CN108330211A - A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光pcr检测试剂盒及其用途 - Google Patents

A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光pcr检测试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒及其用途，本发明属于核酸检测技术领域。本发明的试剂盒内设有阳性对照、阴性对照以及用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体以及用于质控的内标人actin基因的多种引物及探针的混合物。使用本发明所公开的检测试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测三种引起腹泻的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。

Description

A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试 剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及一种病毒检测试剂盒，特别涉及一种能够同时检测A组轮状病毒，星状病毒以及肠道腺病毒的多重荧光PCR检测试剂盒，属于核酸检测技术领域。
背景技术
腹泻是我国的常见病、多发病，感染的病原主要为病毒等，感染者从倦怠﹑乏力﹑低热等，甚至全身感染，脑﹑脊髓﹑心﹑肝等重要器官受损，可呈现不同的症状，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡。因此对腹泻病原体的快速、准确的诊断十分必要。同时腹泻病原体的种类繁多，给诊断带来巨大挑战。人星状病毒(Human Astrovirus，HAstV)是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷人群腹泻的重要病源之一，在全球范围内广泛存在，既可引起散发性腹泻，也可以引起暴发性腹泻。人腺病毒共有51个血清型，分属A～F 6个亚组。F组又分为腺病毒40型(Ad40)和41型(Ad41)，称为肠道腺病毒(Enteric Adenovirus，EAdV)。EAdV是引起全球婴幼儿急性重症腹泻的重要原因，被认为与幼儿园、学校和医院中散发腹泻和暴发腹泻有关。轮状病毒(Rotavirus，RV)是秋冬季婴幼儿腹泻最常见的病原，位居小儿腹泻第一位(约占40％)。根据病毒外壳抗原可分为A～G 7个不同的组，A组在流行学和疫苗方面最为重要。RV全球范围广泛存在。
目前，临床上常用的腹泻病原体检测方法为试纸条法(酶联免疫吸附法，ELISA)，此法虽然时间短，但是敏感性较低，且受到抗体动力学的影响。荧光核酸PCR技术具有敏感性高，检测快速等优点，预期将会在临床诊断中有广泛的应用。然而，传统的荧光实时PCR每次只能扩增一种病原体的核酸，要准确找出致病病原体需多次尝试，耗费大量的时间和精力，并且对于多种病原体导致的感染无法有效区分。新型的多重实时荧光PCR可以有效弥补单重PCR的这些缺陷，是一种非常有应用前景的诊断方法。
公开号为CN104561376A，发明名称为一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒的专利申请公开了一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，还设有分别用于检测诺瓦病毒G1、诺瓦病毒G2、腺病毒、星状病毒和轮状病毒中一种或多种病毒的多种引物及探针序列的混合物。根据该专利文献所述，5种肠道病原体检测分为两个反应，反应一包括诺瓦病毒G1、诺瓦病毒G2和内对照；反应二包括腺病毒、星状病毒和轮状病毒。因此，该专利申请实则进行了两个三联检测。在进行腺病毒、星状病毒和轮状病毒检测时并没有添加内标，因此无法对样本核酸进行外部控制。此外，该专利申请将Cy5、FAM和YAK荧光素分别标记腺病毒、星状病毒和轮状病毒。Cy5荧光素本身的荧光值较低，在低浓度时会造成荧光值太低被仪器认为是阴性，从而造成腺病毒的假阴性结果。
针对现有技术中的问题，本发明提出了一种能够同时检测A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸的多重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒同时含有检测星状病毒、肠道腺病毒、轮状病毒A组和人内标基因actin的引物以及探针，因此为4联检测试剂盒。本试剂盒添加内标，可对样本进行外部控制，在星状病毒、肠道腺病毒和轮状病毒A组都为阴性的情况下，如果内标也为阴性，说明样本降解或核酸含量较少或存在抑制，需要重新提取核酸或进行纯化处理。本试剂盒选用常用的FAM、HEX和ROX荧光素分别标记星状病毒、肠道腺病毒和轮状病毒A组，能够保证病原体在低浓度时有明显的扩增曲线；将本身荧光值不太高的Cy5标记内标，因actin的浓度一般较高，Cy5有正常的扩增曲线。此外，本发明发明人通过PCR平行对比试验证明，本发明的试剂盒相较于公开号为CN104561376A专利申请所公开的试剂盒具有更优异的检测效果。
发明内容
