CN109355433A

CN109355433A - 一种汉坦病毒极速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合

Info

Publication number: CN109355433A
Application number: CN201811415370.6A
Authority: CN
Inventors: 陈�峰; 杨庆贵; 杨国平; 唐晓宇
Original assignee: Nantong International Travel Health Care Clinic
Current assignee: Nantong International Travel Health Care Clinic
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2019-02-19

Abstract

本发明涉及一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合，该汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒，包括提取试剂、扩增试剂和对照试剂；所述的提取试剂由十二烷基肌氨酸钠|月桂酰基肌氨酸钠NLS[(W/V)NLS]、二硫苏糖醇DTT、TE缓冲液、NP‑40表面活性剂组成；所述的扩增试剂包括混合汉坦病毒RT‑PCR反应液和16孔微流控芯片的检测试剂；所述的对照试剂包含阴性对照和阳性对照；所述的检测试剂包括成分为RT‑PCR反应液，成分为Buffer，2.0mM dNTPs，1U/μL Taq DNA聚合酶，2U/μL M‑MLV反转录酶、0.3U/μLRRI和汉坦病毒及人内标基因检测引物探针；所述的阴性对照包括DEPC水，所述的阳性对照包括含目的基因片段的人工构建假病毒。

Description

一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合

技术领域

本发明公开一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合，属于生物技术应用领域。

背景技术

汉坦病毒归属布尼亚病毒科，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，基因组包括L、M、 S3个片段，分别编码L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核蛋白。

汉坦病毒有两种:一种引起汉坦病毒肺综合征(HPS)，另一种引起汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)。前者主要流行于美国，在阿根廷、巴西、巴拉圭、玻利维亚以及德国也发现了病例。主要临床表现为，在4日左右的发热、头痛等前驱期症状后，出现以非心源性肺水肿和高病死率(52.4％～78.0％)为特征的急性呼吸衰竭，重症3～7日死亡，生存者则很快恢复，无后遗症。后者即中国常见的肾综合征出血热，对其进行的分子生物学研究再一次证明其发病机制主要是病毒的直接致病作用，肾脏是早期原发性损伤器官，病毒是肾损伤的直接因素。

近年来随着中国“一带一路”战略的实施，越来越多的新发病原体被检测，给口岸检验检疫机构预防和监控造成极大的困难，带来了很大的经济损失及社会危害。

发明内容

本发明的目的是提供一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合，来解决现有技术中汉坦病毒检测灵敏度低、检测周期长、检测通量低的问题。

为了实现上述目的，发明的技术方案如下：本发明公开了一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒，包括提取试剂、扩增试剂和对照试剂；所述的提取试剂由十二烷基肌氨酸钠|月桂酰基肌氨酸钠NLS[(W/V)NLS]、二硫苏糖醇DTT、TE缓冲液、NP-40表面活性剂组成；所述的扩增试剂包括混合汉坦病毒RT-PCR反应液和16孔微流控芯片的检测试剂；所述的对照试剂包含阴性对照和阳性对照；

所述的检测试剂包括成分为RT-PCR反应液，成分为Buffer，2.0mM dNTPs，1U/μLTaq DNA聚合酶，2U/μL M-MLV反转录酶、0.3U/μLRRI和汉坦病毒及人内标基因检测引物探针；

所述的阴性对照包括DEPC水，所述的阳性对照包括含目的基因片段的人工构建假病毒。

优选的，所述的Buffer包括10mM Tris-HCl，15mM KCl，3.5mM MgCl₂。

优选的，所述的提取试剂包括0.1％～1.0％(W/V)NLS、300mM～800mM DTT、1×TE、1％NP-40。

优选的，所述的Taq DNA聚合酶选自Ex Taq HS、Platinum II Taq HS DNApolymerase、 AmpliTaq Gold DNA polymerase中的任意一种。

优选的，所述的反转录酶选自PrimerScript II RTase、PrimerScript RTase、Superscript IV 中的任意一种。

一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，汉坦病毒和人内标基因检测引物探针的具体序列和序号如下：

