CN102827933B - 一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法；试剂盒的试剂包括：DNA提取液，松材线虫核酸恒温扩增反应液，阳性对照和阴性对照；其中，阳性对照为含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，阴性对照为无菌双蒸水。该试剂盒利用核酸恒温扩增检测松材线虫，灵敏度可在每个反应体系中检出100拷贝；经过重复实验，检测结果无显著性差异，具有良好的重复性；且对样本的检测仅仅需要2h就能完成，大大缩短检测时间；同时本试剂盒只需要1人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费；可以满足快速检测松材线虫的要求，具有很好的实用性。

Description

一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及松材线虫的检测方法，具体涉及一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法。

背景技术

松材线虫病又称松树萎蔫病。是松树的一种毁灭性流行病。在我国松褐天牛(Monochamus alternatus)是它的主要传媒昆虫。致病力强，寄主死亡速度快；一旦发生，治理难度大。松树感染松材线虫病40天即可死亡，受害林分从松树发病到整片松林毁灭只需3-5年的时间，且传播蔓延迅速。它不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生态环境，对我国丰富的松林资源构成严重威胁。自1982年发现以来，快速扩散，对我国南方数百万公顷的松林构成毁灭性威胁。目前仍无有效的防治办法，被称为松树的“癌症”。国内外均将该病列为重要的植物检疫对象。

目前松材线虫的检验方法主要是选取木片或木屑，加水浸泡24小时，取下部浸泡液离心，取其沉淀液置于解剖镜下，对照松材线虫的形态特征进行检查鉴定，该方法检测时间长，对操作人员有一定专业要求。因此迫切需要种，快速、简便、准确检测松材线虫的方法。

在中国专利申请200710092787.9中，公开了一种松材线虫分子检测快速制样方法，是专门针对对林业影响巨大的松材线虫而建立起的快速制样的方法。该方法直接提取疫木中松材线虫DNA，配合PCR技术，可以检测出1.5g木屑中的1条松材线虫，时间仅需要3h，效果稳定可靠，但其仪器比较昂贵。

在中国专利申请200810134583.1中，公开了一种交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用，其特点是针对靶基因的6个区域设计6种（3对：分别为1对交叉扩整引物、1对剥离引物、1对检测引物）特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶（如，但不限于，Gst DNA聚合酶）在恒温条件即可完成核酸扩增反应。不需要模板的变性、多次温度循环等过程。

在中国专利申请200610003429.1中，公开了一种核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途，将特异性抗体A吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；将另一种特异性抗体—无色抗B抗体固定于膜上形成检测线；待测核酸进行扩增时，将所使用的探针或是引物用A抗原或B抗原标记，形成扩增物、探针、引物、抗原A、抗原B的复合物，将该复合物与吸附有色颗粒的抗体A结合，得到的该有色颗粒复合物在溶液中通过毛细血管现象眼纤维膜向上流动只抗体B检测条时，与线条上的抗体B结合，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条。在中国专利申请200610109620.4中，公开了一种全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，在其中使用了中国专利申请200610003429.1的试纸条，达到了全封闭检测的效果。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种定性检测松材线虫的试剂盒，使其具有重复性好、快速、灵敏度高等特点。本发明的另一目的是提供一种利用上述试剂盒定性检测松材线虫的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种定性检测松材线虫的试剂盒，试剂包括：DNA提取液，松材线虫核酸恒温扩增反应液，阳性对照和阴性对照；其中，阳性对照为含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，阴性对照为无菌双蒸水；

所述的松材线虫核酸恒温扩增反应液的组成为：0.1~0.2μmol正向外围引物，0.1~0.2μmol反向外围引物，0.1~0.5μmol正向交叉引物，0.1~0.5μmol反向交叉引物，0.1~0.5μmol正向探针，0.1~0.5μmol反向探针，1~6mmol MgSO₄，0.2~0.4mmol dNTPs溶液，6~10U GstDNA聚合酶，2μL 10×Thermol buffer，无菌双蒸水补足到16μL。

所述的正向外围引物序列为5’-TCCTCACCTGGCTCTT-3’；反向外围引物序列为’-CTAAACTCCCCATCTC-3’；两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针5-biotin- TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向3’端异硫氰酸荧光素（FitC）标记探针5- AGGCGTTCACCAGT- FITC；扩增交叉引物分别为：反向交叉引物5’- GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC -3’，正向交叉引物5’-GACGTCGCATGTAGC-3’。

所述的10×Thermol buffer的组分为：20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM (NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄、质量浓度为0.1%的Triton X-100，pH8.8；

