CN109338012A - K亚群禽白血病病毒rt-pcr检测引物及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种K亚群禽白血病病毒RT‑PCR检测引物及检测方法。本发明所述引物为：ALVKF：CAGGGAACCTTTGGATTA；ALVKR：AAGCGTGTCAATGCTCC。本发明的K亚群禽白血病病毒RT‑PCR检测方法，包括如下操作：(1)RNA模板制备；(2)扩增目的片段；(3)电泳鉴定扩增产物。本发明的引物特异性高，且扩展片段较短，整个PCR鉴定过程可以在2～2.5h内完成，不需经过测序就能快速鉴定出K亚群禽白血病病毒，为临床K亚群禽白血病的诊断节约大量时间。本发明方法操作简单，使用的仪器普通实验容易配置，检测费用低，便于临床推广应用。

Description

K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法。
背景技术
我国鸡群中主要流行A、B和J亚群禽白血病，K亚群禽白血病是近年来才从中国地方品种鸡中分离的一个新的亚群。目前生产上主要通过血浆病毒分离和ELISA技术鉴定禽白血病病毒，但该方法不能确定病毒亚群。A、B、J亚群病毒可通过特异性引物进行PCR鉴定，而K亚群必须经过禽白血病病毒通用引物扩增、测序和序列分析才能鉴定，耗费较长时间，给K亚群病毒的快速鉴别带来不便。
目前已有两篇关于K亚群禽白血病病毒检测相关的专利。专利1(申请号：CN201710093589.8)公开了K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒。专利2(申请号：CN201810074475.3)公开一种K亚群禽白血病病毒检测试剂盒，涉及病毒荧光定量PCR检测技术领域。
专利1(申请号：CN201710093589.8)和专利2(申请号：CN201810074475.3)公开了K亚群禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法，该方法检测灵敏度较高，但是该方法需要使用荧光定量PCR仪等精密仪器设备，检测试剂和耗材费用较高，在普通实验环境下容易污染，不便于在养殖现场推广应用。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物，所述检测引物序列为：
ALVKF：CAGGGAACCTTTGGATTA；
ALVKR：AAGCGTGTCAATGCTCC。
进一步的，所示引物扩增的基因片段属于env基因。禽白血病病毒基因组的编码区含有3个编码基因，从5’端到3’端依次为gag、pol和env基因，形成三个大的开放阅读框。其中gag基因和pol基因都相对比较保守，无法区分不同亚群的禽白血病病毒，而env基因与病毒的抗原性、组织亲嗜性、毒力以及亚群特异性密切相关。
进一步的，本发明所需扩增的片段长度为401bp。
一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测方法，包括如下操作：
(1)RNA模板制备；
(2)扩增目的片段；
(3)电泳鉴定扩增产物。
进一步的，所述步骤(2)中扩增体系为：
进一步的，所述步骤(2)中扩增程序为：逆转录：50℃30min；预变性：94℃5min；扩增30个循环；后延伸：72℃10min。
进一步的，所述扩增30个循环包括：变性：94℃30sec；退火：56℃30sec；延伸：72℃30sec。
本发明有益效果：
该引物特异性高，且扩展片段较短，整个PCR鉴定过程可以在2～2.5h内完成，不需经过测序就能快速鉴定出K亚群禽白血病病毒，为临床K亚群禽白血病的诊断节约大量时间。相较于现有技术的其他方法(如gp85等，长度较短，不适合进行RT-PCR，或者对实验环境要求较高，不适用于临床推广)该方法操作简单，使用的仪器普通实验容易配置，所用试剂配置的所需环境普通实验室能提供，检测费用低，有利于临床推广应用。
附图说明
图1.PCR方法的建立，其中M：2000Marker，1：阴性对照，2：K亚群禽白血病病毒。
图2PCR特异性验证，其中M：2000bp Marker；1：阴性对照；2～15：生产上ELISA检测为p27阳性的样品；16：作为阳性对照的K亚群病毒；17～19分别为A、B、J亚群病毒。其中量带上的深色部分是由于样本浓度较大，扩增出的产物浓度也较大引起的。
图3.PCR灵敏度验证，其中M：2000bp Marker；1：K亚群病毒核酸未稀释；2～5分别为K亚群病毒核酸10-1、10-2、10-3、10-4稀释度；6：阴性对照。其中量带上的深色部分是由于样本浓度较大，扩增出的产物浓度也较大引起的。
图4.PCR重复性验证，其中M：2000bp Marker；1：K亚群病毒1；2：K亚群病毒1重复样品；3：K亚群病毒2；4：K亚群病毒2重复样品；5：阴性对照。其中量带上的深色部分是由于样本浓度较大，扩增出的产物浓度也较大引起的。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1本发明的K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物及检测方法
1试验材料
1.1主要试剂与仪器
AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(Cat No.：AP-MN-BF-VNA-250)，TaKaRaPrimeScript 0ne step RT-PCR Kit Ver.2(TaKaRa Code:DRR055A)，Thermo高速低温离心机，Thermo PCR仪，电泳仪。
1.2毒株
临床通过病毒分离和ELISA检测鉴定的禽白血病病毒，临床鉴定的A、B、J和K亚群禽白血病病毒。
