CN110079607B

CN110079607B - 一种引物组、检测血液样品种属的方法及应用

Info

Publication number: CN110079607B
Application number: CN201910268882.2A
Authority: CN
Inventors: 闫亚平; 张鑫
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Xi'an Haitaike Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN110079607A

Abstract

本发明公开了一种引物组、检测血液样品种属的方法及应用。基于NOTCH2NL基因的种属特异性，建立一种疑似人源痕量未知样品种属快速鉴定体系，提高案件侦破效率。包括利用DNA快速提取试剂提取血液中的DNA，然后加入环介导等温扩增指示剂和引物组采用环介导等温扩增技术进行血液样品种属检测，所述的环介导等温扩增指示剂包括非瑟酮、穗花杉双黄酮或盐酸小檗碱，增加了反应结果的色差，使结果易于区分。本发明选择的基因序列仅存在于人类中，提高了检测特异性，同时对引物进行筛选，提出了一种检测效率和特异性均高于现有检测方法的检测血液样品种属的方法；能够充分溶解已经凝固的血痕，并快速释放DNA，操作简单，DNA损失较少。

Description

一种引物组、检测血液样品种属的方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种引物组、检测血液样品种属的方法及应用。

背景技术

血痕是最常见的物证检材，是法医检验中最常遇到和最重要的检验项目，约占法医物证检验的80％左右。凡在现场、致伤物、衣物上发现的可疑血液或血痕均涉及血痕检验。当可疑斑痕确定为血痕后，应快速确定其种属来源，明确血痕是动物血还是人血。

目前，血痕种属鉴定有许多方法，包括血清学方法、细胞学方法、分子生物学方法及生物化学方法。其中，血清学的沉淀反应最为简便，但容易被其他抗原干扰检测结果，尤其是混合样品检验中常常造成误检。而分子生物学方法最为准确，如聚合酶链式反应(PCR)，但是由于凝血块DNA提取效率较低和分子生物学方法操作较为繁琐、对设备和检测人员技能要求较高、痕量样品中检测灵敏度低等原因，限制了该方法在血痕检测方面的应用。环介导等温扩增技术对于血痕种属鉴定着有简单、快速、特异性强等优点。但是，目前环介导等温扩增技术所用的指示剂主要为钙黄绿素、羟基萘酚蓝、SYBR Green等，现有的指示剂存在区分度低，或存在背景噪音大，或对扩增反应具有一定抑制作用等缺点。

可见，目前对于血液样品种属并没有一种快速高效且准确的检测方法，有必要开发一种检测血液样品种属的方法，解决凝血块DNA提取效率较低，分子生物学方法操作较为繁琐、痕量样品中检测灵敏度低的技术问题。。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种引物组、检测血液样品种属的方法及应用。解决凝血块DNA提取效率较低，分子生物学方法操作较为繁琐、痕量样品中检测灵敏度低的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种引物组，包括引物FIP、BIP、LF、LB、F3和B3，其中F3：TGTGACATTCCAGGACACTG

B3：GGCAGTTGCACTCAAAAGTG

FIP：CTGGCCTGTGAAGCCCTGAAGCCAGCATGGTGGCATCTG

BIP：GACAGCCTGTATGTGCCCTGTTCACCAGTCTGCCGACAG

LF：CTGGTAGGAACCAGGCAGGTT

LB：GCACCCTCGCCTTGTGTCAAT。

一种检测血液样品种属的方法，包括利用DNA快速提取试剂提取血液中的DNA，然后加入环介导等温扩增指示剂和引物组采用环介导等温扩增技术进行血液样品种属检测，所述的环介导等温扩增指示剂包括非瑟酮、穗花杉双黄酮或盐酸小檗碱，所述的引物组为本发明所述的引物组。

进一步地，所述的盐酸小檗碱的浓度为50～150μM，非瑟酮的浓度为50～100μM，穗花杉双黄酮的浓度为100～150μM，所述的环介导等温扩增指示剂中的溶剂DMSO的浓度为2.5％～5％(v/v)。

