CN111850162A

CN111850162A - 一种用于检测猴免疫缺陷病毒的rpa试剂盒、引物、探针及方法

Info

Publication number: CN111850162A
Application number: CN201910338677.9A
Authority: CN
Inventors: 薛俊欣; 郑江; 陈鸿军; 熊炜; 李健
Original assignee: TECHNICAL CENTRAL FOR ANIMALS PLANTS AND FOOD INSPECTION AND QUARANTINE SHANGHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: TECHNICAL CENTRAL FOR ANIMALS PLANTS AND FOOD INSPECTION AND QUARANTINE SHANGHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及一种用于检测猴免疫缺陷病毒核酸的RPA试剂盒、引物、探针及方法。所述的试剂盒包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针如SEQ ID NO.3+FAM‑dt+THF+BHQ1‑dt+SEQ ID NO.4+C3所示。本发明的试剂盒可用于检测猴免疫缺陷病毒，反应时间短、检测速度快，且灵敏度和特异性高。

Description

一种用于检测猴免疫缺陷病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猴免疫缺陷病毒核酸的RPA试剂盒、引物、探针及方法。

背景技术

现有技术公开了猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus，SIV)又名猴艾滋病病毒，是一种外源性逆转录病毒，它是猴获得性免疫缺陷综合征(Simian aquiredimmune deficiency syndrome，SAIDS)的致病原。SIV于1985年首次从饲养的猕猴体内分离到SIV，随后SIV病毒株从非洲猴和亚洲恒河猴体内分离出来。

由于SIV与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)基因同源性高，其形态、理化特性、分子生物学特性和致病机制均与HIV十分相似，部分SIV病毒株接种亚洲恒河猴，会使其感染并很快产生类似AIDS症状，因此，用SIV感染亚洲恒河猴作为模型并被推荐替代HIV-1/黑猩猩模型。有研究显示，HIV-2在非洲病人中分离出来，该病毒亦可感染猴类和狒狒，但产不致病。由于SIV和HIV-2具有很高的同源性，在基因组和氨基酸水平上达到60％，又可感染恒河猴使其产生类似AIDS的病变，加之HIV-2感染者仅局限于西非等部分地区，绝大部分AIDS患者为HIV-1感染所致，故本领域大多数研究者不热衷于HIV-2的动物模型，仍用SIV感染恒河猴从事病原学、药物及多种疫苗的研究。SIV遗传学上主要分为SIVcpz、SIVsm、SIVmnd、SIVsyk和SIVagm五大支系，SIV具有宿主依赖性进化特点，从而使其在天然宿主中不致病，如SIVsm感染乌黑白脸猴，SIVagm感染非洲绿猴，SIVcpz感染黑猩猩等都不会使后者发病，但当SIV跨物种传播至天然宿主，如亚洲恒河猴，通常会使其发病，正是利用SIV的这一特点，研究人员用感染非天然宿主建立猴艾滋病模型。多年来，研究人员尝试用SIVsm、SIVmac、SIVmnd、SIVsyk和SIVagm等感染非天然宿主，其中以SIVsm和SIVmac较成功，SIVmac感染恒河猴的病程进展及临床表现与人类艾滋病非常相似。

研究显示，SIV感染主要破坏免疫系统，可导致细胞免疫和体液免疫缺陷，猕猴感染SIV可能会在其感染后期发展成为SAIDS。SAIDS是一种慢性传染病，致死率高，严重威胁猴群健康，因此，及时准确的检测出SIV，并控制其传播，对于猴群的健康及生产具有重要意义，同时SIV在繁殖猴群的感染也将直接影响其在生物医学研究中的应用。

现有技术中，血清学方法和核酸方法是检测SIV最常用的方法。目前SIV的ELlSA试剂盒仅有美国BioReliance和VRL等少数几个实验室拥有，该试剂盒虽然准确率高，但价格昂贵，若进行大规模的SIV血清学调查，国内实验猴养殖单位难以承受。有鉴于此，在实际应用中多是采用间接免疫荧光测定法(IFA)进行SIV抗体水平的测定。RT-PCR方法是目前SIV病原检测最常用的方法，其操作简单、准确率高、检测成本低廉，然而，RT-PCR方法或需要昂贵的仪器设备，或需要技术娴熟的技术人员，或检测周期长，不适合普通实验室或现场诊断的推广应用。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种新的等温基因扩增技术，该技术可在37～42℃条件下、10～30min内等温体外大量扩增目的基因片段；随其后，英国TwistDx公司开发出了RPA商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用；与聚合酶链式反应(PCR)相比，PRA具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。目前，RPA已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用，该技术通过利用重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物，启动寻找模板DNA上的同源序列；当同源序列定位后，则会引发链置换反应；引物结合到对应模板上，聚合酶进而从引物3’末端开始启动DNA合成，能实现在常温下两条引物对靶基因的几何级数扩增；同时，在RPA反应体系中，对引物碱基突变具有较强的耐受性，在引物个别碱基突变后，RPA反应依然可以顺利进行。