1.3引物设计
根据K亚群病毒GD14LZ株序列(GenBank：KU605774.1)的env基因设计一对引物如下表，扩增部分基因片段，目的条带预期大小为401bp。若扩增出目的片段，即可判定为K亚群禽白血病病毒。
预期所扩增出的目的序列为：
CAGGGAACCTTTGGATTACATGGGCCAACCGTACAGGCCAAACGGATTTCTGCCTCTCTACACAGTCAGCCACCTCCCCTTTTCAAACATGTTTGATAGGTATCCCGTCCCCTATTTCCGAAGGTGATTTTAGGGGATACGTCTCTGATAATTGCACCACCTTGGGAACTGACCGGTTAGTCTCGTCAGCCGACATTACCGGCGGCCCTGACAACAGCACCACCCTCACTTATCGAAAGGTTTCATGCTTGCTGTCAAAGCTGAATGTCCCTATGTGGGATGAGCCACCGGAACTACAGCTGCTCGGTTCCCAGTCTCTCCCTAACATTACTAATATTGCTCAGATCTCTGGCGTAGCCGGGGGATGCGTAGCTTTCGGCCCCCGGAGCATTGACACGCTT。
2试验方法
2.1 RNA模板制备(样本RNA提取)
使用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(Cat No.：AP-MN-BF-VNA-250)提取病毒RNA，-70℃保存。
2.2 PCR反应扩增目的片段
反应体系：使用TaKaRa PrimeScript 0ne step RT-PCR Kit Ver.2(TaKaRaCode:DRR055A)PCR试剂盒，反应体系为50μl体系，具体如下：
反应条件：逆转录：50℃30min；预变性：94℃5min；扩增30个循环(包括：变性：94℃30sec；退火：56℃30sec；延伸：72℃30sec)；后延伸：72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3实验结果
经琼脂糖凝胶电泳鉴定，K亚群禽白血病病毒可扩出符合预期大小的目的条带(图1)。
实施例2特异性验证
样本采用：阴性对照；生产上ELISA检测为p27阳性的样品；作为阳性对照的K亚群病毒；A、B、J亚群病毒。
试验方法：按照实施例1的检测方法，分别对各个样本进行扩增，并分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定对比。
检测结果：生产上经ELISA检测为p27阳性的样品中，K亚群病毒均能扩出目的片段，A、B、J亚群病毒和生产上分离的其它亚群病毒均不能扩出目的片段(如图2)。
实施例3灵敏度验证
样本采用：阴性对照；K亚群禽白血病病毒。
试验方法：按照实施例1的检测方法提取K亚群禽白血病病毒样本RNA，测定RNA浓度，并将RNA进行10倍倍比稀释，分别对各个稀释度RNA进行扩增，并分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定对比。
检测结果参见图3：样本RNA浓度为95.07ng/μl,样本在未稀释和10-1、10-2、10-3稀释度均能扩增出目的片段，且扩增产物浓度依次降低。样本在10-4稀释度不能扩增出目的片段。
实施例4重复性验证
样本采用：阴性对照；K亚群禽白血病病毒1；K亚群禽白血病病毒2。
试验方法：按照实施例1的检测方法提取K亚群病毒1和K亚群病毒2样本RNA，分别对病毒1和病毒2样本以及病毒1和病毒2的重复样本进行扩增，并分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定对比。
检测结果参见图4：病毒1样本和病毒1重复样本均能扩增出目的片段，病毒2和病毒2重复样本均能扩增出目的片段，表明该方法具有较好的重复性。
实施例5检测时间的对比
对K亚群禽白血病进行鉴定，使用本发明所需检测时间约2.5～3h，包括核酸抽提、RT-PCR和电泳等操作过程；使用env基因测序方法鉴定所需时间约48～72h，包括核酸抽提、RT-PCR、电泳和PCR产物送到测序公司测序等操作过程。本发明方法操作简单、环境要求低，一般企业均可自行实施，节省了成本和时间。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测引物，其特征在于，所述检测引物序列为：
ALVKF：CAGGGAACCTTTGGATTA；
ALVKR：AAGCGTGTCAATGCTCC。
2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于，所述引物扩增的基因片段为env基因。
3.根据权利要求2所述的检测引物，其特征在于，本发明所需扩增的片段长度为401bp。
4.一种K亚群禽白血病病毒RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下操作：
(1)RNA模板制备；
(2)扩增目的片段；
(3)电泳鉴定扩增产物。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中扩增体系为：
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中扩增程序为：逆转录：50℃30min；预变性：94℃5min；扩增30个循环；后延伸：72℃10min。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述扩增30个循环包括：变性：94℃30sec；退火：56℃30sec；延伸：72℃30sec。
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