所述的含有松材线虫BxS1基因的DNA片段为长193bp的基因序列，具体序列如SEQ ID NO:7（TCCTCACCTGGCTCTTCGGCCGTTCCGCTTTGGCCTTATTCCGACGTCGCATGTAGCCGTGGATGGAATGCCGACCCCTGGCCGGTCTTTTCGGCCACACCACCTTCAACGAGGCGTTCACCAGTTGGCCGTCCCGGTTCTCGACCACAGAGTACGATGGAGGAGTAATGGTTGACTGAGATGGGGAGTTTAG）所示。

所述的含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，由以下方法制备：

（1）利用正向外围引物和反向外围引物，以松材线虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因的PCR扩增产物；

（2）纯化PCR扩增产物；

（3）将纯化后的扩增产物通过质粒转染试剂盒构建质粒；

（4）抽提质粒，定量并稀释至10⁵拷贝，-20℃保存。

试剂盒定性检测松材线虫的方法，包括以下步骤：

a）用DNA提取液从待检测的标本中提取DNA；

b）以提取得到的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板，在60～65℃下扩增反应60～65min；

c）将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15min以后判读结果。

步骤b）中，63℃下扩增反应60min。

本发明提供了利用核酸恒温扩增检测松材线虫的试剂盒，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg²⁺浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了松材线虫核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出100拷贝，可以满足快速检测松材线虫的要求。

有益效果：与现有技术相比，本发明的定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法，利用核酸恒温扩增检测松材线虫，对不同的反应条件进行了优化，使其灵敏度可在每个反应体系中检出100拷贝。并通过重复实验，证实检测结果无显著性差异，具有良好的重复性。且对样本的检测仅仅需要2h就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。可以满足快速检测松材线虫的要求，具有很好的实用性。

附图说明

图1是利用实施例1试剂盒检测松材线虫的特异性的实验结果图；图中，1、2、3、4依次为拟松材线虫、松材线虫、阳性对照、阴性对照。

图2是利用实施例1试剂盒检测松材线虫的灵敏度的实验结果图；图中，1-6依次为松材线虫质粒10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10拷贝、阳性对照（10⁵拷贝）、阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

定性检测松材线虫的试剂盒，组成如下：

（1）DNA提取试剂：可以为常规的市售DNA提取试剂，优选使用杭州优思达生物技术有限公司的无仪器核酸提取试剂盒。

（2）松材线虫核酸恒温扩增反应液：两条外围引物（各0.1μmol），两条探针(各0.5μmol)，两条交叉引物(各0.5μmol)，10×Thermolbuffer，MgSO₄(6mmol)，dNTPs溶液(0.4mmol)，Bst DNA聚合酶(10U)，无菌双蒸水补足16μL。

其中：正向外围引物序列为5’-TCCTCACCTGGCTCTT-3’；反向外围引物序列为’-CTAAACTCCCCATCTC-3’；两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针5-biotin- TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向3’端异硫氰酸荧光素(FitC)标记探针5- AGGCGTTCACCAGT- FITC；扩增交叉引物分别为：反向交叉引物5’- GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC -3’，正向交叉引物5’-GACGTCGCATGTAGC-3’。

10×Thermol buffer的组成：20mM Tris-HCl (pH 8.8)，10mMKCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1%Triton X-100。

以上所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。

（3）阳性对照：含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒。BxS1基因DNA片段序列如SEQ ID NO:7所示。

阳性对照的制备步骤：利用两条外围引物和以松材线虫的基因组DNA模板进行PCR扩增获得目的基因；用Promega公司的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过Promega公司的T-easy质粒试剂盒，构建含有目的基因片段的质粒；用分光光度计测A₂₈₀定量并稀释至10⁵拷贝，-20℃保存。

（4）阴性对照：无菌双蒸水。

实施例2

用实施例1的试剂盒定性检测松材线虫，具体方法为：

（1）用DNA提取试剂盒从待检测的标本中提取DNA。其具体方案参见DNA提取试剂盒使用说明。

（2）取4μL标本DNA作为模板加入到装有16μL松材线虫核酸恒温扩增反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入等体积的阳性对照模板和阴性对照模板，在63℃进行扩增反应60min。

（3）将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置（试纸条，参见CN1888902A或者CN1811447A）中进行检测，15min以后判读结果。当样本中含有松材线虫核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。

反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要2h就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。

