CN116622909A - 一种猫疱疹病毒i型的恒温扩增检测试剂及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测试剂及检测方法，包括以下步骤：S1，提取猫疱疹病毒I型的核酸；S2，选取猫疱疹病毒的特异性保守TK基因作为靶标基因，采用增强型重组酶依赖扩增技术对提取的核酸进行扩增；S3，对扩增的产物进行胶体金免疫层析检测。该检测方法的检测特异性及灵敏度高、检测结果重复性好、操作简便，检测速度快。

Description

一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测试剂及检测方法
技术领域
本发明涉及一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测试剂及检测方法，属于猫疱疹病毒的检测技术领域。
背景技术
猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1，FHV-1)是猫病毒性鼻气管炎(Felineviral rhinotracheitis，FVR)又称猫传染性鼻气管炎的病原体。猫病毒性鼻气管炎是一种以上呼吸道症状为主的急性、高度接触性传染病，可引起体温升高、精神沉郁、厌食、咳嗽、打喷嚏等临床症状。FHV-1是一种DNA病毒。其主要感染猫，其中2～6月龄幼猫易感，其发病率可达100％，病死率20％～50％，幼猫在发生本病时，如发生继发感染，死亡率可高达70％，成年猫病死率达20-30％，是目前已知最严重的猫呼吸道疾病之一。自1957年R.A.Crandell等人首次从患有呼吸道疾病的仔猫中分离到FHV-1后。世界各国相继分离到该病毒。近年来，我国出现较多疑似病例，并从其眼、鼻分泌物中分离到该病毒。FHV-1具有高度的种属特异性，只会感染猫及猫科动物，主要侵害幼猫，有时也引起其他猫科动物如印度豹、美洲狮、东北虎发生感染，对野生动物保护造成严重危害。
FVR的传染源主要是患病动物和带毒动物。几乎所有临床康复或耐过猫都是危险的传染源，它们长期带毒，对疾病的流行起重要作用。近年来，随着人们生活水平不断提高，宠物猫数量增加，我国FHV-1发病率呈现逐年上升趋势，多次发现临床疑似病例。猫疱疹病毒1型的检测是否关键，但现有的检测方法存在诸多不足。临床检测方面，兽医主要仍然依靠传统检测方法，检测结果不准确。实验室检测方面，则主要靠病毒分离和血清学方法，虽有较准确的结果，但周期长、费用高。分子生物学检测大多基于PCR检测技术，因具有基因组特定片段的靶向作用，能证实黏膜拭子中含有病毒DNA片段，故具备快速、敏感、特异性好等特点，成为实验室检测该病原的“金标准”。但PCR检测时需要较昂贵的实时定量PCR仪及其它相应配套设备；同时，需配备专门的PCR实验室及专业操作人员，另外，其检测结果需1～2h才能获得，无论成本还是应用场景均受到了较大限制。
因此，急需一种快速、敏感度高、特异性好、操作简单、成本低的猫疱疹病毒1型的检测方法。
发明内容
本发明提供了一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测试剂及检测方法，可以有效解决上述问题
本发明是这样实现的：
一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测方法，包括以下步骤：
S1，提取猫疱疹病毒I型的核酸；
S2，选取猫疱疹病毒的特异性保守TK基因作为靶标基因，采用增强型重组酶依赖扩增技术对提取的核酸进行扩增；
S3，对扩增的产物进行胶体金免疫层析检测。
作为进一步改进的，步骤S1中，所述提取采用核酸释放剂，所述核酸释放剂包括5mM～100mM盐酸、10mM～100mM甲酸、50～200mM NaCl、5mM～75mM海藻糖、0.01％～20％(w/v)NP-40。
作为进一步改进的，步骤S2中，增强型重组酶依赖扩增技术的上游引物序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；下游引物选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6。
作为进一步改进的，步骤S2中，所述增强型重组酶依赖扩增技术的试剂包括冻干试剂A试剂和冻干试剂B试剂；所述A试剂包括50mM～200mM Tris-HCl缓冲液、5mM～30mMMgAc、1％～10％(w/v)PEG20K、5mM～50mM ATP、200mM～500mM dNTPs、10mM～50mM四水磷酸肌酸钠、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水；所述B试剂包括0.4μM上游引物、0.4μM下游引物、0.03μM荧光探针、100ng/μL～300ng/μL肌酸激酶CKM、200ng/μL～400ng/μL重组酶UvsX、20ng/μL～80ng/μL重组酶加载因子UvsY、200ng/μL～500ng/μL单链结合蛋白GP32、50ng/μL～250ng/μL脱氧核糖核酸聚合酶、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水。
作为进一步改进的，所述增强型重组酶依赖扩增技术的反应温度为35～50℃。
作为进一步改进的，所述增强型重组酶依赖扩增技术的反应时间为10～30min。
