后恢复某些功能。在恢复期间可出现短暂脱发和步履不稳。对于其发病率和死亡率，一些研究表明，在整个西非每年发生30万至50万拉沙热病例和5000人死亡。总病死率为1％，但在住院患者中最高达15％。致命病例发病14天内通常发生死亡。该病在妊娠后期尤其严重，在妊娠末3个月期间超过80％的病例发生孕产妇死亡和(或)胎儿死亡。

由于拉沙热的症状如此各不相同和非特异性，往往难以进行临床诊断，尤其在病程初期。拉沙热很难与引起发烧的许多其它疾病区分，包括疟疾、志贺菌病、伤寒、黄热病和其它病毒性出血热。

发明内容

本发明的目的是提供一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合，其解决现有技术中呼拉沙病毒检测灵敏度低、检测周期长、检测通量低的问题。

为了实现上述目的，发明的技术方案如下：一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒，包括扩增试剂和对照试剂，所述的扩增试剂由混合含RT-PCR反应液的检测试剂和16孔微流控芯片组成；所述的对照试剂包含阴性对照和阳性对照；

所述的检测试剂成分为Buffer，2.0mM dNTPs，1U/μL Taq DNA聚合酶，2U/μL M-MLV反转录酶、0.3U/μLRRI和拉沙病毒及内标基因检测引物探针。

进一步的，所述的Buffer包括10mM Tris-HCl，15mM KCl，3.5mM MgCl₂。

再进一步的，所述的Taq DNA聚合酶选自Ex Taq HS、Platinum II Taq HS DNApolymerase、AmpliTaq Gold DNA polymerase中的任意一种；所述的反转录酶选自PrimerScript II RTase、PrimerScript RTase、Superscript IV中的任意一种。

基于上述试剂盒，本发明公开一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，

拉沙病毒和内标基因检测引物和探针的具体序列和序号如下：

拉沙病毒上游引物F：TGCTCTCAAAACYGATGYGTTCA SEQ ID NO.1

拉沙病毒下游引物R：GARATAACCCCTCACTGTGCA SEQ ID NO.2

拉沙病毒探针P：5’-荧光报告基团-CCTCCTGACACTGCTGCRTCAAACAT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.3

内参基因β-actin基因上游引物F：CGAGCGCGGCTACAGCT SEQ ID NO.4

内参基因β-actin基因下游引物R：TCCTTAATGTCACGCACGATTT SEQ ID NO.5

内参基因β-actin基因探针P：5’-荧光报告基团-ACCACCACGGCCGAGCGG-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.6。

进一步的，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY3、CY5荧光报告基团，所述的荧光淬基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB荧光淬灭基团。

再进一步的，拉沙病毒和内标基因5’端分别标记FAM和CY5荧光素，3’端分别标记BHQ1和BHQ2荧光素。

进一步的，每个芯片反应孔内目标病原体检测引物探针浓度比例为500nM～1200nM：300nM～600nM。

进一步优选的，每个芯片反应孔内目标病原体检测引物探针浓度比例为800nM：400nM。

进一步的，内参基因引物探针浓度比例为200nM～500nM：100nM～300nM。

进一步优选的，内参基因引物探针浓度比例为400nM：200nM。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、快速便捷，扩增试剂采用Premix形式，扩增时仅需加入8ul的扩增反应液和2ul核酸模板，扩增结束后根据有无荧光信号判断是否有相应病原体感染。

2、准确性好、灵敏度高，采用taqman探针法荧光定量PCR检测，保证检测结果的可靠性；TaqDNA聚合酶采用化学修饰，具有快速延伸的特性，低温时无任何DNA聚合酶活性，避免非特异性扩增，检测灵敏度高，最低检测限为10²copies/mL。

3、即时的现场检测，采用本发明所述的扩增试剂结合特定的快速实时荧光PCR仪器可实现拉沙病毒的现场检测。

本发明试剂盒采用扩增试剂混合MIX形式，结合快速微流控实时荧光PCR扩增仪进行现场扩增检测，解决了口岸突发呼吸道传染病应急过程中对传染病的及时控制和消除，防止突发呼吸道传染病进一步扩散，有效开展突发传染病感染卫生防控工作，为国境安全保驾护航。