进一步地，所述DNA快速提取试剂包括溶解液和裂解液；

所述的溶解液包括纳豆激酶、纤溶酶、腺苷和EDTA的混合溶液，所述的纳豆激酶浓度为100～1000FU/mL，所述的纤溶酶浓度为1～10U/mL，所述的腺苷浓度为5～30μg/mL，所述的EDTA浓度为0.1～10mM；

所述的裂解液包括蛋白酶K，Triton X-100和CaCl₂的混合溶液，所述的蛋白酶K浓度为2～20mg/mL，所述的Triton X-100占裂解液的0.1％～1％，其中“％”是指以体积计的质量百分数，所述的CaCl₂浓度为1～10mM。

进一步地，具体包括以下步骤：

步骤一：在血痕样品中加入DNA快速提取试剂，然后在金属浴条件下孵育得到DNA模板；

步骤二：向步骤一得到的DNA模板中加入缓冲溶液、Tween-20、dNTP、Bst DNAPolymerase、环介导等温扩增指示剂和引物混合物，得到待检测血液样品，然后进行血液样品种属检测。

具体地，所述的引物混合物包括本发明所述的引物组，所述的引物FIP浓度为20μM，所述的BIP浓度为20μM，所述的引物LF浓度为10μM，所述的引物LB浓度为10μM，所述的引物F3浓度为5μM，所述的引物B3浓度为5μM。

具体地，所述的缓冲液由甜菜碱、KCl、Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄和MgSO₄按照物质的量浓度比为400～600:25～50:5～10:5～10:3～4配置而成。

具体地，所述的Tris-HCl的pH值为6.8～8.8。

优选的，包括以下步骤：

步骤一：在血痕样品中加入0.1mL溶解液，在温度为37℃的金属浴中孵育20min，然后加入0.1mL裂解液在温度为65℃的金属浴中孵育20min，再在温度为100℃的金属浴中加热5min得到DNA模板；

步骤二：取1～2μL步骤一得到的DNA模板，向其中加入缓冲溶液、0.1％的Tween-20、1.4mM的dNTP、8U的Bst DNA Polymerase、1μl的环介导等温扩增指示剂和1μL的引物混合物，得到待检测血液样品，进行血液样品种属检测；

所述的DNA快速提取试剂包括溶解液和裂解液，所述溶解液包括500FU/mL的纳豆激酶、10U/mL的纤溶酶、30μg/mL的腺苷浓度和1mM的EDTA，所述裂解液包括10mg/mL的蛋白酶K、1％的Triton X-100和5mM的CaCl₂；

所述的环介导等温扩增指示剂包括浓度为2.5mM的盐酸小檗碱、1.875mM的非瑟酮或3.0mM的穗花杉双黄酮，所述环介导等温扩增指示剂的溶剂为DMSO，所述DMSO的浓度为2.5～5％(v/v)；

所述的缓冲溶液包括浓度为20mM的Tris-HCl、浓度为50mM的KCl、浓度为10mM(NH₄)₂SO₄和浓度为8mM MgSO₄。

本发明所述的引物组或本发明所述的检测血液样品种属的方法用于检测血液样品种属的应用。

本发明与现有技术相比具有以下的有益效果：

(1)本发明选择的基因序列仅存在于人类中，提高了检测特异性，同时对引物进行筛选，提出了一种检测效率和特异性均高于现有检测方法的检测血液样品种属的方法；

(2)本发明以非瑟酮、穗花杉双黄酮或盐酸小檗碱等作为环介导等温扩增指示剂，增加了反应结果的色差，使结果易于区分；

(3)能够充分溶解已经凝固的血痕，并快速释放DNA，操作简单，DNA损失较少。

附图说明

图1是不同引物组的特异性及扩增效率比较(1P、2P、3P、4P和5P分别为5组引物的阳性扩增曲线，2N和3N分别为第2组合第3组引物的非特异性扩增曲线)；

图2是人源DNA检测结果；

图3是不同溶解液和裂解液提取DNA对比；

图4是人血和其他动物血液混合后提取的DNA电泳图(1:人血；2:人血+狗血；3:人血+猪血；4:人血+牛血；5:人血+羊血；6:人血+鱼血；7:人血+猫血；8:狗血；9:猪血；10:牛血；11:羊血；12:鱼血；13:猫血；M:1kb DNA Ladder)；