本发明的目的是解决不同引物/探针之间互相产生交联的问题，提供A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，能够快速、精确、有效的进行测定。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照和阴性对照，该试剂盒内还设有用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体以及用于质控的内标人actin基因的多种引物及探针的混合物；其中，用于A组轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：3所示，荧光标记为ROX；用于星状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：6所示，荧光标记为FAM；用于肠道腺病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：9所示，荧光标记为HEX；用于内标基因检测的引物序列分别为SEQ ID NO：10和SEQID NO：11所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：12所示，荧光标记为Cy5。
进一步的，还含有热启动Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的酶系，以及含有5×RT-PCR buffer，dNTPs和solution I的PCR反应缓冲液。
在本发明所述的多重荧光PCR检测试剂盒中，优选的，所述的阳性对照为含有A组轮状病毒，星状病毒以及肠道腺病毒目的基因片段的质粒菌，所述的阴性对照为细胞培养液。
在本发明所述的多重荧光PCR检测试剂盒中，优选的，用于A组轮状病毒、星状病毒以及肠道腺病毒核酸检测时，各引物最终浓度为0.2μM，各探针最终浓度为0.1μM。逆转录酶的终浓度为2.4U/μL，RNA酶抑制剂的终浓度为0.32U/μL，DNA聚合酶的终浓度为0.1U/μL。
进一步的，本发明还提供了采用上述的试剂盒检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒的方法，包括如下步骤：
(1)按照反应管数，取PCR反应缓冲液、用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体以及用于质控的内标人actin基因的多种引物及探针的混合物和酶系混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，分装备用；
(2)将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的RNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中；
(3)荧光RT-PCR反应条件：50℃保持25min逆转录，95℃保持5min热启动；95℃维持10s变性，55℃维持15s退火，72℃维持30s延伸，预扩增5个循环；95℃维持10s变性，60℃维持45s退火/延伸，采集荧光信号，共进行40个循环；
(4)结果判定：
阴性结果判定：如果样本在FAM通道，HEX/VIC通道和ROX通道扩增曲线均不成S型、Ct值为UNDET或者＞35.00，内标Cy5通道扩增曲线呈S型且结果Ct值<30，则结果为阴性；若内标Cy5通道扩增曲线不呈S型或结果Ct值≥30，则应对样本进行复检；
阳性结果判定：如果样本在FAM通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33，则结果为人星状病毒阳性，如果样本在HEX/VIC通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33，则结果为肠道腺病毒阳性，如果样本在ROX通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33，则结果为A组轮状病毒阳性；
实验灰度区：如果样本在FAM通道、HEX/VIC通道或ROX通道扩增曲线呈S型且35＞Ct值＞33，则结果位于实验灰度区，应对样本进行复检。
其中，质控标准如下：
(1)阴性对照：结果为阴性，内标结果为阳性且Ct值<30；
(2)阳性对照：结果为阳性，阳性对照Ct值≤28；
(3)以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行。
再进一步的，本发明还提出了所述的多重荧光PCR检测试剂盒在制备检测A组轮状病毒，星状病毒以及肠道腺病毒中的一种或多种病原体检测试剂中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明对用于A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒的引物和探针在NCBI的GenBank中进行了Blast验证，证明所设计引物和探针具有良好的特异性，并进行了实样检测，证明了该引物和探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性；另一方面，本发明对反应参数进行了优化，验证了其对A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒的检测检测限和精密度，可实现一次反应同时检测三种引起肠道系统感染的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。