重组酶聚合酶扩增是一种新型的、可以替代PCR的核酸检测技术，它能够在20分钟内进行常温下的单分子核酸检测；且技术对硬件设备的要求很低，特别适合野外及检疫现场使用。基于现有技术的基础和现状，本申请的研究团队建立了实时荧光RPA检测SIV的方法，并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证；具体的，拟提供一种用于检测猴免疫缺陷病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法，以提高口岸对进出境野生及实验用灵长类动物SIV感染情况的监测和流行病学调查。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的基础和现状，为克服目前对猴免疫缺陷病毒病毒检测的灵敏度和敏感性低，且反应时间长等技术缺陷，提供一种用于检测猴免疫缺陷病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法，以提高口岸对进出境野生及实验用灵长类动物SIV感染情况的监测和流行病学调查。

本发明建立了实时荧光RPA检测SIV的方法，并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证；本发明的利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)建立的检测SIV核酸的快速检测方法具有很高的特异性和敏感性，为SIV感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测方法。

本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供一种用于检测SIV核酸的试剂盒，其包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示。

为提高扩增效率，所述的RPA反应体系的引物的浓度较佳地分别为5～20μM，更佳地为10μM；所述探针的浓度较佳地为5～10μM，更佳地为10μM。

较佳地，所述的RPA反应体系还包括RT反应液、核心反应液、反应缓冲液、Exo反应液、探针酶混合物、醋酸镁和dNTP；其中，所述醋酸镁的浓度优选260～300μM，更优选280μM。所述dNTP的浓度优选20～220μM，更优选200μM。

在本发明一较佳实施例中，所述的引物探针混合液由所述引物对和所述探针组成，所述引物对中各引物的量为2.1μL、浓度为10μM，所述探针的量为0.6μL、浓度为10μM。所述核心反应液的量为2.5μL，所述RT反应液的量为1μL，所述反应缓冲液的量为25μL，所述探针酶混合物的量为5μL，以及所述Exo反应液的量为1μL；所述醋酸镁的量为2.5μL、浓度为280μM；所述dNTP的量为7.2μL、浓度为11mM。其中：

所述的核心反应液优选20倍核心反应液(即：20×核心反应液；下同)；

所述的反应缓冲液优选2倍反应缓冲液；

所述的探针酶混合物优选10倍探针酶混合物；

所述的RT反应液优选50倍RT反应液；

所述的Exo反应液优选50倍Exo反应液；

更佳地，为了更直观、准确地判定检测结果，所述的试剂盒还包括阴性对照，所述的阴性对照优选ddH₂O。

本发明还提供一种检测SIV核酸的引物对，所述的引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。

本发明还提供一种检测SIV核酸的探针，所述的探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。

本发明还提供一种检测SIV核酸的组合，所述的组合包括引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针如SEQ IDNO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。

本发明还提供如上所述的引物对和/或探针，或者所述的组合在制备检测CPV的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种非诊断目的的检测SIV的方法，其包括如下步骤：

(1)使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总RNA为模板，利用如上所述试剂盒中的RPA反应体系进行RPA反应，所述RPA反应中扩增反应的时间优选25min、温度优选39℃；

(3)分析检测结果。

利用本方法分别检测猴的其它病毒，如猴T淋巴细胞白血病病毒(STLV)、猴D型逆转录病毒(SRV)、猴B孢疹病毒(BV)，猴空泡病毒40(SV40)，同时与RT-PCR方法进行对比，检测所建立方法的特异性；结果证实，本发明所建立的SIV的RPA检测方法具有很高的特异性和敏感性，能为基层单位普通实验室SIV感染的诊断提供一个快速、简便、准确的检测手段。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明提供了用于检测猴免疫缺陷病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法，尤其是一种用于检测SIV核酸的RPA新方法；与普通RT-PCR方法相比，RPA具有以下优势：首先，RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即也可完成反应；其次，RPA检测速度快，不需要反转录，反应时间在40min以内，比常规PCR反应时间(通常为1～2h)明显短；第三，试验条件允许的条件下加入荧光标记的探针序列，在GENIEⅡ恒温扩增仪上进行扩增，能实现核酸扩增的实时监控，上述特点使得本发明建立的RPA方法可用于基层单位普通实验室SIV快速检测和鉴别诊断。

附图说明

图1为实时荧光RPA检测SIV的特异性。

图2为RT-PCR检测SIV的特异性；其中M为DNA Marker DL2000；泳道1-8检测的病毒样品分别为1.SIV；2.STLV；3.SRV；4.BV；5.SV40；6.沙门氏菌；7.志贺氏菌；8.空白对照。

