CN104561376A - 一种检测病毒性肠胃炎的多重pcr快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒。本发明所涉及的检测试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测多种引起病毒性肠胃炎的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒。
背景技术
病毒性胃肠炎也是急性胃肠炎的一种类型。病毒性胃肠炎是由多种病毒引起的急性小肠炎症性病变，多见于婴幼儿，约50%婴幼儿的急性腹泻由病毒所致，成年人的病毒性胃肠炎也不少见。通过食用受污染的食物及水，或者同受感染者的接触传播。引起病毒性胃肠炎的病毒种类很多，如轮状病毒、诺瓦病毒，以及肠腺病毒、嵌杯状病毒、星状病毒等均可导致病毒性胃肠炎。由于食物中毒或尿路感染也会导致肠胃炎或类似症状，因此通过病原体检测及时确诊致病病毒就显得尤为重要。
通常为了确诊是否病原菌感染，需要进行血液和尿液检查。确诊感染后，快速粪便镜检可鉴别诺瓦病毒和轮状病毒感染，但无法鉴别其他病毒；使用酶联免疫附试验或免疫酶斑试验检测粪便上清液中的病毒抗原，具有较高的敏感性和特异性，但所需时间较长；血清学检测，感染后5天，血中可检测出特异性IgM抗体；荧光核酸PCR技术具有敏感性高，检测快速等优点，预期将会在临床诊断中有广泛的应用。然而，传统的荧光实时PCR每次只能扩增一种病原体的核酸，要准确找出致病病原体需多次尝试，耗费大量的时间和精力，并且对于多种病原体导致的感染无法有效区分。新型的多重实时荧光PCR可以有效弥补单重PCR的这些缺陷，是一种非常有应用前景的诊断方法。
要成功实施多重PCR，需要解决几个技术问题： 由于每一种扩增子的最佳扩增条件都不一样，需要协调每个单独反应的条件以保证在单一扩增条件下各扩增子都能进行成功扩增。由于需要使用多组引物/探针组合，不同引物/探针之间互相产生交联的可能性很大，因此在设计时需要考虑消除这一可能性。每组引物/探针不能对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性的结果，影响对疾病的诊断。需要有一定的方法来排除来自于核酸提取方面的问题，这就要求有内对照作为参考。
发明内容
本发明的目的是解决不同引物/探针之间互相产生交联的问题，提供一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒，能够快速、准确的检测出病毒性肠胃炎。
本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，该试剂盒内还设有分别用于检测诺瓦病毒G1、诺瓦病毒G2、腺病毒、星状病毒和轮状病毒中一种或多种病毒的多种引物及探针序列的混合物，其中，用于诺瓦病毒G1检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：1 和 SEQ ID NO：2 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：3，荧光标记为Cy5；用于诺瓦病毒G2检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：4和 SEQ ID NO ：5 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：6，荧光标记为FAM；用于腺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：7和 SEQ ID NO：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：9，荧光标记为Cy5；用于星状病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：10 和 SEQ ID NO：11 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：12，荧光标记为FAM；用于轮状病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：13 和 SEQ ID NO：14 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：15，荧光标记为YAK；所述的内对照为雀麦花叶病毒，用于检测雀麦花叶病毒的引物序列分别为 SEQ ID NO：16和 SEQ ID NO：17，Taqman探针序列为SEQ ID NO：18，荧光标记为YAK。
有益效果
本发明所涉及的检测试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测多种引起病毒性肠胃炎的常见病原体，检测所需时间短，准确性高，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。
具体实施方式
一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，该试剂盒内还设有分别用于检测诺瓦病毒G1、诺瓦病毒G2、腺病毒、星状病毒和轮状病毒中一种或多种病毒的多种引物及探针序列的混合物，其中，用于诺瓦病毒G1检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：1 和 SEQ ID NO：2 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：3，荧光标记为Cy5；用于诺瓦病毒G2检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：4和 SEQ ID NO ：5 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：6，荧光标记为FAM；用于腺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：7和 SEQ ID NO：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：9，荧光标记为Cy5；用于星状病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：10 和 SEQ ID NO：11 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：12，荧光标记为FAM；用于轮状病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：13 和 SEQ ID NO：14 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：15，荧光标记为YAK；所述的内对照为雀麦花叶病毒，用于检测雀麦花叶病毒的引物序列分别为 SEQ ID NO：16和 SEQ ID NO：17，Taqman探针序列为SEQ ID NO：18，荧光标记为YAK。