进一步的，本发明试剂盒设计了内标质控体系，内标模板为人看家基因，人体组织细胞中均含有，避免了外源添加，可实现对样本取样、保存以及核酸提取过程进行外部控制。
本发明试剂盒依据RT-PCR和Taqman探针实时荧光PCR技术，针对人星状病毒、肠道腺病毒和A组轮状病毒基因组保守区为靶区域设计特异性引物和探针，人星状病毒、肠道腺病毒和A组轮状病毒通用型探针分别标记FAM、HEX和ROX荧光素，内标探针标记Cy5荧光素，配以逆转录酶、热启动TaqDNA聚合酶等成分，病毒RNA先经逆转录形成cDNA，然后进入PCR扩增，从而对样本中人星状病毒、肠道腺病毒和A组轮状病毒核酸进行定性检测。内标模板为人看家基因，人体组织细胞中均含有，可实现对样本取样、保存以及核酸提取过程进行外部控制。
附图说明
图1为一次检测A组轮状病毒、星状病毒以及肠道腺病毒的PCR扩增曲线；
其中，同种颜色表示同一个反应中的3个扩增曲线，3种病原体都含有从高到低共5个梯度，有扩增曲线表示检测到相应的病原体；
图2为A组轮状病毒的PCR扩增曲线的单独显示，模板从高到低共5个梯度；
图3为星状病毒的PCR扩增曲线的单独显示，模板从高到低共5个梯度；
图4为肠道腺病毒的PCR扩增曲线的单独显示，模板从高到低共5个梯度；
图5为人内标基因acttin的PCR扩增曲线的单独显示，模板浓度为常见的样本浓度；
图6为一次检测A组轮状病毒、星状病毒以及肠道腺病毒的PCR检测结果的ct(ABI7500)值，其中病原体浓度从低(上)到高(下)；
图7为使用本发明的试剂盒检测阳性参考品P1-P10的PCR检测结果；
图8为使用本发明的试剂盒检测阴性参考品N1-N10的PCR检测结果；
图9为使用本发明的试剂盒检测检测限参考品L的PCR检测结果；
图10为使用本发明的试剂盒检测精密度参考品R1和R2的PCR检测结果；
图11为使用本发明的试剂盒的干扰物质验证PCR检测结果；
图12为两种试剂盒的比对结果；
其中1为本发明试剂盒检测结果，2为专利申请CN 104561376 A试剂盒的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒的组装
1)设计引物/探针组合：
根据各个病原体的核酸序列，进行同种间的序列比对以寻找保守区域，并使用Primer Express 3.0软件对这些保守区域进行多重PCR的引物和Taqman探针设计。将所得到的各引物/探针组合在NCBI网站上进行BLAST分析以确保与样本中可能存在的其他微生物不发生交叉反应。最后通过实验验证其性能。内对照的设计采用同样的方法。所设计的各组引物/探针如下表1所示。合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
表1用于扩增A组轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒和人内标基因actin的引物和探针
2)制备各个阳性对照：首先分离各种病原体的核酸，并制备PCR反应体系，然后将各种病原体核酸分别加入反应体系中进行PCR反应。反应产物进行回收并用电泳鉴定。接着使用合适的TA克隆试剂盒(如pGEM-T载体，Promega)获得连接有各目标病原体序列的质粒载体，用来作为PCR反应的阳性对照。
3)制备阴性对照：以细胞培养液为阴性对照，分装即可。
4)HAstV/EAdV/RV-A引物探针混合液：以阳性对照质粒菌为模板，配合不同终浓度的引物和探针进行检测，分析扩增曲线及荧光强度，经试验检测最优组合浓度为引物0.2μM，探针为0.1μM。
5)酶系：以分离各种病原体的核酸的为模板，优化不同浓度的逆转录酶(M-MLV)、RNA酶抑制剂(RI)和热启动酶(Hi.taq)的组合对样本核酸检测的影响，经试验检测确定25μL体系中M-MLV用量为60U，RI用量为8U，Hi.taq用量为2.5U。
6)PCR反应缓冲液：主要为PCR扩增提供缓冲体系和反应底物，配制方案为终浓度1×RT-PCR buffer和0.2mM的dNTPs。
7)试剂盒组装
A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒内设有阳性对照和阴性对照，该试剂盒内还设有PCR反应缓冲液、酶系以及用于检测A组轮状病毒(RV-A)、星状病毒(HAstV)和肠道腺病毒(EAdV)的多种引物及探针的混合物。其中，用于A组轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：3所示，荧光标记为ROX；用于星状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：6所示，荧光标记为FAM；用于肠道腺病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：9所示，荧光标记为HEX；用于人内标基因检测的引物序列分别为SEQ ID NO：10和SEQID NO：11所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：12所示，荧光标记为Cy5。
试剂盒主要组成如下表2所示：
表2试剂盒组成
适用仪器：含FAM、HEX/VIC、ROX和Cy5荧光通道PCR仪，包括ABI7500，SLAN96P。
实施例2分别单独检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒病原体
使用A组轮状病毒阳性样本，采用实施例1制备得到的试剂盒对A组轮状病毒进行检测。
