CN105567871A - 快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-rpa检测试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途。所述试剂盒包括有一对引物和一条探针，所述引物的序列如SEQ？ID？NO.1以及SEQ？ID？NO.2所示，所述探针的序列如SEQ？ID？NO.3所示。实验证明本发明的试剂盒能够特异性的检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)，与猪瘟病毒、C型-猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒以及口蹄疫病毒等不反应。实验证明，本发明的试剂盒能够在40℃，扩增20min的条件下检出最少70个拷贝的模板，且与RT-qPCR具有很高的符合度。由此说明，本发明的试剂盒能够快捷、高效、灵敏的检测HP-PRRSV，本发明的提出为HP-PRRSV的鉴别诊断提供了有效技术手段。

Description

快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途，本发明属于预防兽医学检验领域。

背景技术

在发展中国家实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展中国家仍然集中在使用传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定传染性以及非传染性疾病。在大多数情况下，尽管缺少使用这些方法的实验设备，并且缺乏综合管理这些疾病的常规操作。因此，这些国家长期持续的受到这些疾病的困扰，包括艾滋病、麻疹以及肺结核病，以及2014年爆发的埃博拉病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺，新的等温分子诊断技术正在陆续被开发，这些方法尤其适用于基础设施、实验设备以及试验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。与常规方法相比较，这些方法具有很高的敏感性和特异性，因而促使不同的公司对这些等温扩增技术商业化，比如，环介导的扩增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USAandTwistDx,UK)，链置换扩增(stranddisplacementamplification,BectonDickson,USA)。LAMP技术已经比较成熟，并且得到广泛使用，到目前为止，已经超过1000份关于LAMP在不同疾病诊断中应用的科研文章，可是，该技术距离在发展中国家应用仍然有较大的距离，而且该技术也有不足的地方，比如试验设计比较麻烦(3对引物)，特异性相对较弱(能扩增很多条带)，时间仍然相对较长，以及易于污染等。

重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDxInc开发)。不像其他的等温扩增方法，RPA扩增能够以非常快的速度(20分钟以内)扩增出DNA/RNA，该扩增可以在人体温温度下，或者更低的温度下进行。RPA扩增可以使用所有的基于PCR的扩增检测，尤其是实时荧光检测以及试纸条检测。RPA已经被英国剑桥的Twist^DX商业化，商业化的试剂盒以一种冻干的形式储存，以便于在条件差的环境下使用，可以根据使用者设计的特异引物和探针来进行特异的扩增，目前该公司提供了商业化的弯曲杆菌、红绸鱼、李斯特菌以及沙门氏菌检测试剂盒。RPA技术自2006年问世以来，快速的冲击着田间分子检测市场，目前该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业上，比如用于检测土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)俗称“猪蓝耳”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重损害全世界养猪业的重要的疾病，其主要临床症状为母猪繁殖失败以及仔猪呼吸系统疾病。该病分别于1987年和1990年出现在美国中西部和中欧，之后很快广泛流行于北美、欧洲等养猪国家和地区。1991年荷兰和美国的调查者鉴定出PRRSV是猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)的病原。PRRSV是一种动脉炎病毒科(Aeterivirus)，动脉炎病毒属的正链RNA病毒。其基因组全长约15Kb，含有9个开放阅读框。基于系统进化分析，PRRSV被分为基因1型(欧洲型)和基因2型(北美洲型)。这两种基因型病毒核苷酸序列一致性只有60％。PRRSV在1996年首次在中国出现，至此之后，该病毒在中国广泛的传播。2006年，高致病性2型PRRSV(TypeIIHighlyPathogenicPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,HP-PRRSV)在中国的猪场出现，其感染数以百万计的猪，致死率高达20％–100％，其临床特征为高热，厌食，猪身体出现红色斑点以及耳朵发绀，该病的晚期出现腹泻的症状。至此，HP-PRRSV和经典型2型PRRSV(TypeIIclassicalPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,C-PRRSV)在我国共存。HP-PRRSV的危害远比C-PRRSV的危害要大的多，而在临床样品中快速鉴定HP-PRRSV对于有效控制HP-PRRS起到关键的作用，因此快速、简便、敏感和特异性的检测HP-PRRSV对于疫病的防控以及流行病学调查至关重要。