图3为实时荧光RPA检测SIV的敏感性。

图4为RT-PCR检测SIV的敏感性试验；其中M为DNA Marker DL2000；泳道1-8cDNA模板的浓度分别为为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg和、0.1fg。

图5为实时荧光RPA检测检测6份SIV阳性血清。

图6 RT-PCR检测6份SIV阳性血清样品，其中，

M.DNA Marker DL2000；1～6.6份SIV阳性血清样品；7～8.空白对照

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1实时荧光PRA引物和探针的设计

使用Vector NTI Suite软件分析不同国家和地区分离的SIV基因的保守序列，用Primer Express软件设计RPA引物和探针，引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成。

表1引物和探针组合

其中，RPAY-SIVP的核苷酸序列组成为：SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQID NO.4+C3。

实施例2反应体系的建立和优化

1)实时荧光RPA检测

反应体系为50μL：25μL 2倍反应缓冲液、7.2μL浓度为11mM的dNTP、5μL 10倍探针酶混合物、上下游引物(RPAY-SIVF、RPAY-SIVR)各2.1μL(浓度均为10μM)、10μM荧光探针0.6μL；混匀后，再加入2.5μL 20倍核心反应液、1μL 50倍RT反应液、1μL 50倍Exo反应液；混匀后，最后加入2.5μL的280mM醋酸镁、1μL待检核酸溶液。反应条件为：39℃孵育25min。在反应结束后，查看荧光扩增曲线并进行结果判定；

2)最佳反应时间的确定

为确定RPA最佳反应时间，以1×10³拷贝/μL的重组质粒pT-SIV-P72 DNA为模板，分别以10min、20min、25min、30min、35min和40min为不同的反应时间进行RPA扩增。RPA反应结束后，取5μL产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用紫外凝胶成像系统分析电泳结果。结果发现，40℃下RPA反应时间为20min时，电泳即可获得一条大小约为180bp的特异性条带。对RPA产物条带用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，RPA反应30minmin后，条带约为20min时条带的5.3倍，而反应25min后扩增的条带没有显著增加，因此将SIV RPA最佳反应时间确定为25min；

3)RPA最佳反应温度的确定

为准确比对不同温度下RPA反应的扩增效率，配制50μL RPA反应体系，充分混匀后，分别在30、35、37、39、41和45℃进行扩增反应，30min后分别从各管中取10μL扩增液。结果该检测体系在25～45℃的温度范围内均可有效进行，其中39℃时扩增效率最佳，紫外凝胶成像系统分析时条带最深，因此最佳反应温度确定为39℃；

4)核酸提取及cDNA模板制备

对于DNA病毒样品，取100μL组织上清液或体液样本，按DNA抽提试剂盒(市售可得，例如购自QIAGEN的试剂盒)说明书要求进行病毒DNA提取，最后将DNA用50μL水溶解，即得PCR模板；对于RNA病毒样品，取100μL上清液或体液，用TRIzol方法提取RNA，再进行逆转录，得cDNA模板：具体操作如下：

4.1向30mg组织样本中加入含有700μL缓冲液1的离心管，匀浆后以最大转速离心收集上清由于RNA提取；

4.2加入等体积70％的乙醇，充分混匀；

4.3将所有混匀液体包括沉淀转移到吸附柱中，12 000rpm离心30s，弃掉废液；

4.4向吸附柱中加入500μL缓冲液2，12 000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中；

4.5向吸附柱中加入600μL漂洗液，12 000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中；充分本操作一次；

4.6将吸附柱放入收集管中，12 000rpm离心2min，弃掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟；

4.7将吸附柱转入另一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30～50μL无RNA酶水，室温放置3min，12 000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

实施例3 RT-PCR检测

PCR引物针对SIV基因设计，扩增基因片段大小为441bp，其上游引物(SIVF)序列为：5’CCTCACGTGTAACTCCACAGTGACCA 3’，下游引物(CPIVR)序列为：5’CTCGATGGCAGTGACCCTAGTCTGGA 3’，在PCR薄壁管中，加cDNA模板1μL、10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP 0.5μL、上下游引物各0.25μL、Taq酶0.25μL，加水补足总体积至25μL，将PCR管置PCR仪上，按如下程序扩增：首先94℃3min；然后94℃15s，55℃15s，72℃30s，35个循环；最后72℃3min，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，以凝胶成像系统分析。

实施例4实时荧光RPA检测SIV的特异性试验

本发明分析SIV VP2蛋白基因序列，设计引物及探针，建立实时荧光RPA检测SIV方法，并分别使用猴的其它病毒(如STLV、SRV、BV，SV40)作为对照，同时与RT-PCR方法进行对比，确认所建立方法的特异性；结果显示，经荧光RPA检测，SIV阳性样品在反应5～10min后荧光信号出现显著增强，而对照病毒和细菌样品未检测到荧光信号(如图1所示)，RT-PCR检测仅有SIV阳性样品出现特异性扩增，其它病毒对照均呈阴性(如图2所示)。