使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN)从A组轮状病毒样本中提取核酸。然后向16μLPCR反应缓冲液中分别加入HAstV/EAdV/RV-A引物探针混合液(2μL)、酶系(2μL)以及样本提取的核酸或阴性/阳性对照试剂(5μL)。各引物最终浓度为0.2μM，各探针最终浓度为0.1μM。25μL体系中M-MLV用量为60U，RI用量为8U，Hi.taq用量为2.5U。随后将各反应管按照以下程序在合适的实时荧光PCR仪(如ABI 7500，Applied Biosystems)上进行PCR反应：50℃保持25min(逆转录)，95℃保持5min(热启动)；95℃维持10s(变性)，55℃维持15s(退火)，72℃维持30s(延伸)，5个循环(预扩增)；95℃维持10s(变性)，60℃维持45s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。
结果判定：
所有阴性结果的信号值都应低于阈值。所有阳性结果信号都应有指数上升且Ct值必须小于33。否则说明扩增不成功。如某种病原体相应的荧光信号产生指数上升，则为阳性，否则为阴性。
质控标准：
1.阴性对照：结果为阴性，内标结果为阳性且Ct值<30。
2.阳性对照：结果为阳性，阳性对照Ct值≤28。
3.以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行。
结果分析：
1.实验结束后，根据相关仪器的软件进行分析，调节噪声容限至基线噪声以上，使阴性对照Ct值不出现任何数值。
2.阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。FAM、HEX/VIC、ROX和Cy5基线选取6～15个循环区域。
3.记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。
参考值：
本发明试剂盒的参考值为Ct值等于33。
检验结果的解释：
1.每次实验均需将试剂盒内的阴性对照、阳性对照与待检样本一同检测，检测结果应符合其性能指标，否则本次实验无效。
2.实验结果判断方法
2.1.阴性结果判定：如果样本在FAM通道，HEX/VIC通道和ROX通道扩增曲线均不成S型、Ct值为UNDET或者＞35.00，内标Cy5通道扩增曲线呈S型且结果Ct值<30，则结果为阴性；若内标Cy5通道扩增曲线不呈S型或结果Ct值≥30，则应对样本进行复检。
2.2.阳性结果判定：如果样本在FAM通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33，则结果为HAstV阳性，如果样本在HEX/VIC通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33，则结果为EAdV阳性，如果样本在ROX通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33，则结果为RV-A阳性。
2.3.实验灰度区：如果样本在FAM通道、HEX/VIC通道或ROX通道扩增曲线呈S型且35＞Ct值＞33，则结果位于实验灰度区，应对样本进行复检。
其余各病原体的检测与上述方法相同。
结果：
使用本发明的试剂盒可特异性检测到A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒病原体。
实施例3一次检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒病原体
1、病毒核酸的提取
使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN)分别从A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒样本中提取病毒核酸。以相同的比例对提取得到的病毒核酸样本进行混合操作，测定最终浓度为5μM。10倍稀释5个梯度，作为模板进行检测。
2、PCR扩增检测：
1)按下列组成配制PCR反应液(n为反应管数)。
PCR反应缓冲液为16μL×n，HAstV/EAdV/RV-A引物探针混合液为2μL×n，酶系为2μL×n。(注意：使用前确保PCR反应缓冲液、HAstV/EAdV/RV-A引物探针混合液充分溶解并混匀，酶系在使用前需离心以确保所有酶集中在底部)。
2)将反应体系按20μL/管分装至PCR反应管中，将装有PCR反应液的反应管移至样本处理区。
3)加样(在样本处理区进行)，用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各5μL分别加到装有PCR反应液的PCR反应管中。盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区。
4)荧光定量PCR扩增(在扩增检测区进行)，将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪(如ABI7500，Applied Biosystems)中进行扩增检测。程序：50℃保持25min(逆转录)，95℃保持5min(热启动)；95℃维持10s(变性)，55℃维持15s(退火)，72℃维持30s(延伸)，5个循环(预扩增)；95℃维持10s(变性)，60℃维持45s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。实验结束后可从仪器上直接读取结果。
5)实验结果判断
同实施例2.