图5是人血和其他动物血液混合后的扩增结果(1:人血；2:人血+狗血；3:人血+猪血；4:人血+牛血；5:人血+羊血；6:人血+鱼血；7:人血+猫血；8:狗血；9:猪血；10:牛血；11:羊血；12:鱼血；13:猫血；14:ddH₂O)；

图6是1％(A)和5％(B)DMSO作为盐酸小檗碱溶剂条件下的扩增结果；

图7是不同指示剂条件下的扩增结果(A-非瑟酮；B-穗花杉双黄酮)；

以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。

具体实施方式

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

本发明主要是提供一种引物组、检测血液样品种属的方法及应用，并基于NOTCH2NL基因的种属特异性，利用环介导等温扩增技术的实用性和高灵敏度，建立一种疑似人源痕量未知样品种属快速鉴定体系，提高案件侦破效率。Human Notch homolog 2N-terminal-like protein(NOTCH2NL)是一种能够延迟皮质干细胞分化为神经元，从而导致大脑在整个发育过程中产生更多的神经元的基因。目前，该基因仅存在于人类细胞中，因此，选择NOTCH2NL基因作为检测靶基因，具有极高的种属特异性。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种能够在恒温65℃条件下进行体外扩增的技术，具有简单、快速、特异性强等优点。该技术灵敏度高于普通PCR技术10-100倍，且不依赖任何特殊仪器即可完成扩增及结果分析，检测成本及实用性均优于PCR技术。

本发明中用到的实验药品与试剂具体信息如下：

生化试剂与生物学试剂：Bst DNA Polymerase(购自NEB公司)；dNTP(购自北京百奥莱博生物科技有限公司)；蛋白酶K(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)；硅烷基磁珠(购自天根生化科技(北京)有限公司)纳豆激酶(购自西安绿天生物技术有限公司)；纤溶酶(购自西安瑞盈生物科技有限公司)；穗花杉双黄酮、盐酸小檗碱、非瑟酮、腺苷(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；

普通试剂：Tris、EDTA、NaCl、NaOH、HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、Tween-20、DMSO、Triton X-100、甜菜碱等常规化学试剂，均从西安晶博生物科技有限公司购买，为进口分装产品。

溶液与缓冲液：除穗花杉双黄酮、盐酸小檗碱、非瑟酮用DMSO溶解外，其余所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。

DNA快速提取试剂：DNA快速提取试剂包括溶解液和裂解液。溶解液包括纳豆激酶、纤溶酶、腺苷和EDTA，其中，纳豆激酶浓度为100～1000FU/mL，纤溶酶浓度为1～10U/mL，腺苷浓度为5～30μg/mL，EDTA浓度为0.1～10mM；裂解液包括蛋白酶K，Triton X-100和CaCl₂，其中，蛋白酶K浓度为2～20mg/mL，Triton X-100占裂解液的0.1％～1％，其中“％”是指以体积计的质量百分数，CaCl₂浓度为1～10mM。

血痕样品的处理：血痕为一次性采血针(施莱)采集的指腹血滴在干净的玻璃片上晾干30min形成。取1cm×0.5cm大小的血痕装入1.5mL离心管中，加入0.1mL上述配置的溶解液，在37℃金属浴条件下孵育20min，然后加入上述配置的0.1mL裂解液，在温度为65℃金属浴中孵育20min，然后100℃金属浴加热5min，使蛋白酶K及其他可能残留的蛋白质失活，作为模板用于血痕的种属鉴定。