汉坦病毒上游引物F：AGATACAGCAGCAGTTAGCCTC SEQ ID NO.1

汉坦病毒下游引物R：ACTTTCCAGTCTCTGCGC SEQ ID NO.2

汉坦病毒探针P：5’-荧光报告基团-CAGGGACTACTTACGGCAGCGGCA-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.3

人内参基因β-actin基因上游引物F：CGAGCGCGGCTACAGCT SEQ ID NO.4

人内参基因β-actin基因下游引物R：TCCTTAATGTCACGCACGATTT SEQ ID NO.5

人内参基因β-actin基因探针P：5’-荧光报告基团-ACCACCACGGCCGAGCGG-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.6

进一步的，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY3、CY5荧光报告基团，所述的荧光淬基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB荧光淬灭基团。

进一步的，汉坦病毒和人内标基因5’端分别标记FAM和CY5荧光素，3’端分别标记BHQ1 和BHQ2荧光素。

优选的，每个芯片反应孔内目标病原体检测引物探针浓度比例为500nM～1200nM：300nM～600nM；进一步优选的，每个芯片反应孔内目标病原体检测引物探针浓度比例为800nM： 400nM。

优选的，内参基因引物探针浓度比例为200nM～500nM：100nM～300nM；进一步优选的，内参基因引物探针浓度比例为400nM：200nM。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、可用于疫情的现场检测，配套加热离心一体机、微流体PCR扩增仪即可完成病原体现场检测，整个检测时间不超过30min；

2、准确性好、灵敏度高，采用taqman探针法荧光定量PCR检测，保证检测结果的可靠性；TaqDNA聚合酶采用化学修饰，具有极速延伸的特性，低温时无任何DNA聚合酶活性，避免非特异性扩增，检测灵敏度高，最低检测限为10²copies/mL。

3、方便快捷，扩增试剂采用Premix形式，扩增时仅需加入8ul的扩增反应液和2μL核酸模板，扩增结束后根据有无荧光信号判断是否有相应病原体感染。本发明试剂盒采用扩增试剂混合MIX形式，结合极速微流控实时荧光PCR扩增仪进行现场扩增检测，传染病进一步扩散，有效开展突发传染病感染卫生防控工作，为国境安全保驾护航。

附图说明

图1为试剂盒检测汉坦病毒灵敏度结果；

图2为汉坦病毒引物浓度优化结果；

图3为汉坦病毒探针浓度优化结果；

图4为汉坦病毒精密度结果；

图5为汉坦病毒特异性结果；

图6为微流控芯片PCR仪器运行程序界面图。

具体实施方式

本发明的一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合。其检测试剂盒由快速核酸提取液、微流体芯片和汉坦病毒RT-PCR反应液组成，其中，快速核酸提取液由NLS、 DTT、TE、NP-40等组分构成；微流体芯片含有16个反应孔，可同时检测16人份；汉坦病毒 RT-PCR反应液采用试剂premix形式，由Buffer、Mg²⁺、dNTPs、taq DNA聚合酶、反转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂RRI和汉坦病毒引物探针及人内标基因引物探针构成。其中，Taq DNA聚合酶和反转录酶M-MLV分别具有极速聚合延伸和极速反转录的功能；汉坦病毒和内标检测探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。利用本发明的试剂盒可对汉坦病毒的现场监测和疫病暴发区的疫情监控与排查，具有即时极速、灵敏度高、方便快捷的优点。

以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

实施例1扩增体系优化，以甲型流感病毒为例

一、引物浓度优化

PCR体系中，引物浓度过高可能会引发错配，导致非特异扩增，而浓度过低时，会影响 PCR产物的生成，因此有必要对引物浓度进行优化。在实验中，我们设置了3个不同引物浓度，用质粒菌(1×10⁵Copies/mL和1×10³Copies/mL)及阴性对照作为检测样本，模板用量为 2μL，每个反应体系终体积均为10μL，检测不同浓度的扩增差异。当引物浓度低时，扩增效率稍差，而且荧光响应强度也较低。当汉坦病毒引物(10μmol/L)用量为1.0μL以上时，其扩增效率无显著差异。综合考虑，选用1000nmol/L作为引物终浓度。