ZhengChai等(ASYBRGreen-basedreal-timeRT-PCRassayforsimpleandrapiddetectionanddifferentiationofhighlypathogenicandclassicaltype2porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscirculatinginChina.ArchVirol(2013)158:407–415)建立了一种基于SYBRGreen的实时荧光定量RT-PCR检测方法，该方法能够同时检测并区别HP-PRRSV和C-PRRSV，而且成本比较低廉，在临床上得到了较为广泛的应用。但是其缺点在于SYBRGreen能够结合所有的扩增产物，并且该方法通过区分溶解温度来区别HP-PRRSV和C-PRRSV，因此具有很强的非特异性，而且该方法需要复杂的试验设备以及熟练的操作人员，该方法大约需要一个半小时的试验时间，比较耗时。

Hao-taiChen等(Reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationforthedetectionofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，JournalofVirologicalMethods153(2008)266–268)建立了一种针对PRRSV开放阅读框1a设计3对引物来检测HP-PRRSV的RT-LAMP检测方法，该方法能够更加便捷和快速的对HP-PRRSV进行检测。但是通过RT-LAMP的扩增结果可以看出，该方法能够出现很多扩增条带，因此同样存在非特异性扩增，而且该方法需要设计三对引物来进行扩增，因此增加了实验设计的难度，并且增加了其与其他检测平台相结合的难度。此外，检测温度较高(64℃)，检测时间较长(45min)，并且需要核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性，或者通过与染料结合进行检测，同样具有很强的非特异性。

针对现有技术中存在的问题，本发明研发并评估了基于荧光探针的实时荧光RT-RPA试验(real-timeRT-RPA)以快速检测HP-PRRSV的方法。重组酶聚合酶技术(recombinasepolymeraseamplification，RPA)由于其具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被应用于多种重要疾病病原的检测中。目前，国内外尚无建立RT-RPA试验以检测HP-PRRSV。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的鉴定高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明是将RT-RPA(reversetranscriptionRecombinasePolymeraseAmplification，RT-RPA)试验首次应用到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的检测上。与C-PRRSV相比较，HP-PRRSV在NSP2区域缺失大约30个氨基酸，因此本发明选取了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2缺失区域设计特异性引物和探针，本发明发明人同时通过对来自于GenBank中的EF112445,EF517962,EF635006,EF641008,EU109503,EU144079,EU187484,EU200961,EU880431和EU880435的NSP2基因同源序列进行比对分析，以进一步确定HP-PRRSV的保守区域，以期能够检测到尽可能多的HP-PRRSV。

特异性实验表明本发明方法能够特异性的检测HP-PRRSV，对猪瘟病毒、C型-猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫病毒没有扩增。灵敏度实验表明本发明所设计的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RPA引物和探针能够在40℃，扩增20min条件下检出最少70个拷贝的模板。本发明不仅仅对该方法的敏感性和特异性进行评估，并同时用临床样品对该试验结果进行评估，并与RT-qPCR相对应的结果进行比较，结果证明本发明方法与RT-qPCR具有很高的符合度。因此，本发明的鉴定高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法能够快捷、高效、灵敏的检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种用于快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-RPA检测试剂盒，包括有一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5’-AGCTGATGACACCTTTGAGTGGGTCGGCACCAGTT-3’(SEQIDNO.1所示)；

下游引物：5’-CGTCTGTGAGGACGCAGACAAATCCAGAGGCTCAT-3’(SEQIDNO.2所示)；

探针：5’-GTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAAC

-(FAM-dT)-(THF)-(BHQ1-dT)-GACAACAACGCTGAC-P-3’。(SEQIDNO.3所示)