一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测试剂，包括冻干试剂A试剂和冻干试剂B试剂；所述A试剂包括50mM～200mM Tris-HCl缓冲液、5mM～30mM MgAc、1％～10％(w/v)PEG20K、5mM～50mM ATP、200mM～500mM dNTPs、10mM～50mM四水磷酸肌酸钠、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水；所述B试剂包括0.4μM上游引物、0.4μM下游引物、0.03μM荧光探针、100ng/μL～300ng/μL肌酸激酶CKM、200ng/μL～400ng/μL重组酶UvsX、20ng/μL～80ng/μL重组酶加载因子UvsY、200ng/μL～500ng/μL单链结合蛋白GP32、50ng/μL～250ng/μL脱氧核糖核酸聚合酶、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水。本发明的检测试剂为冻干试剂，因此，总体运输成本及保存成本低大大降低。
作为进一步改进的，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。
一种核酸释放剂，包括5mM～100mM盐酸、10mM～100mM甲酸、50～200mM NaCl、5mM～75mM海藻糖、0.01％～20％(w/v)NP-40。
一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测引物组，包括上游引物和下游引物，上游引物选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；下游引物选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
本发明的有益效果是：
本发明选取了猫疱疹病毒1型的特异性保守基因作为靶标基因，提供一种特异性设计的检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组，结合冻干、恒温扩增、免疫层析等多种技术，建立一种FHV-1特异的冻干型恒温扩增可视化快速检测试剂及检测方法。对猫疱疹病毒进行检测的方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性。本发明选用的猫疱疹病毒TK基因引物是经过大量试验筛选获得的，特异性好，与猫的其他病毒包括猫瘟病毒、猫细小病毒、猫杯状病毒等均无交叉反应。eRDA-nfo能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平；本发明所建立的检测方法可检测到20拷贝数/反应的FHV病毒。
本发明用一步法快速样本核酸释放剂提取，仅需1～2min，结合增强型重组恒温扩增技术eRDA，该技术仅需15min就能完成核酸扩增，同时结果的判读用试纸条，层析5min就能得到结果。即本产品的仅需25min就能完成从样本进、结果出的完整检测，比普通qPCR(3～4h拿到结果)和LAMP技术(60min出结果)快速，不依赖于实验室设备，可实现现在快速检测，整个检测FHV-1过程，从样本处理到结果检测仅需20-30min。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是实施例1提供的一步法样本核酸快速释放剂与天根手工磁珠提取试剂盒提取效果对比图。
图2是实施例2提供的FHV eRDA凝胶检测体系的建立及引物筛选结果图(以F1-F3为上游引物，下游引物为R1-R3，筛选引物对(5000copies/rxn，NTC)。
图3是实施例3提供的FHV-1冻干检测试剂小球的冻干性状(分别放置西林瓶及分装至PCR八联管)。
图4是实施例3提供的FHV-1冻干检测试剂反应温度优化测试结果图。
图5是实施例3提供的FHV-1冻干检测试剂反应时间优化测试结果图。
图6是实施例4提供的FHV-1冻干检测试剂灵敏度测试结果图。
图7是实施例4提供的FHV-1冻干检测试剂特异性测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测方法，包括以下步骤：
S1，提取猫疱疹病毒I型的核酸；
S2，选取猫疱疹病毒的特异性保守TK基因作为靶标基因，采用增强型重组酶依赖扩增技术对提取的核酸进行扩增；
S3，对扩增的产物进行胶体金免疫层析检测。
作为进一步改进的，步骤S1中，所述提取采用核酸释放剂，所述核酸释放剂包括5mM～100mM盐酸、10mM～100mM甲酸、50～200mM NaCl、5mM～75mM海藻糖、0.01％～20％(w/v)NP-40。此核酸释放剂区别于市面上常规核酸提取为磁珠自动提取试剂，不需要复杂的提取过程及昂贵的仪器耗材，其组分主要为为免提裂解液，操作简单：仅需即将猫眼鼻后拭子样本浸入提取管中，搅拌15圈，取出拭子，盖上提取管盖，室温静置1～2min即可完成样本核酸的释放提取。
作为进一步改进的，步骤S2中，增强型重组酶依赖扩增技术的上游引物序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；下游引物选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6。