表2-1汉坦病毒引物浓度的确定

二、探针浓度优化

荧光探针是整个定量PCR体系的核心，直接影响着荧光PCR检测结果的好坏。在实验中共设置了三个浓度进行比较。用汉坦病毒质粒菌(1×10⁵Copies/ml和1×10³Copies/ml)及阴性对照作为检测样本，模板用量为3μL，每个反应体系终体积均为10μL。实验结果见下表 3-1，不同的探针浓度对Ct值和荧光高度有影响，当汉坦病毒荧光探针(10μmol/L)用量为 0.5μL时整体能达到理想的试验效果。

表2-2汉坦病毒探针浓度的确定

三、热启动Taq酶用量的优化

热启动Taq酶是PCR反应中的重要成份，其用量多少直接影响到PCR的扩增效率，因此本次实验配制了4种不同热启动Taq酶用量的PCR反应液，热启动Taq酶用量分别是0.5U/人份，0.75U/人份，1.0U/人份，1.25U/人份；用汉坦病毒目的基因片段质粒菌(1×10⁵Copies/mL 和1×10³Copies/mL)和阴性对照作为检测样本，模板用量为2μL,每个反应体系终体积均为 10μL。实验结果表明，适当增加热启动Taq酶的用量有利于PCR扩增检测，每个体系中加入 0.75U/人份体系热启动Taq酶就能达到较为理想的扩增效果，见表2-3。

表2-3热启动Taq酶用量对汉坦病毒扩增效率的影响

四、反转录酶M-MLV用量优化

逆转录酶(M-MLV)用量多少直接影响到转录效率。因此本实验配制了4种不同M-MLV 用量的PCR反应液，M-MLV用量分别是10U/人份，15U/人份，20U/人份，25U/人份；用汉坦病毒质粒菌(1×10⁵Copies/ml和1×10³Copies/ml)和阴性对照作为检测样本，模板用量为2μl，每个反应体系终体积均为10μl。实验结果表明，适当增加M-MLV的用量有利于PCR扩增检测，每个体系中加入15U/人份体系M-MLV就能达到较为理想的扩增效果，见表2-4。

表2-4M-MLV用量对汉坦病毒扩增效率的影响

五、RNA酶抑制剂用量的优化

RNA酶抑制剂(RI)用量多少直接影响到RNA的稳定性。因此本实验配制了4种不同RI用量的PCR反应液，RI用量分别是1U/人份，2U/人份，3U/人份，4U/人份；用汉坦病毒质粒菌(1×10⁵Copies/ml和1×10³Copies/ml)和阴性对照作为检测样本，模板用量为2μl，每个反应体系终体积均为10μl。实验结果表明，适当增加RRI的用量有利于PCR扩增检测，每个体系中加入2U/人份体系RRI就能达到较为理想的扩增效果，见表2-5。

表2-5RRI用量对汉坦病毒扩增效率的影响

六、特异性实验

用汉坦病毒检测试剂盒检测1例甲型流感病毒样本、1例乙型流感病毒样本、1例副流感病毒样本、1例腺病毒样本、1例拉沙热血清样本和1例黄热病毒血清，结果如图5所示，内参扩增正常，阴阳性对照符合质控标准，所有样本扩增结果均为汉坦病毒阴性，表明试剂盒特异性好。

实施例2汉坦病毒检测操作规范一、核酸提取

1.1核酸提取：试剂盒配套DNA/RNA一步裂解提取试剂，采用200μL血清样本加入50ul 裂解液，95℃2min后5000 RPM离心2min，取50μL上清作为模板，具体提取步骤请参照相应提取试剂盒说明书。

二、试剂准备

2.1将扩增试剂室温下溶解后，根据待检样品数量(n)，按照(n+2)数目配制扩增试剂，每人分8μL，阴阳性对照试剂，于室温融化后简短离心；

2.2将上述16孔芯片版移至样本处理区。

三、加样

用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本上清2μL分别加到装有PCR反应液的16孔PCR 反应微孔板的加样孔中；

四、扩增检测

4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测，；

4.2循环参数设定：(ultra-fast labchip realtime PCR G2-4，South Korea)：

4.3选择FAM和CY5通道进行荧光检测

五、质控标准

5.1阴性对照：结果为阴性；

5.2阳性对照：结果为阳性，阳性对照Ct值≤38；

5.3以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行；

以上显示和描述了发明的基本原理、主要特征和发明的优点。本行业的技术人员应该了解，发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是发明的原理，在不脱离发明精神和范围的前提下发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的发明的范围内。发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110>南通国际旅行卫生保健门诊部