其中，BHQ1-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸，用于阻止链的延伸。

在本发明中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液(rehydrationbuffer，TwistDxexoKit,Cambridge,UnitedKingdom)，醋酸镁以及ddH₂O。

在本发明中，优选的，所述的试剂盒用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒时，实验体系如下：13.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.075μL的10μM探针，2μL的病毒RNA模板，4.825μL的ddH₂O以及1.25μL的280mM醋酸镁；

扩增反应在温度设定为40-42℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-1h，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。

进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂中的用途。

相较于现有方法，本发明的方法具有以下优点：

(1)能够节约试验时间：RPA整个试验过程只需要20min，该时间远远低于RT-qPCR的一个半小时以及RT-LAMP的45min。加上样品处理以及准备试验的时间，RT-RPA整个检测过程能够在一个小时之内完成。

(2)能够降低反应温度：RPA只需要恒温40℃即可完成实验，该温度远远低于RT-qPCR的60℃-95℃以及RT-LAMP的64℃。

(3)方法更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西已经冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，不需要熟练的实验人员。

(4)灵敏度高：本发明所设计的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RPA引物和探针能够在40℃，扩增20min条件下检出最少70个拷贝的模板。

(5)特异性好：因该试验中添加了探针，增加了该方法特异性，基于SYBR的RT-qPCR以及RT-LAMP方法因为没有探针，特异性相对较差。实验证明本发明的试剂盒能够特异性的检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，与猪瘟病毒、C型-猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒以及口蹄疫病毒等不反应。

(6)更加不易于污染：该试验中添加了核酸外切酶III，对扩增产物进行切割，因此降低了产物污染的可能性，SYBR的RT-qPCR没有添加切割产物的酶，RT-LAMP需要跑核酸电泳胶，因此，均有污染的可能性。

(7)检测结果真实可靠，与现有的RT-qPCR具有很好的符合度，如图2所示。

附图说明

图1A为将合成的针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引物和探针的标准品质粒进行十倍倍比稀释，质粒浓度范围为7×10⁶-7×10⁰拷贝，随后用HP-PRRSVreal-timeRT-RPA试验进行敏感性检测，如图所示为扩增20min后实时荧光PCR仪的结果。从此图可看出本发明所设计的引物和探针可以在40℃条件下，很好的检测7×10⁶-7×10¹拷贝的模板。其中NC代表阴性对照。

图1B为利用PRISM5.0软件(GraphPadSoftware,USA)对HP-PRRSVreal-timeRT-RPA试验的可重复性进行验证。

阈值为平均值±标准方差(SD)。该试验进行过4次重复性试验。

图1C为对HP-PRRSVreal-timeRT-RPA试验的四次重复性结果进行退行性分析。用三角符号标出95％可能性的检测限制。

图2为分别采用real-timeRT-RPA和RT-qPCR检测猪疑似临床样品(n＝32)的结果比较，用excle软件来进行退行性分析，其中Y轴为RT-RPA的时间阈值，X轴为RT-qPCR循环数阈值。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1快速检测HP-PRRSV的RT-RPA检测试剂盒及检测方法的建立

1.引物及探针序列的设计及合成

研究表明，与C-PRRSV相比较，H-PRRSV在NSP2区域缺失大约30个氨基酸，因此本发明选取了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2缺失区域设计特异性引物和探针，并对来自于GenBank中的EF112445,EF517962,EF635006,EF641008,EU109503,EU144079,EU187484,EU200961,EU880431和EU880435的NSP2基因同源序列进行比对，以期能够检测到尽可能多的HP-PRRSV，所有的引物和探针都有生工生物(上海，中国)合成。

