CN109338012A - K亚群禽白血病病毒rt-pcr检测引物及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测技术领域,具体涉及一种K亚群禽白血病病毒RT‑PCR检测引物及检测方法。本发明所述引物为:ALVKF:CAGGGAACCTTTGGATTA;ALVKR:AAGCGTGTCAATGCTCC。本发明的K亚群禽白血病病毒RT‑PCR检测方法,包括如下操作:(1)RNA模板制备;(2)扩增目的片段;(3)电泳鉴定扩增产物。本发明的引物特异性高,且扩展片段较短,整个PCR鉴定过程可以在2~2.5h内完成,不需经过测序就能快速鉴定出K亚群禽白血病病毒,为临床K亚群禽白血病的诊断节约大量时间。本发明方法操作简单,使用的仪器普通实验容易配置,检测费用低,便于临床推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域,具体涉及一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法。
背景技术
我国鸡群中主要流行A、B和J亚群禽白血病,K亚群禽白血病是近年来才从中国地方品种鸡中分离的一个新的亚群。目前生产上主要通过血浆病毒分离和ELISA技术鉴定禽白血病病毒,但该方法不能确定病毒亚群。A、B、J亚群病毒可通过特异性引物进行PCR鉴定,而K亚群必须经过禽白血病病毒通用引物扩增、测序和序列分析才能鉴定,耗费较长时间,给K亚群病毒的快速鉴别带来不便。
目前已有两篇关于K亚群禽白血病病毒检测相关的专利。专利1(申请号:CN201710093589.8)公开了K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒。专利2(申请号:CN201810074475.3)公开一种K亚群禽白血病病毒检测试剂盒,涉及病毒荧光定量PCR检测技术领域。
专利1(申请号:CN201710093589.8)和专利2(申请号:CN201810074475.3)公开了K亚群禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度较高,但是该方法需要使用荧光定量PCR仪等精密仪器设备,检测试剂和耗材费用较高,在普通实验环境下容易污染,不便于在养殖现场推广应用。
发明内容
鉴于此,有必要针对上述问题提供一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物,所述检测引物序列为:
ALVKF:CAGGGAACCTTTGGATTA;
ALVKR:AAGCGTGTCAATGCTCC。
进一步的,所示引物扩增的基因片段属于env基因。禽白血病病毒基因组的编码区含有3个编码基因,从5’端到3’端依次为gag、pol和env基因,形成三个大的开放阅读框。其中gag基因和pol基因都相对比较保守,无法区分不同亚群的禽白血病病毒,而env基因与病毒的抗原性、组织亲嗜性、毒力以及亚群特异性密切相关。
进一步的,本发明所需扩增的片段长度为401bp。
一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测方法,包括如下操作:
(1)RNA模板制备;
(2)扩增目的片段;
(3)电泳鉴定扩增产物。
进一步的,所述步骤(2)中扩增体系为:
进一步的,所述步骤(2)中扩增程序为:逆转录:50℃30min;预变性:94℃5min;扩增30个循环;后延伸:72℃10min。
进一步的,所述扩增30个循环包括:变性:94℃30sec;退火:56℃30sec;延伸:72℃30sec。
本发明有益效果:
该引物特异性高,且扩展片段较短,整个PCR鉴定过程可以在2~2.5h内完成,不需经过测序就能快速鉴定出K亚群禽白血病病毒,为临床K亚群禽白血病的诊断节约大量时间。相较于现有技术的其他方法(如gp85等,长度较短,不适合进行RT-PCR,或者对实验环境要求较高,不适用于临床推广)该方法操作简单,使用的仪器普通实验容易配置,所用试剂配置的所需环境普通实验室能提供,检测费用低,有利于临床推广应用。
附图说明
图1.PCR方法的建立,其中M:2000Marker,1:阴性对照,2:K亚群禽白血病病毒。
图2PCR特异性验证,其中M:2000bp Marker;1:阴性对照;2~15:生产上ELISA检测为p27阳性的样品;16:作为阳性对照的K亚群病毒;17~19分别为A、B、J亚群病毒。其中量带上的深色部分是由于样本浓度较大,扩增出的产物浓度也较大引起的。
图3.PCR灵敏度验证,其中M:2000bp Marker;1:K亚群病毒核酸未稀释;2~5分别为K亚群病毒核酸10-1、10-2、10-3、10-4稀释度;6:阴性对照。其中量带上的深色部分是由于样本浓度较大,扩增出的产物浓度也较大引起的。
图4.PCR重复性验证,其中M:2000bp Marker;1:K亚群病毒1;2:K亚群病毒1重复样品;3:K亚群病毒2;4:K亚群病毒2重复样品;5:阴性对照。其中量带上的深色部分是由于样本浓度较大,扩增出的产物浓度也较大引起的。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果,现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是,本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1本发明的K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法
1试验材料
1.1主要试剂与仪器
AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(Cat No.:AP-MN-BF-VNA-250),TaKaRaPrimeScript 0ne step RT-PCR Kit Ver.2(TaKaRa Code:DRR055A),Thermo高速低温离心机,Thermo PCR仪,电泳仪。