环介导等温扩增技术指示剂的制备：配置浓度为1.25～2.5mM的非瑟酮、浓度为2.5～3.75mM的穗花杉双黄酮或浓度为1.25～3.75mM的盐酸小檗碱，使用时每25μl反应体系加入1μl上述指示剂。即最终实际用量：盐酸小檗碱的加入量为50～150μM，穗花杉双黄酮的最终浓度为100～150μM，非瑟酮的加入量为5～100μM。环介导等温扩增技术指示剂的溶剂为DMSO，DMSO存在增加指示剂的溶解度、降低背景噪音、降低核酸Tm值，更易变性，提高特异性的作用。

引物的处理：将江苏金唯智生物科技有限公司合成的人源特异性引物用去离子水配制成FIP和BIP浓度均为20μM、LF和LB浓度均为10μM、F3和B3浓度均为5μM的25×引物混合物(25×是指该浓度为工作浓度的25倍，使用时每25μL反应体系加入1μL即为工作浓度)。所用引物序列如下：

F3：TGTGACATTCCAGGACACTG

B3：GGCAGTTGCACTCAAAAGTG

FIP：CTGGCCTGTGAAGCCCTGAAGCCAGCATGGTGGCATCTG

BIP：GACAGCCTGTATGTGCCCTGTTCACCAGTCTGCCGACAG

LF：CTGGTAGGAACCAGGCAGGTT

LB：GCACCCTCGCCTTGTGTCAAT

血液样品的检测：最终检测体系总体积为25μL，包含甜菜碱、KCl、Tris-HCl(pH＝8.8)、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、Tween-20。其中，缓冲液由甜菜碱、KCl、Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄按照物质的量浓度比为400～600:25～50:5～10:5～10:3～4混合而成，Tris-HCl的pH值为6.8～8.8；此外，反应体系还包括1.4mM的dNTP、8U Bst DNA Polymerase、1μL的2.5mM盐酸小檗碱母液、1μL的25×引物混合物以及2μL的DNA模板，然后加入去离子水补足至25μL。

血液样品的检测过程为：将环介导等温扩增试剂和缓冲液混合，加入1μL指示剂、1μL引物、1～2μL待测DNA模板(即核酸)，然后置于63～67℃恒温条件下反应30～60min，再升温至83～87℃反应5min即可；最后将反应管置于500nm蓝光灯下观察，亮绿色为阳性，砖红色为阴性。

或将反应体系置于实时荧光定量PCR仪上，设置扩增条件为：65℃、45sec扩增；65℃、15sec收集荧光；共60个循环，然后85℃、5min后终止反应，有扩增曲线的为阳性，无扩增曲线的为阴性，同时可以通过扩增曲线对样品进行定量分析。

实施例1：遵从上述技术方案，本实施例给出引物组的具体筛选方法及筛选结果。

根据NCBI数据库的查询，人源特异性基因Homo sapiens notch 2 N-terminallike A(NOTCH2NLA)保守序列为：GenBank:BC019835.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/BC019835.1？report＝genbank&log$＝nuclalign&blast_rank＝3&RID＝2DR4CPJ6014)，以人类口腔拭子提取的DNA作为模板，并在http://primerexplorer.jp/e/网站设计引物，其中5组引物序列如表1所示，引物合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成。比较其扩增效率和特异性。最终获得一组特异性和扩增效率最佳的引物组。

表1各组引物编号及引物序列

对上述5组引物组的特异性及扩增效率进行比较，将其置于实时荧光定量PCR仪上，设置扩增条件为：65℃、45sec扩增；65℃、15sec收集荧光；共60个循环，然后85℃、5min后终止反应。每组引物设置两个阳性组，两个阴性组，对上述5组引物组的特异性及扩增效率进行比较。结果如图1所示，第1组引物能够在12-13min检测到人源DNA，扩增效率明显高于其他几组，且无非特异性扩增。第2组和第3组引物能够较快速的检测到人源DNA，但在30min以后均出现了不同程度的非特异性扩增，而第4组合第5组虽然未出现非特异性扩增，但扩增效率明显低于第1组引物。因此选用第一组引物作为最佳引物组。

