CN109338012B - K亚群禽白血病病毒rt-pcr检测引物及检测方法 - Google Patents

K亚群禽白血病病毒rt-pcr检测引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种K亚群禽白血病病毒RT‑PCR检测引物及检测方法。本发明所述引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明的K亚群禽白血病病毒RT‑PCR检测方法，包括如下操作：(1)RNA模板制备；(2)扩增目的片段；(3)电泳鉴定扩增产物。本发明的引物特异性高，且扩展片段较短，整个PCR鉴定过程可以在2～2.5h内完成，不需经过测序就能快速鉴定出K亚群禽白血病病毒，为临床K亚群禽白血病的诊断节约大量时间。本发明方法操作简单，使用的仪器普通实验容易配置，检测费用低，便于临床推广应用。

Description

K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法。
背景技术
我国鸡群中主要流行A、B和J亚群禽白血病，K亚群禽白血病是近年来才从中国地方品种鸡中分离的一个新的亚群。目前生产上主要通过血浆病毒分离和ELISA技术鉴定禽白血病病毒，但该方法不能确定病毒亚群。A、B、J亚群病毒可通过特异性引物进行PCR鉴定，而K亚群必须经过禽白血病病毒通用引物扩增、测序和序列分析才能鉴定，耗费较长时间，给K亚群病毒的快速鉴别带来不便。
目前已有两篇关于K亚群禽白血病病毒检测相关的专利。专利1(申请号：CN201710093589.8)公开了K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒。专利2(申请号：CN201810074475.3)公开一种K亚群禽白血病病毒检测试剂盒，涉及病毒荧光定量PCR检测技术领域。
专利1(申请号：CN201710093589.8)和专利2(申请号：CN201810074475.3)公开了K亚群禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法，该方法检测灵敏度较高，但是该方法需要使用荧光定量PCR仪等精密仪器设备，检测试剂和耗材费用较高，在普通实验环境下容易污染，不便于在养殖现场推广应用。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物，所述检测引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
进一步的，所示引物扩增的基因片段属于env基因。禽白血病病毒基因组的编码区含有3个编码基因，从5’端到3’端依次为gag、pol和env基因，形成三个大的开放阅读框。其中gag基因和pol基因都相对比较保守，无法区分不同亚群的禽白血病病毒，而env基因与病毒的抗原性、组织亲嗜性、毒力以及亚群特异性密切相关。
进一步的，本发明所需扩增的片段长度为401bp。
一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测方法，包括如下操作：
(1)RNA模板制备；
(2)扩增目的片段；
(3)电泳鉴定扩增产物。
进一步的，所述步骤(2)中扩增体系为：
Figure GDA0001932166660000021
进一步的，所述步骤(2)中扩增程序为：逆转录：50℃30min；预变性：94℃5min；扩增30个循环；后延伸：72℃10min。
进一步的，所述扩增30个循环包括：变性：94℃30sec；退火：56℃30sec；延伸：72℃30sec。
本发明有益效果：
该引物特异性高，且扩展片段较短，整个PCR鉴定过程可以在2～2.5h内完成，不需经过测序就能快速鉴定出K亚群禽白血病病毒，为临床K亚群禽白血病的诊断节约大量时间。相较于现有技术的其他方法(如gp85等，长度较短，不适合进行RT-PCR，或者对实验环境要求较高，不适用于临床推广)该方法操作简单，使用的仪器普通实验容易配置，所用试剂配置的所需环境普通实验室能提供，检测费用低，有利于临床推广应用。
附图说明
图1.PCR方法的建立，其中M：2000Marker，1：阴性对照，2：K亚群禽白血病病毒。
图2PCR特异性验证，其中M：2000bp Marker；1：阴性对照；2～15：生产上ELISA检测为p27阳性的样品；16：作为阳性对照的K亚群病毒；17～19分别为A、B、J亚群病毒。其中量带上的深色部分是由于样本浓度较大，扩增出的产物浓度也较大引起的。
图3.PCR灵敏度验证，其中M：2000bp Marker；1：K亚群病毒核酸未稀释；2～5分别为K亚群病毒核酸10-1、10-2、10-3、10-4稀释度；6：阴性对照。其中量带上的深色部分是由于样本浓度较大，扩增出的产物浓度也较大引起的。
图4.PCR重复性验证，其中M：2000bp Marker；1：K亚群病毒1；2：K亚群病毒1重复样品；3：K亚群病毒2；4：K亚群病毒2重复样品；5：阴性对照。其中量带上的深色部分是由于样本浓度较大，扩增出的产物浓度也较大引起的。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1本发明的K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法
1试验材料
1.1主要试剂与仪器
AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(Cat No.：AP-MN-BF-VNA-250)，TaKaRaPrimeScript 0ne step RT-PCR Kit Ver.2(TaKaRa Code:DRR055A)，Thermo高速低温离心机，Thermo PCR仪，电泳仪。
1.2毒株
临床通过病毒分离和ELISA检测鉴定的禽白血病病毒，临床鉴定的A、B、J和K亚群禽白血病病毒。
1.3引物设计
根据K亚群病毒GD14LZ株序列(GenBank：KU605774.1)的env基因设计一对引物如下表，扩增部分基因片段，目的条带预期大小为401bp。若扩增出目的片段，即可判定为K亚群禽白血病病毒。
Figure GDA0001932166660000041
预期所扩增出的目的序列为SEQ ID NO：3所示：
cagggaacctttggattacatgggccaaccgtacaggccaaacggatttctgcctctctacacagtcagccacctccccttttcaaacatgtttgataggtatcccgtcccctatttccgaaggtgattttaggggatacgtctctgataattgcaccaccttgggaactgaccggttagtctcgtcagccgacattaccggcggccctgacaacagcaccaccctcacttatcgaaaggtttcatgcttgctgtcaaagctgaatgtccctatgtgggatgagccaccggaactacagctgctcggttcccagtctctccctaacattactaatattgctcagatctctggcgtagccgggggatgcgtagctttcggcccccggagcattgacacgctt。