2.毒株、细胞

本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存：HP-PRRSV/SD0907(GenBank:KF562320.1),HP-PRRSV/JS0912(GenBank:KF562318.1),classicalPRRSVstrainCH-1R(GenBank:EU807840),classicalswinefevervirus(CSFV,genBank:AF531433.1),pseudorabiesvirus(PRV,genBank:AY217094)以及foot-and-mouthdisease(FMDVtypeA/CHA/2009；typeO,genBank:JN998085.1；typeAsia1,genBank:EF149009.1)。Marc-145细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃,5％CO₂的环境下培养。

3.病毒基因组提取

使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来来提取病毒RNA，并最终用50μL的无RNase水洗脱。提取的RNA存放到-80℃冰箱中以待随后的使用。

4.产生RNA标准品

金维智合成HP-PRRSVNSP2基因片段(230bp)，并克隆到pUC57载体，位于T7启动子的下游，命名为pHP-PRRSV/RPA。用质粒提取方法(Promega,USA)来提取pHP-PRRSV/RPA质粒。按照体外转录操作手册(kit,Ambion)用1μg线性化的质粒来进行体外转录。用DNase来处理转录后的RNA，并随后用(RNeasyMiniKIT,Qiagen)RNA清洁操作手册来进行操作。用Nanovue(GElifescience)来定量纯化的RNA,并随后储存于-80℃备用。

5.RT-RPA试验扩增条件优化

以提取纯化的病毒DNA/RNA或者标准RNA为模板进行扩增，实验体系如下：13.75μL的水解缓冲液(TwistDxexoKit,Cambridge,UnitedKingdom)，1.05μL的上游引物(10μM)，1.05μL的下游引物(10μM)，0.075μL的RPAexo探针(10μM)，2μL的RNA模板，4.825μL的ddH₂O以及1.25μL的醋酸镁(magnesiumacetate，280mM)。反应条件为40℃，反应可在20min之内完成。同时我们分别设计合成了三对上游引物和三对下游引物(表1所示)，并用该体系对引物与探针组合进行评价，评价结果表明其中一对(F2/R1)能够产生最强的扩增信号，因此，该引物对与探针进行组合应用到本发明中。

表1本发明设计的RT-RPA引物和探针

HP-PRRSV-RPAF和R：代表RPA引物；HP-PRRSV-RPAP：代表RPA探针

6.反应温度和时间的优化

在进行RT-RPA引物的反应温度的确定时，按照上述体系加入反应物。反应温度设定为40℃，41℃和42℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。通过对结果的分析表明，40℃，41℃和42℃对于试验结果几乎没有影响，所以本发明所设计的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RPA扩增温度可以选择40℃，41℃和42℃中任意一个温度。本发明选用40℃进行一下试验。

在进行RT-RPA引物的反应时间的确定时，按照上述体系加入反应物。并将温度设定为40℃时，试验反应不同时间扩增差异。我们将时间分别设定为20min、30min和1h，结果表明，扩增20min之后的阴性在一个小时之后仍然为阴性，20min之后的阳性在一个小时之后仍然为阳性，因此，我们选择20min为本发明的扩增设定时间。

7.反应灵敏度检测

在进行RT-RPA引物的反应灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述合成的标准质粒反转录的标准RNA，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为7×10⁶-7×10⁰个拷贝共计7个梯度作为模板。反应温度设为40℃的qPCR仪中进行，时间设定为20min，通过实时荧光监控扩增结果。如图1A所示，该试验的敏感性为70拷贝/反应。并且具有较广的检测范围，至少在7×10⁶-7×10¹个拷贝范围内的样品均能被检测出来。

8.反应特异性检测

在进行RT-RPA引物的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用模板分别为猪瘟病毒(CSF)、C型-猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)。在反应温度设为40℃的qPCR仪中进行扩增，反应时间设定为20min。结果表明，只有HP-PRRSV病毒能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，该方法具有很好的特异性。