实施例1
实施例一：检测诺瓦病毒G1：使用诺瓦病毒G1阳性对照作为样本。相应引物/探针组合及阳性对照的获得见实施例二。在提取之前先向样本和阴性对照加入2μl内对照(5μM)。使用MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit(Invitrogen)从样本中提取核酸。然后向TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(Invitrogen, 13.5μl)中分别加入各引物/探针组合(1.5μl)以及从样本或阴性对照提取的核酸(10μl)。样本最终浓度为5μM，引物/探针浓度为0.4μM。随后将各反应管按照以下程序在ABI 7500(Applied Biosystems)实时荧光PCR仪上进行PCR反应：50℃保持15min(逆转录)，95℃保持10min(热启动)；95℃维持8s(变性)，60℃维持34s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。结果可检测到诺瓦病毒G1存在。其余各病原体的检测与实施例1相同。
实施例二：一次检测病毒性肠胃炎5种病原体的检测试剂盒
1）设计引物/探针组合：根据各个病原体的核酸序列，进行同种间的序列比对以寻找保守区域，并使用Beacon Designer 软件对这些保守区域进行多重PCR的引物和Taqman探针设计。将所得到的各引物/探针组合在NCBI网站上进行BLAST分析以确保与样本中可能存在的其他微生物不发生交叉反应。最后通过实验验证其性能。内对照的设计采用同样的方法。
所设计的各组引物/探针如下：
反应一：含雀麦花叶病毒（内对照），诺瓦病毒G1，G2
反应二：含腺病毒，星状病毒和轮状病毒
2）制备各个阳性对照：首先分离5种病原体的核酸，并制备PCR反应体系，然后将5种病原体核酸分别加入反应体系中进行PCR反应。反应产物进行回收并用电泳鉴定。接着使用合适的TA克隆试剂盒（如TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with TOP10 E. Coli，Invitrogen)和质粒纯化试剂盒(如PureLink 96 Plasmid Purification System，Invitrogen)获得连接有各目标病原体序列的质粒载体，用来作为PCR反应的阳性对照。
3）制备内对照：使用细胞培养法分离BMV毒株。
4）准备反应主混合物：使用TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix（Invitrogen），含有预混的Taq DNA聚合酶，反转录酶，dNTP，RNase抑制剂等组分的主混合物。
5）进行PCR扩增反应：在提取之前先向样本和阴性对照加入2μl内对照(5μM)。使用适当的RNA/DNA提取技术(如MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit，Invitrogen)从样本中提取核酸。然后向反应主混合物(13.5μl)中分别加入各引物/探针组合(1.5μl)以及从样本或阴性对照提取的核酸(10μl)。以相同的比例对阳性对照进行混合操作。最终浓度阳性对照为5μM，引物/探针浓度为0.4μM。随后将各反应管按照以下程序在合适的实时荧光PCR仪(如ABI 7500，Applied Biosystems)上进行PCR反应：50℃保持15min(逆转录)，95℃保持10min(热启动)；95℃维持8s(变性)，60℃维持34s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。
6）结果判定：所有阴性对照的信号值都应低于阈值。所有阳性对照信号都应有指数上升且Ct值必须小于33。内对照信号应有指数上升且Ct值必须小于33。否则说明扩增不成功。如某种病原体相应的荧光信号产生指数上升，则为阳性，否则为阴性。
SEQUENCE LISTING
<110> 华美生物工程有限公司
<120> 一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (1)
1.一种检测病毒性肠胃炎的多重PCR快速检测试剂盒，试剂盒内设有阳性对照、阴性对照和内对照，其特征在于：该试剂盒内还设有分别用于检测诺瓦病毒G1、诺瓦病毒G2、腺病毒、星状病毒和轮状病毒中一种或多种病毒的多种引物及探针序列的混合物，其中，用于诺瓦病毒G1检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：1 和 SEQ ID NO：2 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：3，荧光标记为Cy5；用于诺瓦病毒G2检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：4和 SEQ ID NO ：5 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：6，荧光标记为FAM；用于腺病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：7和 SEQ ID NO：8，Taqman探针序列为SEQ ID NO ：9，荧光标记为Cy5；用于星状病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO ：10 和 SEQ ID NO：11 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：12，荧光标记为FAM；用于轮状病毒检测的引物序列分别为 SEQ ID NO：13 和 SEQ ID NO：14 ，Taqman探针序列为SEQ ID NO：15，荧光标记为YAK；所述的内对照为雀麦花叶病毒，用于检测雀麦花叶病毒的引物序列分别为 SEQ ID NO：16和 SEQ ID NO：17，Taqman探针序列为SEQ ID NO：18，荧光标记为YAK。
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| Country | Link |
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| CN (1) | CN104561376A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108330211A (zh) * | 2017-01-18 | 2018-07-27 | 南京美宁康诚生物科技有限公司 | A组轮状病毒/星状病毒/肠道腺病毒核酸多重荧光pcr检测试剂盒及其用途 |
-
2014
- 2014-12-24 CN CN201410809631.8A patent/CN104561376A/zh active Pending
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