实施例2：本实施例给出检测血液样品种属的方法，包括以下步骤：

DNA快速提取试剂包括溶解液和裂解液，溶解液包括500FU/mL的纳豆激酶、10U/mL的纤溶酶、30μg/mL的腺苷浓度和1mM的EDTA，所述裂解液包括10mg/mL的蛋白酶K、1％的Triton X-100和5mM的CaCl₂；其中“％”是指以体积计的质量百分数。具体操作步骤：称取250mg纳豆激酶、10mg纤溶酶并加入8mL去离子水，然后加入100μL 300μg/mL腺苷和50μL0.5M EDTA，并加离子水定容至10mL，即得溶解液。量取100mg蛋白酶K，100μL Triton X-100，500μL 0.1M CaCl₂溶液，并用去离子水定容至10mL，即得裂解液。

血痕为一次性采血针(施莱)采集的指腹血滴在干净的玻璃片上晾干30min形成。取1cm×0.5cm大小的血痕装入1.5mL离心管中，加入0.1mL的上述配置的溶解液，在37℃金属浴条件下孵育20min，然后加入0.1mL的裂解液，在温度为65℃金属浴中孵育20min，然后100℃金属浴加热5min，使蛋白酶K及其他可能残留的蛋白质失活，作为模板用于血痕的种属鉴定。

步骤二：取1～2μL步骤一得到的DNA模板，向其加入缓冲溶液、Tween-20、dNTP、BstDNA Polymerase、环介导等温扩增指示剂和引物混合物，得到待检测血液样品，然后进行血液样品种属检测。

此实施例的环介导等温扩增指示剂为盐酸小檗碱，精确称取6.30mg盐酸小檗碱，溶于10mL 2.5％DMSO溶液中，即为2.5mM盐酸小檗碱母液(25倍的储存液)。最终每25μL待检测体系中加入1μL盐酸小檗碱母液，体系中盐酸小檗碱的最终浓度为100μM。将环介导等温扩增试剂和缓冲液混合，混合后的体系包含20mM Tris-HCl(pH＝8.8)、50mM KCl、10mM(NH4)₂SO₄、8mM MgSO₄、0.1％Tween-20、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTP、8U Bst DNA Polymerase，然后加入1μL指示剂、1μL的引物然后置于63～67℃恒温条件下反应30～60min，再升温至83～87℃反应5min即可；最后将反应管置于470nm波长的蓝光灯下观察。结果如图2所示，阳性(P)结果可以观察到亮绿色荧光，阴性(N)结果无荧光。阳性样品与阴性样品区别极为明显，不会因主观判断导致误判。此外，当体系中盐酸小檗碱的加入量为50μM或150μM时，均能明显区别阳性结果与阴性结果。

引物的处理步骤为：将江苏金唯智生物科技有限公司合成的人源特异性引物用去离子水配制成FIP和BIP浓度均为20μM、LF和LB浓度均为10μM、F3和B3浓度均为5μM的25×引物混合物。所用引物序列如下：

F3：TGTGACATTCCAGGACACTG

B3：GGCAGTTGCACTCAAAAGTG

FIP：CTGGCCTGTGAAGCCCTGAAGCCAGCATGGTGGCATCTG

BIP：GACAGCCTGTATGTGCCCTGTTCACCAGTCTGCCGACAG

LF：CTGGTAGGAACCAGGCAGGTT

LB：GCACCCTCGCCTTGTGTCAAT

实施例3

本实施例公开了DNA快速提取试剂中不同组份的溶解液和裂解液的含量对DNA提取效率的影响。

取100μL新鲜静脉血(和血痕的来源操作方法一样)，置于不加抗凝剂的采血管中，静置，待血液凝固。加入200μL不同组份的溶解液，37℃孵育20min。然后加入200μL裂解液，65℃孵育20min，最后经过100℃变性处理5min。然后经过硅烷基磁珠提取上清中的DNA，并用购自天根等生物公司的TE缓冲液定容至50μL。通过Nanodrop2000紫外-可见分光光度计测量DNA浓度，不同组份的溶解液和裂解液组成及所提取的DNA浓度如表1所示。