表2.评估HP-PRRSVreal-timeRT-PRA试验的特异性

neg:代表阴性

9.可重复性实验

在HP-PRRSVreal-timeRT-RPA敏感性试验中，对于同一个试验进行了四次重复，结果表明四次试验的检测结果一致，均能够很好的检测70拷贝的标准RNA，本发明利用PRISM5.0软件(GraphPadSoftware,USA)对试验的可重复性进行统计分析，结果如图1B所示，表明该发明具有很好的可重复性。阈值为平均值±标准方差(SD)。同时，本发明利用Exle软件对HP-PRRSVreal-timeRT-RPA试验的四次重复性结果进行退行性分析，结果如图1C所示，该试验能够很好的检测HP-PRRSV。

实施例2HP-PRRSV的RT-RPA检测试剂盒在田间检测中的用途

1、样品

68份田间组织样品收集自山东省疑似患有HP-PRRS的八个猪场中。12份血清样品收集自健康猪。病毒基因组提取同实施例1.

2、检测方法

(1)real-timeRT-PRA方法

实验体系如下：13.75μL水解缓冲液，1.05μL上游引物(10μM)，1.05μL下游引物(10μM)，0.075μL的RPAexo探针(10μM)，2μL的RNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的醋酸镁(magnesiumacetate，280mM)。

引物和探针的序列如下所示：

上游引物：5’-AGCTGATGACACCTTTGAGTGGGTCGGCACCAGTT-3’(SEQIDNO.1所示)；

下游引物：5’-CGTCTGTGAGGACGCAGACAAATCCAGAGGCTCAT-3’(SEQIDNO.2所示)；

探针：5’-GTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAAC

-(FAM-dT)-(THF)-(BHQ1-dT)-GACAACAACGCTGAC-P-3’。(SEQIDNO.3所示)。

扩增反应在温度设定为40℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。

一个样品所有的重复试验，在特定的时间内(20min)扩增结果均大于背景值3.5个标准方差(3.5SD)的为阳性，反之，该样品为阴性。

(2)RT-qPCR方法

参考文献方法进行(ZhengChaiet.al,ASYBRGreen-basedreal-timeRT-PCRassayforsimpleandrapiddetectionanddifferentiationofhighlypathogenicandclassicaltype2porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscirculatinginChina.ArchVirol(2013)158:407–415)。

用SelectMasterMix(Lifetechnologies)，在AglientTechnologiesStratageneMx3005P仪器上进行RT-qPCR试验。反应体系为：12.5μLSelectMasterMix(2X)，1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，2μL的RNA模板，8.5μLddH2O。热循环参数为：50℃5min,95℃10min,随后为95℃15s，60℃1min，40个循环。同时用溶解曲线来进一步确定扩增产物。用Mx3005P系统软件对数据进行分析。

3、结果

同时采用real-timeRT-PRA以及RT-qPCR方法对68份田间组织样品以及12份健康猪的组织样品进行了检测，结果如表3和图2所示。

表3.采用real-timeRT-PRA以及RT-qPCR方法对临床样品进行检测结果的比较

综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的RT-RPA方法及检测方法可以快速鉴定高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，而且该检测方法简单、快速、检测结果真实可靠。

Claims (4)

1.一种用于快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-RPA检测试剂盒，其特征在于包括有一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5’-AGCTGATGACACCTTTGAGTGGGTCGGCACCAGTT-3’

下游引物：5’-CGTCTGTGAGGACGCAGACAAATCCAGAGGCTCAT-3’

探针：5’-GTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAAC

-FAM-dT-THF-BHQ1-dT-GACAACAACGCTGAC-P-3’。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH₂O。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒时，实验体系如下：13.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.075μL的10μM探针，2μL的病毒RNA模板，4.825μL的ddH₂O以及1.25μL的280mM醋酸镁；

扩增反应在温度设定为40-42℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-1h，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。

4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒在制备检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂中的用途。