2试验方法
2.1RNA模板制备(样本RNA提取)
使用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(Cat No.：AP-MN-BF-VNA-250)提取病毒RNA，-70℃保存。
2.2PCR反应扩增目的片段
反应体系：使用TaKaRa PrimeScript 0ne step RT-PCR Kit Ver.2(TaKaRaCode:DRR055A)PCR试剂盒，反应体系为50μl体系，具体如下：
Figure GDA0001932166660000051
反应条件：逆转录：50℃30min；预变性：94℃5min；扩增30个循环(包括：变性：94℃30sec；退火：56℃30sec；延伸：72℃30sec)；后延伸：72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3实验结果
经琼脂糖凝胶电泳鉴定，K亚群禽白血病病毒可扩出符合预期大小的目的条带(图1)。
实施例2特异性验证
样本采用：阴性对照；生产上ELISA检测为p27阳性的样品；作为阳性对照的K亚群病毒；A、B、J亚群病毒。
试验方法：按照实施例1的检测方法，分别对各个样本进行扩增，并分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定对比。
检测结果：生产上经ELISA检测为p27阳性的样品中，K亚群病毒均能扩出目的片段，A、B、J亚群病毒和生产上分离的其它亚群病毒均不能扩出目的片段(如图2)。
实施例3灵敏度验证
样本采用：阴性对照；K亚群禽白血病病毒。
试验方法：按照实施例1的检测方法提取K亚群禽白血病病毒样本RNA，测定RNA浓度，并将RNA进行10倍倍比稀释，分别对各个稀释度RNA进行扩增，并分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定对比。
检测结果参见图3：样本RNA浓度为95.07ng/μl,样本在未稀释和10-1、10-2、10-3稀释度均能扩增出目的片段，且扩增产物浓度依次降低。样本在10-4稀释度不能扩增出目的片段。
实施例4重复性验证
样本采用：阴性对照；K亚群禽白血病病毒1；K亚群禽白血病病毒2。
试验方法：按照实施例1的检测方法提取K亚群病毒1和K亚群病毒2样本RNA，分别对病毒1和病毒2样本以及病毒1和病毒2的重复样本进行扩增，并分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定对比。
检测结果参见图4：病毒1样本和病毒1重复样本均能扩增出目的片段，病毒2和病毒2重复样本均能扩增出目的片段，表明该方法具有较好的重复性。
实施例5检测时间的对比
对K亚群禽白血病进行鉴定，使用本发明所需检测时间约2.5～3h，包括核酸抽提、RT-PCR和电泳等操作过程；使用env基因测序方法鉴定所需时间约48～72h，包括核酸抽提、RT-PCR、电泳和PCR产物送到测序公司测序等操作过程。本发明方法操作简单、环境要求低，一般企业均可自行实施，节省了成本和时间。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 温氏食品集团股份有限公司
<120> K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法
<130> CNP201810130
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagggaacct ttggatta 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagcgtgtca atgctcc 17
<210> 3
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagggaacct ttggattaca tgggccaacc gtacaggcca aacggatttc tgcctctcta 60
cacagtcagc cacctcccct tttcaaacat gtttgatagg tatcccgtcc cctatttccg 120
aaggtgattt taggggatac gtctctgata attgcaccac cttgggaact gaccggttag 180
tctcgtcagc cgacattacc ggcggccctg acaacagcac caccctcact tatcgaaagg 240
tttcatgctt gctgtcaaag ctgaatgtcc ctatgtggga tgagccaccg gaactacagc 300
tgctcggttc ccagtctctc cctaacatta ctaatattgc tcagatctct ggcgtagccg 360
ggggatgcgt agctttcggc ccccggagca ttgacacgct t 401

Claims (5)

1.一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物，其特征在于，所述检测引物序列为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物检测K亚群禽白血病病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法为非疾病诊断目的；包括如下操作：
(1)RNA模板制备；
(2)扩增目的片段；扩增目的条带大小为401bp；
(3)电泳鉴定扩增产物。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中扩增体系为：
Figure FDA0003191627680000011
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中扩增程序为：逆转录：50℃30min；预变性：94℃5min；扩增30个循环；后延伸：72℃10min。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述扩增30个循环包括：变性：94℃30sec；退火：56℃30sec；延伸：72℃30sec。
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