实施例3

用实施例1的试剂盒检测松材线虫的专一性。

按照实施例2的方法检测松材线虫、拟松材线虫和阳性对照品；结果如图1。从图1测试结果可见，用本发明试剂盒检测松材线虫核酸具有很强的专一性。

实施例4

用实施例1试剂盒检测松材线虫核酸的灵敏度。

先提取含松材线虫基因组DNA，然后用两条外围扩增引物利用PCR扩增目的基因片段（具体序列如SEQ ID NO:7所示）；再将扩增出来的基因片段用V-easy载体构建含有目的片段的质粒，对其进行定量。并对定量后的质粒，按照浓度梯度稀释至浓度为10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10拷贝，采用实施例2的方法来确定实施例1试剂盒用于检测松材线虫核酸的灵敏度。

结果如图2所示，图中1-6分别表示10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10拷贝、阳性对照和阴性对照，可以发现该试剂盒可在反应体系中检出10²拷贝的质粒稀释液，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测松材线虫的要求。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京林业大学

 

<120>  一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法

 

<130>  100

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  16

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  正向外围引物序列

 

<400>  1

tcctcacctg gctctt                                                     16

 

 

<210>  2

<211>  16

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  反向外围引物序列

 

<400>  2

ctaaactccc catctc                                                     16

 

 

<210>  3

<211>  16

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  正向5'端Biotin标记探针序列

 

<400>  3

tcttttcggc cacacc                                                     16

 

 

<210>  4

<211>  14

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  正向3'端异硫氰酸荧光素（FitC）标记探针序列

 

<400>  4

aggcgttcaccagt                                                       14

 

 

<210>  5

<211>  33

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  反向交叉引物序列

 

<400>  5

gtcttttcgg ccacaccact gtggtcgaga acc                                  33

 

 

<210>  6

<211>  15

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  正向交叉引物

 

<400>  6

gacgtcgcatgtagc                                                      15

 

 

<210>  7

<211>  193

<212>  DNA

<213>  Bursaphelenchus xylophilus

 

<400>  7

tcctcacctg gctcttcggc cgttccgctt tggccttatt ccgacgtcgc atgtagccgt     60

 

ggatggaatg ccgacccctg gccggtcttt tcggccacac caccttcaac gaggcgttca    120

 

ccagttggcc gtcccggttc tcgaccacag agtacgatgg aggagtaatg gttgactgag    180

 

atggggagtttag                                                       193

 

Claims (6)

1.一种定性检测松材线虫的试剂盒，其特征在于，试剂包括：DNA提取液，松材线虫核酸恒温扩增反应液，阳性对照和阴性对照；其中，阳性对照为含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，阴性对照为无菌双蒸水；

所述的松材线虫核酸恒温扩增反应液的组成为：0.1～0.2μmol正向外围引物，0.1～0.2μmol反向外围引物，0.1～0.5μmol正向交叉引物，0.1～0.5μmol反向交叉引物，0.1～0.5μmol正向探针，0.1～0.5μmol反向探针，1～6mmol MgSO₄，0.2～0.4mmol dNTPs溶液，6～10U Gst DNA聚合酶，2μL10×Thermol buffer，无菌双蒸水补足到16μL；

所述的正向外围引物序列为5’-TCCTCACCTGGCTCTT-3’；反向外围引物序列为’-CTAAACTCCCCATCTC-3’；两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针5-biotin-TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向3’端异硫氰酸荧光素（FitC）标记探针5-AGGCGTTCACCAGT-FITC；扩增交叉引物分别为：反向交叉引物5’-GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC-3’，正向交叉引物5’-GACGTCGCATGTAGC-3’。

2.根据权利要求1所述的定性检测松材线虫的试剂盒，其特征在于：所述的10×Thermolbuffer的组分为：20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄、质量浓度为0.1%的Triton X-100，pH8.8。

3.根据权利要求1所述的定性检测松材线虫的试剂盒，其特征在于：所述的含有松材线虫BxS1基因的DNA片段为长193bp的基因序列，具体序列如SEQ ID NO:7所示。

4.根据权利要求1或3所述的松材线虫检测试剂盒，其特征在于：所述的含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，由以下方法制备：

（1）利用正向外围引物和反向外围引物，以松材线虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因的PCR扩增产物；

（2）纯化PCR扩增产物；

（3）将纯化后的扩增产物通过质粒转染试剂盒构建质粒；

（4）抽提质粒，定量并稀释至10⁵拷贝，-20℃保存。

5.使用权利要求1所述的试剂盒定性检测松材线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）用DNA提取液从待检测的标本中提取DNA；

b）以提取得到的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板，在60～65℃下扩增反应60～65min；

c）将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15min以后判读结果。

6.根据权利要求5所述的定性检测松材线虫的方法，其特征在于：步骤b）中，63℃下扩增反应60min。

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