1.2毒株
临床通过病毒分离和ELISA检测鉴定的禽白血病病毒,临床鉴定的A、B、J和K亚群禽白血病病毒。
1.3引物设计
根据K亚群病毒GD14LZ株序列(GenBank:KU605774.1)的env基因设计一对引物如下表,扩增部分基因片段,目的条带预期大小为401bp。若扩增出目的片段,即可判定为K亚群禽白血病病毒。
预期所扩增出的目的序列为:
CAGGGAACCTTTGGATTACATGGGCCAACCGTACAGGCCAAACGGATTTCTGCCTCTCTACACAGTCAGCCACCTCCCCTTTTCAAACATGTTTGATAGGTATCCCGTCCCCTATTTCCGAAGGTGATTTTAGGGGATACGTCTCTGATAATTGCACCACCTTGGGAACTGACCGGTTAGTCTCGTCAGCCGACATTACCGGCGGCCCTGACAACAGCACCACCCTCACTTATCGAAAGGTTTCATGCTTGCTGTCAAAGCTGAATGTCCCTATGTGGGATGAGCCACCGGAACTACAGCTGCTCGGTTCCCAGTCTCTCCCTAACATTACTAATATTGCTCAGATCTCTGGCGTAGCCGGGGGATGCGTAGCTTTCGGCCCCCGGAGCATTGACACGCTT。
2试验方法
2.1 RNA模板制备(样本RNA提取)
使用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(Cat No.:AP-MN-BF-VNA-250)提取病毒RNA,-70℃保存。
2.2 PCR反应扩增目的片段
反应体系:使用TaKaRa PrimeScript 0ne step RT-PCR Kit Ver.2(TaKaRaCode:DRR055A)PCR试剂盒,反应体系为50μl体系,具体如下:
反应条件:逆转录:50℃30min;预变性:94℃5min;扩增30个循环(包括:变性:94℃30sec;退火:56℃30sec;延伸:72℃30sec);后延伸:72℃10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3实验结果
经琼脂糖凝胶电泳鉴定,K亚群禽白血病病毒可扩出符合预期大小的目的条带(图1)。
实施例2特异性验证
样本采用:阴性对照;生产上ELISA检测为p27阳性的样品;作为阳性对照的K亚群病毒;A、B、J亚群病毒。
试验方法:按照实施例1的检测方法,分别对各个样本进行扩增,并分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定对比。
检测结果:生产上经ELISA检测为p27阳性的样品中,K亚群病毒均能扩出目的片段,A、B、J亚群病毒和生产上分离的其它亚群病毒均不能扩出目的片段(如图2)。
实施例3灵敏度验证
样本采用:阴性对照;K亚群禽白血病病毒。
试验方法:按照实施例1的检测方法提取K亚群禽白血病病毒样本RNA,测定RNA浓度,并将RNA进行10倍倍比稀释,分别对各个稀释度RNA进行扩增,并分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定对比。
检测结果参见图3:样本RNA浓度为95.07ng/μl,样本在未稀释和10-1、10-2、10-3稀释度均能扩增出目的片段,且扩增产物浓度依次降低。样本在10-4稀释度不能扩增出目的片段。
实施例4重复性验证
样本采用:阴性对照;K亚群禽白血病病毒1;K亚群禽白血病病毒2。
试验方法:按照实施例1的检测方法提取K亚群病毒1和K亚群病毒2样本RNA,分别对病毒1和病毒2样本以及病毒1和病毒2的重复样本进行扩增,并分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定对比。
检测结果参见图4:病毒1样本和病毒1重复样本均能扩增出目的片段,病毒2和病毒2重复样本均能扩增出目的片段,表明该方法具有较好的重复性。
实施例5检测时间的对比
对K亚群禽白血病进行鉴定,使用本发明所需检测时间约2.5~3h,包括核酸抽提、RT-PCR和电泳等操作过程;使用env基因测序方法鉴定所需时间约48~72h,包括核酸抽提、RT-PCR、电泳和PCR产物送到测序公司测序等操作过程。本发明方法操作简单、环境要求低,一般企业均可自行实施,节省了成本和时间。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物,其特征在于,所述检测引物序列为:
ALVKF:CAGGGAACCTTTGGATTA;
ALVKR:AAGCGTGTCAATGCTCC。
2.根据权利要求1所述的检测引物,其特征在于,所述引物扩增的基因片段为env基因。
3.根据权利要求2所述的检测引物,其特征在于,本发明所需扩增的片段长度为401bp。
4.一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测方法,其特征在于,包括如下操作:
(1)RNA模板制备;
(2)扩增目的片段;
(3)电泳鉴定扩增产物。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中扩增体系为:
6.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(2)中扩增程序为:逆转录:50℃30min;预变性:94℃5min;扩增30个循环;后延伸:72℃10min。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述扩增30个循环包括:变性:94℃30sec;退火:56℃30sec;延伸:72℃30sec。
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