表1.不同组份的溶解液和裂解液对DNA提取效率的影响

不同组份的溶解液和裂解液提取相同体积血液的DNA结果如图3所示，其中，标号M为DNA电泳的参照组，购自天根生物公司。当纳豆激酶、纤溶酶和腺苷浓度较低时(A组)，血凝块不能完全溶解，导致DNA得率显著降低。当血凝块充分溶解后，经过蛋白酶K和TritonX-100裂解细胞提取DNA，而蛋白酶的活性可以被CaCl₂激活，提高酶活10倍以上，因此，当裂解液中的CaCl₂浓度需高于溶解液中的EDTA浓度时，DNA得率最高，如图3中标号E所示，即包含纳豆激酶浓度为500FU/mL、纤溶酶浓度为10U/mL、腺苷浓度为30μg/mL和EDTA浓度为1mM的溶解液，包含蛋白酶K浓度为10mg/mL，Triton X-100含量为1％，其中“％”是指以体积计的质量百分数，CaCl₂浓度为5mM的裂解液，溶解液和裂解液组成DNA快速提取试剂；可看出同样血液样品量的条件下E组的DNA得率明显高于其他组合的DNA得率。

实施例4

为检验凝血块DNA提取方法在有其他种属动物血液干扰情况下的提取效率及检测效果，本实施例将人血分别与狗、猪、牛、羊、鱼、猫的血液进行混合，提取其DNA，并进行扩增，鉴定其是否包含人源DNA。种属鉴定以人血作为阳性对照，单纯动物血液作为阴性对照。结果如图4和图5所示，从图4可以看出所提基因组较为完整，未出现降解现象，图5中1为单纯人血的DNA扩增结果，2-7为人血和不同血液的DNA混合物，均能检测到人源的DNA；而8-13只包含动物血液样品，均未检测到荧光信号，说明该引物组具有较高的特异性，且不受动物血液的干扰，可以用于案发现场血痕的快速种属鉴定。

实施例5：

本实施例与实施例2的区别在于使用5％(v/v)DMSO作为指示剂的溶剂，结果如图6(B)所示，阳性结果为亮绿色荧光，阴性结果基本上观察不到荧光信号，阳性结果与阴性结果区别极为明显，辨识度极高。

对比例1

本对比例与实施例2的区别在于使用1％(v/v)DMSO作为指示剂的溶剂，结果如图6(A)所示，阳性结果为亮绿色荧光，阴性虽然也能观察到淡绿色荧光，但区别不如2.5～5％明显。阳性结果与阴性结果区别较为明显，辨识度较高。

实施例6：

本实施例与实施例1的区别在于称取19.38mg穗花杉双黄酮，溶于10mL2.5％(v/v)DMSO溶液中，即为3.0mM穗花杉双黄酮母液，每25μL反应体系加入1μL，体系中穗花杉双黄酮的最终浓度为120μM。结果如图7(A)所示，以穗花杉双黄酮作为指示剂，阳性结果与阴性结果的区别极为显著，不易造成主观误判。此外，当体系中穗花杉双黄酮的加入量为100μM或150μM时，均能明显区别阳性结果与阴性结果。

实施例7

本实施例7与实施例1的区别在于称取4.02mg非瑟酮，溶于10mL 2.5％(v/v)DMSO溶液中，即为1.875mM非瑟酮母液，每25μL反应体系加入1μL，体系中非瑟酮的最终浓度为75μM。结果如图7(B)所示，以非瑟酮作为指示剂，阳性结果与阴性结果区别极为显著，不易造成主观误判。此外，当体系中非瑟酮的加入量为50μM或100μM时，均能明显区别阳性结果与阴性结果。