<120>汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合

<140>

<141>

<160>6

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测汉坦病毒正向引物序列

<400>1

agatacagcagcagttagcctc

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测汉坦病毒反向引物序列

<400>2

actttccagtctctgcgc

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测汉坦病毒寡核苷酸探针序列

<400>3

cagggactacttacggcagcggca

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测人内参基因β-actin基因正向引物

<400>4

cgagcgcggctacagct

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测人内参基因β-actin基因反向引物

<400>5

tccttaatgtcacgcacgattt

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于检测人内参基因β-actin基因寡核苷酸探针

<400>6

accaccacggccgagcgg 。

序列表

<110> 南通国际旅行卫生保健门诊部

<120> 一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatacagca gcagttagcc tc 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actttccagt ctctgcgc 18

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagggactac ttacggcagc ggca 24

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgagcgcggc tacagct 17

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccttaatgt cacgcacgat tt 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accaccacgg ccgagcgg 18

Claims

1.一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括提取试剂、扩增试剂和对照试剂；所述的提取试剂由十二烷基肌氨酸钠|月桂酰基肌氨酸钠NLS[(W/V)NLS]、二硫苏糖醇DTT、TE缓冲液、NP-40表面活性剂组成；所述的扩增试剂包括混合汉坦病毒RT-PCR反应液和16孔微流控芯片的检测试剂；所述的对照试剂包含阴性对照和阳性对照；

所述的检测试剂包括成分为RT-PCR反应液，成分为Buffer，2.0mM dNTPs，1U/μL TaqDNA聚合酶，2U/μL M-MLV反转录酶、0.3U/μLRRI和汉坦病毒及人内标基因检测引物探针。

2.根据权利要求1所述的一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的Buffer包括10mM Tris-HCl，15mM KCl，3.5mM MgCl₂。

3.根据权利要求1所述的一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的提取试剂包括0.1％～1.0％(W/V)NLS、300mM～800mM DTT、1×TE、1％NP-40。

4.根据权利要求1所述的一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的Taq DNA聚合酶选自Ex Taq HS、Platinum II Taq HS DNA polymerase、AmpliTaq GoldDNA polymerase中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的一种汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的反转录酶选自PrimerScript II RTase、PrimerScript RTase、Superscript IV中的任意一种。

6.一种根据权利要求1-5中任意一项汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：

所述的汉坦病毒和人内标基因检测引物探针的具体序列和序号如下：

汉坦病毒上游引物F：AGATACAGCAGCAGTTAGCCTC SEQ ID NO.1

汉坦病毒下游引物R：ACTTTCCAGTCTCTGCGC SEQ ID NO.2

汉坦病毒探针P：5’-荧光报告基团-CAGGGACTACTTACGGCAGCGGCA-荧光淬基团-3’SEQID NO.3

人内参基因β-actin基因上游引物F：CGAGCGCGGCTACAGCT SEQ ID NO.4

人内参基因β-actin基因下游引物R：TCCTTAATGTCACGCACGATTT SEQ ID NO.5

人内参基因β-actin基因探针P：5’-荧光报告基团-ACCACCACGGCCGAGCGG-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.6。

7.一种根据权利要求6所述的汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY3、CY5荧光报告基团，所述的荧光淬基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、MGB荧光淬灭基团。

8.一种根据权利要求7所述的汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：所述的汉坦病毒和人内标基因5’端分别标记FAM和CY5荧光素，3’端分别标记BHQ1和BHQ2荧光素。

9.一种根据权利要求8所述的汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：每个芯片反应孔内目标病原体检测引物探针浓度比例为500nM～1200nM：300nM～600nM；内参基因引物探针浓度比例为200nM～500nM：100nM～300nM。

10.一种根据权利要求9所述的汉坦病毒极速荧光PCR检测试剂盒的引物探针组合，其特征在于：每个芯片反应孔内目标病原体检测引物探针浓度比例为800nM：400nM；内参基因引物探针浓度比例为400nM：200nM。