附图说明

图1为试剂盒检测拉沙病毒灵敏度结果；

图2为拉沙病毒引物浓度优化结果；

图3为拉沙病毒探针浓度优化结果；

图4为拉沙病毒精密度结果；

图5为拉沙病毒特异性结果；

图6为微流控芯片PCR仪器运行程序界面图。

具体实施方式

本发明公开一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒及其引物、探针组合。所述的检测试剂盒由微流体芯片和RT-PCR反应液组成。其中，微流体芯片含有16个反应孔，可同时检测16人份或者进行16个不同项目检测；RT-PCR反应液采用试剂premix形式，由Buffer、Mg²⁺、dNTPs、taq DNA聚合酶、反转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂RRI和拉沙病毒引物探针及(人)内标基因引物探针构成。所述的Taq DNA聚合酶和反转录酶M-MLV分别具有快速聚合延伸和快速反转录的功能；所述的拉沙病毒和内标检测探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。利用本发明所述的试剂盒可对口岸入境疑似感染拉沙热病人的快速检测，具有即时快速、灵敏度高、方便快捷等优点。

以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

实施例1扩增体系优化，以甲型流感病毒为例

一、引物浓度优化

PCR体系中，引物浓度过高可能会引发错配，导致非特异扩增，而浓度过低时，会影响PCR产物的生成，因此有必要对引物浓度进行优化。在实验中，我们设置了3个不同引物浓度，用质粒菌(1×10⁵Copies/mL和1×10³Copies/mL)及阴性对照作为检测样本，模板用量为3μL，每个反应体系终体积均为10μL，检测不同浓度的扩增差异。当引物浓度低时，扩增效率稍差，而且荧光响应强度也较低。当拉沙病毒引物(10μmol/L)用量为1.0μL以上时，其扩增效率无显著差异。综合考虑，选用1000nmol/L作为引物终浓度。

表2-1拉沙病毒引物浓度的确定

二、探针浓度优化

荧光探针是整个定量PCR体系的核心，直接影响着荧光PCR检测结果的好坏。在实验中共设置了三个浓度进行比较。用拉沙病毒质粒菌(1×10⁵Copies/ml和1×10³Copies/ml)及阴性对照作为检测样本，模板用量为3μL，每个反应体系终体积均为10μL。实验结果见下表3-1，不同的探针浓度对Ct值和荧光高度有影响，当拉沙病毒荧光探针(10μmol/L)用量为0.5μL时整体能达到理想的试验效果。

表2-2拉沙病毒探针浓度的确定

三、热启动Taq酶用量的优化

热启动Taq酶是PCR反应中的重要成份，其用量多少直接影响到PCR的扩增效率，因此本次实验配制了4种不同热启动Taq酶用量的PCR反应液，热启动Taq酶用量分别是0.5U/人份，0.75U/人份，1.0U/人份，1.25U/人份；用拉沙病毒目的基因片段质粒菌(1×10⁵Copies/mL和1×10³Copies/mL)和阴性对照作为检测样本，模板用量为2μL,每个反应体系终体积均为10μL。实验结果表明，适当增加热启动Taq酶的用量有利于PCR扩增检测，每个体系中加入0.75U/人份体系热启动Taq酶就能达到较为理想的扩增效果，见表2-3。

表2-3热启动Taq酶用量对拉沙病毒扩增效率的影响

四、反转录酶M-MLV用量优化

逆转录酶(M-MLV)用量多少直接影响到转录效率。因此本实验配制了4种不同M-MLV用量的PCR反应液，M-MLV用量分别是10U/人份，15U/人份，20U/人份，25U/人份；用拉沙病毒质粒菌(1×10⁵Copies/ml和1×10³Copies/ml)和阴性对照作为检测样本，模板用量为2μl，每个反应体系终体积均为10μl。实验结果表明，适当增加M-MLV的用量有利于PCR扩增检测，每个体系中加入15U/人份体系M-MLV就能达到较为理想的扩增效果，见表2-4。

表2-4 M-MLV用量对拉沙病毒扩增效率的影响

五、RNA酶抑制剂用量的优化

RNA酶抑制剂(RI)用量多少直接影响到RNA的稳定性。因此本实验配制了4种不同RI用量的PCR反应液，RI用量分别是1U/人份，2U/人份，3U/人份，4U/人份；用拉沙病毒质粒菌(1×10⁵Copies/ml和1×10³Copies/ml)和阴性对照作为检测样本，模板用量为2μl，每个反应体系终体积均为10μl。实验结果表明，适当增加RRI的用量有利于PCR扩增检测，每个体系中加入2U/人份体系RRI就能达到较为理想的扩增效果，见表2-5。