Claims

1.一种检测血液样品种属的方法，其特征在于，包括利用DNA快速提取试剂提取血液中的DNA，然后加入环介导等温扩增指示剂和引物组采用环介导等温扩增技术进行血液样品种属检测，所述的环介导等温扩增指示剂包括非瑟酮、穗花杉双黄酮或盐酸小檗碱；所述的引物组包括引物FIP、BIP、LF、LB、F3和B3，其中F3：TGTGACATTCCAGGACACTG

B3：GGCAGTTGCACTCAAAAGTG

FIP：CTGGCCTGTGAAGCCCTGAAGCCAGCATGGTGGCATCTG

BIP：GACAGCCTGTATGTGCCCTGTTCACCAGTCTGCCGACAG

LF：CTGGTAGGAACCAGGCAGGTT

LB：GCACCCTCGCCTTGTGTCAAT；

所述DNA快速提取试剂包括溶解液和裂解液；

所述的溶解液包括纳豆激酶、纤溶酶、腺苷和EDTA的混合溶液，所述的纳豆激酶浓度为100~1000FU/mL，所述的纤溶酶浓度为1~10U/mL，所述的腺苷浓度为5~30μg/mL，所述的EDTA浓度为0.1~10mM；

所述的裂解液包括蛋白酶K，Triton X-100和CaCl₂的混合溶液，所述的蛋白酶K浓度为2~20mg/mL，所述的Triton X-100占裂解液的0.1%~1%，其中“%”是指以体积计的质量百分数，所述的CaCl₂浓度为1~10mM。

2.根据权利要求1所述的检测血液样品种属的方法，其特征在于，所述的盐酸小檗碱的浓度为50~150μM，非瑟酮的浓度为50~100μM，穗花杉双黄酮的浓度为100~150μM，所述的环介导等温扩增指示剂中的溶剂DMSO的浓度为2.5%~5%v/v。

3.根据权利要求1所述的检测血液样品种属的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的检测血液样品种属的方法，其特征在于，所述的引物混合物包括权利要求1所述的引物组，所述的引物FIP浓度为20μM，所述的BIP浓度为20μM，所述的引物LF浓度为10μM，所述的引物LB浓度为10μM，所述的引物F3浓度为5μM，所述的引物B3浓度为5μM。

5.根据权利要求3所述的检测血液样品种属的方法，其特征在于，所述的缓冲溶液由甜菜碱、KCl、Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄和MgSO₄按照物质的量浓度比为400~600:25~50:5~10:5~10:3~4配置而成。

6.根据权利要求5所述的检测血液样品种属的方法，其特征在于，所述的Tris-HCl的pH值为6.8~8.8。

7.根据权利要求3所述的检测血液样品种属的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤二：取1~2μL步骤一得到的DNA模板，向其中加入缓冲溶液、0.1%的Tween-20、1.4mM的dNTP、8U的Bst DNA Polymerase、1μl的环介导等温扩增指示剂和1μL的引物混合物，得到待检测血液样品，进行血液样品种属检测；

所述的DNA快速提取试剂包括溶解液和裂解液，所述溶解液包括500FU/mL的纳豆激酶、10U/mL的纤溶酶、30μg/mL的腺苷浓度和1mM的EDTA，所述裂解液包括10mg/mL的蛋白酶K、1%的Triton X-100和5mM的CaCl₂；

所述的环介导等温扩增指示剂包括浓度为2.5mM的盐酸小檗碱、1.875mM的非瑟酮或3.0mM的穗花杉双黄酮，所述环介导等温扩增指示剂的溶剂为DMSO，所述DMSO的浓度为2.5~5%v/v；

所述的缓冲溶液包括浓度为20mM的Tris-HCl、浓度为50mM的KCl、浓度为10mM (NH₄)₂SO₄和浓度为8mM MgSO₄。

8.权利要求1-7任一权利要求所述的检测血液样品种属的方法用于检测血液样品种属的应用。