3、结果：
将3种高浓度病原体(A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒)混合，用细胞培养液10倍稀释5个梯度，作为模板进行多重荧光PCR检测。结果如图1-6所示，其中图1为在同一PCR反应中同时检测三种病原体(A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒)，同种颜色表示同一个反应中的3个扩增曲线。3种病原体都含有从高到低共5个梯度。有扩增曲线表示检测到相应的病原体，将图1的结果按照不同检测项目分开显示，结果如图2～5所示。图6为上述检测结果的ct值(ABI7500)，病原体浓度从低(上)到高(下)。
实施例4A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒产品性能分析
1、阳性参考品符合率
以阳性参考品P1～P10作为待检样本，在ABI7500实时荧光定量PCR仪器上进行检测，考查试剂盒阳性参考品符合率。检测结果(见图7)应为相应病毒的阳性，符合率为100％(10/10)。
表3待检阳性参考品样本
2、阴性参考品符合率
以阴性参考品N1～N10作为待检样本，在ABI7500实时荧光定量PCR仪器上进行检测，考查试剂盒阴性参考品符合率。检测结果(见图8)应为阴性，符合率为100％(10/10)。
表4待检阴性参考品样本
3、检测限
以检测限参考品L(1×103PFU/ml)作为待检样本，在ABI7500实时荧光定量PCR仪器上进行检测，检测结果(见图9)应符合以下要求：L重复检测20次，A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒各至少17次检测结果为阳性。
4、精密度
以精密度参考品R1(2×106PFU/ml)和R2(2×103PFU/ml)作为待检样本，在ABI7500实时荧光定量PCR仪器上各重复检测10次进行检测，检测结果(见图10)应符合以下要求：R1和R2检测的轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒Ct值的变异系数(CV)均≤5％。
5、干扰物质的验证
粪便的四分之三是水分，其余大多是蛋白质、无机物、脂肪、未消化的食物纤维、脱了水的消化液残余、以及从肠道脱落的细胞和死掉的细菌，此外还有一些维生素K。为考察样本中可能存在的物质对检测结果的影响，选取了不同表征差异的粪便样本，包括水样粪便、带血粪便和坚硬粪便，正常粪便作为对照，以上样本经检测均为轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒阴性。在上述4份样本中均加入轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒培养混合物至终浓度均为1.0×103PFU/ml，在ABI7500实时荧光定量PCR仪器上进行检测，验证样本中的干扰物质对本试剂盒的PCR反应过程有干扰作用，经检测分析样本中可能存在的物质对检测结果的无影响(见图11)。
综上所诉，本发明试剂盒能够检测并区分人星状病毒、肠道腺病毒和A组轮状病毒，特异性实验证明，与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒无交叉反应。待测样本中可能存在的粪便等物质对本发明试剂盒的检测结果无干扰。检测限不高于1.0×103PFU/ml。检测阳性参考品和阴性参考品符合率为100％；灵敏度参考品重复检测20次，检测结果全部为阳性；精密度参考品重复检测10次，结果Ct值变异系数(CV)≤5％。
实施例5对比实验分析
1、实验分组
实验组：采用本发明实施例1制备得到的试剂盒进行扩增。
对比组：采用现有专利申请(CN 104561376 A)所公开的试剂盒进行扩增。
2、模板
将高浓度的星状病毒、腺病毒、和轮状病毒A组样本进行混合，10倍梯度稀释，用作模板，分别用两种试剂盒提供的方法进行检测。
3、结果
经过检测结果对比发现：两个试剂盒的星状病毒检测结果差异不大；腺病毒的检测，本发明试剂盒的结果优于专利CN 104561376 A，表现在荧光值高，ct值靠前；A组轮状病毒检测，本发明试剂盒的结果优于专利CN 104561376 A，表现在ct值稍微靠前且扩增曲线的线型较好(图12)。综合判断，本发明试剂盒的检测效果优于专利申请CN 104561376 A的试剂盒。
序列表
<110> 南京美宁康诚生物科技有限公司
北京美康生物技术研究中心有限责任公司
<120> A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒及其用途
<130> KLPI161192
<160> 12
<170> PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 1
agtggttgat gctcaagatg ga 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 2
tcattgtaat catattgaat accca 25
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 3
cagcaacaac tgcagcttca aaagaagwgt 30
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 4
gagatccgtg atgytaatgg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 5
tgtcgttrcc agaaaagaar c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 6
tgtyccttty ccttcaggrg trtc 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 7
tgttygaagt tttcgacgty g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 8
saggtagacg gcctcgatg 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 9
cgcatccacc agccscacc 19