表2-5 RRI用量对拉沙病毒扩增效率的影响

六、特异性实验

用拉沙病毒检测试剂盒检测1例甲型流感病毒样本、1例乙型流感病毒样本、1例副流感病毒样本、1例腺病毒样本、1例拉沙热血清样本和1例黄热病毒血清，结果如图5所示，仅拉沙热血清检测阳性，其余样本均为阴性，内参扩增正常，阴阳性对照符合质控标准，表明试剂盒特异性好。

实施例2拉沙病毒检测操作规范

一、核酸提取

1.1核酸提取：试剂盒配套DNA/RNA一步裂解提取试剂，采用200μL血清样本加入50ul裂解液，95℃2min后5000RPM离心2min，取50μL上清作为模板，具体提取步骤请参照相应提取试剂盒说明书。

二、试剂准备

2.1将扩增试剂室温下溶解后，根据待检样品数量(n)，按照(n+2)数目配制扩增试剂，每人分8μL，阴阳性对照试剂，于室温融化后简短离心；

2.2将上述16孔芯片版移至样本处理区。

三、加样

用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本上清2μL分别加到装有PCR反应液的16孔PCR反应微孔板的加样孔中；

四、扩增检测

4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测，；

4.2循环参数设定：(ultra-fast labchip realtime PCR G2-4，South Korea)：

4.3选择FAM和CY5通道进行荧光检测

五、质控标准

5.1阴性对照：结果为阴性；

5.2阳性对照：结果为阳性，阳性对照Ct值≤38；

5.3以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行；

以上显示和描述了发明的基本原理、主要特征和发明的优点。本行业的技术人员应该了解，发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是发明的原理，在不脱离发明精神和范围的前提下发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的发明的范围内。发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110> 南通国际旅行卫生保健门诊部

<120> 拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctctcaaa acygatgcgt tca 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagataaccc ctcactgtgc a 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctcctgaca ctgctgcrtc aaacat 26

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgagcgcggc tacagct 17

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccttaatgt cacgcacgat tt 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accaccacgg ccgagcgg 18

Claims

1.一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括扩增试剂和对照试剂，所述的扩增试剂由混合含RT-PCR反应液的检测试剂和16孔微流控芯片组成；所述的对照试剂包含阴性对照和阳性对照；

2.根据权利要求1所述的一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的Buffer包括10mM Tris-HCl，15mM KCl，3.5mM MgCl₂。

3.根据权利要求1所述的一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的Taq DNA聚合酶选自Ex Taq HS、Platinum II Taq HS DNA polymerase、AmpliTaq GoldDNA polymerase中的任意一种；所述的反转录酶选自PrimerScript II RTase、PrimerScript RTase、Superscript IV中的任意一种。

4.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：

拉沙病毒上游引物F：TGCTCTCAAAACYGATGYGTTCA SEQ ID NO.1

拉沙病毒下游引物R：GARATAACCCCTCACTGTGCA SEQ ID NO.2

拉沙病毒探针P：5’-荧光报告基团-CCTCCTGACACTGCTGCRTCAAACAT-荧光淬基团-3’SEQID NO.3

内参基因β-actin基因上游引物F：CGAGCGCGGCTACAGCT SEQ ID NO.4

内参基因β-actin基因下游引物R：TCCTTAATGTCACGCACGATTT SEQ ID NO.5

5.根据权利要求4中所述的一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY3、CY5荧光报告基团，所述的荧光淬基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB荧光淬灭基团。

6.根据权利要求5中所述的一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：拉沙病毒和内标基因5’端分别标记FAM和CY5荧光素，3’端分别标记BHQ1和BHQ2荧光素。

7.根据权利要求4中所述的一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：每个芯片反应孔内目标病原体检测引物探针浓度比例为500nM～1200nM：300nM～600nM。

8.根据权利要求7中所述的一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：每个芯片反应孔内目标病原体检测引物探针浓度比例为800nM：400nM。

9.根据权利要求4中所述的一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：内参基因引物探针浓度比例为200nM～500nM：100nM～300nM。

10.根据权利要求9中所述的一种拉沙病毒快速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：内参基因引物探针浓度比例为400nM：200nM。