实施例5实时荧光RPA检测SIV的敏感性试验

为测试建立的实时荧光RPA方法的敏感性，将SIV阳性样品cDNA进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL的模板，并设置阴性对照为dd H₂O，再分别用实时荧光RPA和RT-PCR方法检测，结果显示，PCR检测样品SIV阳性cDNA模板的下限量为1～10pg/μL(如图5所示)，而RPA检测SIV cDNA模板的下限量同样为1～10pg/μL(如图4所示)。

实施例6试剂盒的组装

按照核酸的提取和RPA反应两个部分完成试剂盒组分的配制，以下提供的数据及试剂组分为单次检测所需试剂：

1)核酸提取(室温保存)

核酸提取试剂包括缓冲液1(40ml)、缓冲液2(40ml)、漂洗液(15ml)、无RNA酶水(15ml)、吸附柱和收集管；

2)RPA检测(-20℃保存)

引物探针混合液管：10μM上下游引物各2.1μL、10μM探针0.6μL，合计4.8μL；

反应液管：2×反应缓冲液25μL、dNTP 8.2μL、10×探针酶混合物5μL、20×核心反应液2.5μL、50×RT反应液、50×Exo反应液1μL；2.5μL的280mM醋酸镁。

实施例7试剂盒的应用——实时荧光RPA检测SIV的重复性试验

为进一步验证建立核酸检测方法的可靠性，对将本室保存的经RT-PCR确认的6份SIV阳性血液样本及23份SIV阴性猴血清分别用荧光RPA和RT-PCR进行检测，结果显示，7份阳性核酸样本经上述三种方法检测均得到了阳性结果，而阴性样本均未出现特异性扩增，与实际样本的符合率为100％(如图5、图6所示)。

序列表

<110> 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 一种用于检测猴免疫缺陷病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法

<130> 20190425

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> RPAY-SIVF

<400> 1

ctccacagtg accagtctca tagcaaacat ag 32

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> RPAY-SIVR

<400> 2

gtgccaccag tagtatacct cttcacatct gtgc 34

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 3

<400> 3

atatcaccat gagtgcagag gtggcagaac tg 32

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 4

<400> 4

gattggaatt gg 12

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> SIVF

<400> 5

cctcacgtgt aactccacag tgacca 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> CPIVR

<400> 6

ctcgatggca gtgaccctag tctgga 26

Claims

1.一种用于检测猴免疫缺陷病毒核酸的试剂盒，其包括RPA反应体系，其特征在于，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，

所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，

所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，

所述探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA反应体系的引物的浓度均为5～20μM，较佳地为10μM；所述探针的浓度为5～10μM，较佳地为10μM。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA反应体系还包括RT反应液、核心反应液、反应缓冲液、Exo反应液、探针酶混合物、醋酸镁和dNTP；较佳地：所述醋酸镁的浓度为260～300μM，优选280μM；

和/或，

所述dNTP的浓度为20～220μM，优选200μM。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物探针混合液由所述引物对和所述探针组成，所述引物对中各引物的量为2.1μL、浓度为10μM，所述探针的量为0.6μL、浓度为10μM；所述核心反应液的量为2.5μL，所述RT反应液的量为1μL，所述反应缓冲液的量为25μL，所述探针酶混合物的量为5μL，以及所述Exo反应液的量为1μL；所述醋酸镁的量为2.5μL、浓度为280μM；所述dNTP的量为7.2μL、浓度为11mM；

较佳地：所述的核心反应液为20倍核心反应液；

和/或，所述的反应缓冲液为2倍反应缓冲液；

和/或，所述的探针酶混合物为10倍探针酶混合物；

和/或，所述的RT反应液为50倍RT反应液；

和/或，所述的Exo反应液为50倍Exo反应液。

5.如权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阴性对照，所述的阴性对照优选ddH₂O。

6.一种检测猴免疫缺陷病毒核酸的引物对，其特征在于，所述的引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。

7.一种检测猴免疫缺陷病毒核酸的探针，其特征在于，所述的探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。

8.一种检测猴免疫缺陷病毒核酸的组合，所述的组合包括引物对和探针，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。

9.如权利要求6所述的引物对和/或如权利要求7所述的探针，或者权利要求8所述的组合在制备检测猴免疫缺陷病毒的试剂盒中的应用。

10.一种非诊断目的的检测猴免疫缺陷病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)使用RNA提取试剂提取待检样品中的总RNA；

(2)以步骤(1)提取的总RNA为模板，利用权利要求1～5任一项所述试剂盒中的RPA反应体系进行RPA反应，所述RPA反应中扩增反应的时间优选25min、温度优选39℃；

(3)分析检测结果。