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 10
cgagcgcggc tacagct 17
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 11
tccttaatgt cacgcacgat t 21
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 12
accaccacgg ccgagcgg 18

Claims (7)

1.A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光PCR检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照和阴性对照，其特征在于：该试剂盒内还设有用于检测人内标基因actin的引物及探针，以及用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体的多种引物及探针的混合物；其中，用于A组轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：3所示，荧光标记为ROX；用于星状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：6所示，荧光标记为FAM；用于肠道腺病毒检测的引物序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：9所示，荧光标记为HEX；用于人内标基因检测的引物序列分别为SEQ IDNO：10和SEQID NO：11所示，Taqman探针序列为SEQ ID NO：12所示，荧光标记为Cy5。
2.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应缓冲液以及酶系，所述的酶系包括DNA聚合酶、逆转录酶以及RNA酶抑制剂。
3.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为含有A组轮状病毒，星状病毒以及肠道腺病毒目的基因片段的质粒菌，所述的阴性对照为细胞培养液。
4.如权利要求1所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：用于A组轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒和内标actin核酸检测时，各引物最终浓度为0.2μM，各探针最终浓度为0.1μM，逆转录酶的终浓度为2.4U/μL，RNA酶抑制剂的终浓度为0.32U/μL，DNA聚合酶的终浓度为0.1U/μL。
5.如权利要求1-4任一项所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒时，包括如下步骤：
(1)按照反应管数，取PCR反应缓冲液、用于检测A组轮状病毒、星状病毒和肠道腺病毒中一种或多种病原体以及用于质控的内标人actin基因的多种引物及探针的混合物和酶系混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，分装备用；
(2)将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的RNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中；
(3)荧光RT-PCR反应条件：50℃保持25min逆转录，95℃保持5min热启动；95℃维持10s变性，55℃维持15s退火，72℃维持30s延伸，预扩增5个循环；95℃维持10s变性，60℃维持45s退火/延伸，采集荧光信号，共进行40个循环；
(4)结果判定：
阴性结果判定：如果样本在FAM通道，HEX/VIC通道和ROX通道扩增曲线均不成S型、Ct值为UNDET或者＞35.00，内标Cy5通道扩增曲线呈S型且结果Ct值<30，则结果为阴性；若内标Cy5通道扩增曲线不呈S型或结果Ct值≥30，则应对样本进行复检；
阳性结果判定：如果样本在FAM通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33，则结果为人星状病毒阳性，如果样本在HEX/VIC通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33，则结果为肠道腺病毒阳性，如果样本在ROX通道扩增曲线呈S型且Ct值≤33，则结果为A组轮状病毒阳性；
实验灰度区：如果样本在FAM通道、HEX/VIC通道或ROX通道扩增曲线呈S型且35＞Ct值＞33，则结果位于实验灰度区，应对样本进行复检。
6.如权利要求5所述的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于质控标准如下：
(1)阴性对照：结果为阴性，内标结果为阳性且Ct值<30；
(2)阳性对照：结果为阳性，阳性对照Ct值≤28；
(3)以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行。
7.权利要求1-6任一项所述的多重荧光PCR检测试剂盒在制备检测A组轮状病毒，星状病毒以及肠道腺病毒中的一种或多种病原体检测试剂中的用途。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058632A (zh) * 2017-05-23 2017-08-18 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种多重pcr检测三种腹泻病毒用试剂盒及其检测方法
CN109355433A (zh) * 2018-11-26 2019-02-19 南通国际旅行卫生保健门诊部 一种汉坦病毒极速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合
CN109593890A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 深圳市刚竹医疗科技有限公司 检测腹泻病毒的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法
CN114736991A (zh) * 2022-05-18 2022-07-12 圣湘生物科技股份有限公司 一步法检测致泻性病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671746A (zh) * 2009-10-21 2010-03-17 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测a群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列
WO2010037027A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Auburn University Immunization of avians by mucosal administration of non-replicating vectored vaccines
CN101187665B (zh) * 2007-12-27 2011-08-10 北京博晖创新光电技术股份有限公司 一种肠道病毒的免疫荧光层析检测试纸及其制备方法
CN103074450A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法
CN103074449A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法
CN103773897A (zh) * 2014-01-16 2014-05-07 江苏硕世生物科技有限公司 一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN104561376A (zh) * 2014-12-24 2015-04-29 华美生物工程有限公司 一种检测病毒性肠胃炎的多重pcr快速检测试剂盒
CN106191316A (zh) * 2016-07-27 2016-12-07 国家食品安全风险评估中心 多重pcr检测七种腹泻病毒用引物组和试剂盒及其检测方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101187665B (zh) * 2007-12-27 2011-08-10 北京博晖创新光电技术股份有限公司 一种肠道病毒的免疫荧光层析检测试纸及其制备方法
WO2010037027A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Auburn University Immunization of avians by mucosal administration of non-replicating vectored vaccines
CN101671746A (zh) * 2009-10-21 2010-03-17 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测a群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列
CN103074450A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法
CN103074449A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法
CN103773897A (zh) * 2014-01-16 2014-05-07 江苏硕世生物科技有限公司 一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN104561376A (zh) * 2014-12-24 2015-04-29 华美生物工程有限公司 一种检测病毒性肠胃炎的多重pcr快速检测试剂盒
CN106191316A (zh) * 2016-07-27 2016-12-07 国家食品安全风险评估中心 多重pcr检测七种腹泻病毒用引物组和试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU JIE等: ""Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis"", 《JOURNAL OF CLINICAL VIROLOGY》 *
XIAOLI L PANG等: ""Enhanced enteric virus detection in sporadic gastroenteritis using a multi-target real-time PCR panel: a one-year study"", 《JOURNAL OF MEDICAL VIROLOGY》 *
于建华: "《实用临床基础检验》", 31 August 2014, 西安交通大学出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058632A (zh) * 2017-05-23 2017-08-18 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种多重pcr检测三种腹泻病毒用试剂盒及其检测方法
CN109355433A (zh) * 2018-11-26 2019-02-19 南通国际旅行卫生保健门诊部 一种汉坦病毒极速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合
CN109593890A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 深圳市刚竹医疗科技有限公司 检测腹泻病毒的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法
CN114736991A (zh) * 2022-05-18 2022-07-12 圣湘生物科技股份有限公司 一步法检测致泻性病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN114736991B (zh) * 2022-05-18 2023-11-17 圣湘生物科技股份有限公司 一步法检测致泻性病毒的组合物、试剂盒、方法及其用途

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