作为进一步改进的，步骤S2中，所述增强型重组酶依赖扩增技术的试剂包括冻干试剂A试剂和冻干试剂B试剂；所述A试剂包括50mM～200mM Tris-HCl缓冲液、5mM～30mMMgAc、1％～10％(w/v)PEG20K、5mM～50mM ATP、200mM～500mM dNTPs、10mM～50mM四水磷酸肌酸钠、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水；所述B试剂包括0.4μM上游引物、0.4μM下游引物、0.03μM荧光探针、100ng/μL～300ng/μL肌酸激酶CKM、200ng/μL～400ng/μL重组酶UvsX、20ng/μL～80ng/μL重组酶加载因子UvsY、200ng/μL～500ng/μL单链结合蛋白GP32、50ng/μL～250ng/μL脱氧核糖核酸聚合酶、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水。
本发明使用的恒温扩增技术为一种新型的恒温扩增技术——增强型重组酶依赖扩增技术(enhanced recombinase dependent amplification，eRDA)。该技术是通过选取了猫疱疹病毒的特异性保守TK基因作为靶标基因序列，设计特异性的eRDA引物对及带有FITC(FAM)羧基荧光素修饰的探针。该技术原理是在恒温条件下，引物利用重组酶的链置换功能，高效、特异性地与模板互补配对结合；随后，在DNA聚合酶作用下，实现模板的快速扩增。本发明使用的原理对仪器要求低，扩增只需35～50℃的简单恒温条件下，同时仅需10～30min就能完成扩增。
本发明的检测技术为一种基于胶体金免疫层析的可视化快速检测，其原理是：带有FAM羧基荧光素标记的探针，在重组酶的链置换功能下特异性的结合扩增模板，并在nfo酶的作用下特异性的从探针的四氢呋喃(THF)位点剪切，使得探针3’OH释放，变为特异性的引物，与修饰有生物素Biotin的引物反应，产生含有FAM-Biotin的复合体，可与免疫层析试纸条上的检测线T线的抗FAM-胶体金抗体进行特异性结合，显示红色条带。未发生特异性扩增则不会形成FAM-生物素的复合体，则不会在T线上显示红色条带，整个层析过程5min就能结束，结果可视化判读。
本发明的eRDA技术，结合核酸试纸条技术用于检测猫疱疹病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点。
作为进一步改进的，所述增强型重组酶依赖扩增技术的反应温度为35～50℃，进一步优选为35、37、40、42、45、50℃。
作为进一步改进的，所述增强型重组酶依赖扩增技术的反应时间为10～30min，进一步优选为10、15、25、30min，更优选为15min。
一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测试剂，包括冻干试剂A试剂和冻干试剂B试剂；所述A试剂包括50mM～200mM Tris-HCl缓冲液、5mM～30mM MgAc、1％～10％(w/v)PEG20K、5mM～50mM ATP、200mM～500mM dNTPs、10mM～50mM四水磷酸肌酸钠、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水；所述B试剂包括0.4μM上游引物、0.4μM下游引物、0.03μM荧光探针、100ng/μL～300ng/μL肌酸激酶CKM、200ng/μL～400ng/μL重组酶UvsX、20ng/μL～80ng/μL重组酶加载因子UvsY、200ng/μL～500ng/μL单链结合蛋白GP32、50ng/μL～250ng/μL脱氧核糖核酸聚合酶、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水。
作为进一步改进的，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。
一种核酸释放剂，包括。蛋白变性剂、表面活性剂、核酸保护剂、核酸结合剂等，本试剂舍弃了传统胍盐和SDS裂解释放核酸的方法，采用酸性裂解细胞变性蛋白法快速释放样本核酸，其核酸释放后残留物对后续检测试剂的抑制性小，所需裂解体积仅需500μL/反应。样本提取过程的简化，传统核酸提取方法包括手工柱提及仪器全自动，均基于磁珠法，整个过程操作繁琐，且需依靠核酸提取仪器，对于小样本量的宠物医院现场检测，成本较大。由于本发明对组分的优化，可实现样本核酸的快速释放。仅需将拭子样本加入核酸释放剂中搅15圈，室温放置1～2min就能完成核酸的释放及提取，产物可直接用于后续直接扩增。
一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测引物组，包括上游引物和下游引物，上游引物选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；下游引物选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。本发明通过选取猫疱疹病毒I型的保守性较高的TK基因，在其保守区域进行人工合成全基因序列及质粒，设计特异性的引物对及探针，经过筛选优化，扩增效率和灵敏度高。
实施例1
一步法快速样本核酸释放剂与天根磁珠提取试剂的对比
将全基因合成的FHV序列，导入PGEM-T easy载体得到的重组质粒，用本发明的样本核酸释放剂及天根生物有限公司的手工法磁珠提取试剂同时进行提取；将提取后的产物进行稀释后用广州华峰生物科技有限公司的猫疱疹病毒(FHV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)进行检测，结果表明样本核酸释放剂的提取效率较对比的提取试剂的效率略靠后，但是在1Ct值内，即2种提取方式效率差别不大，如图1所示。
实施例2猫疱疹病毒I型的引物探针组、冻干型恒温扩增可视化检测方法的建立\猫疱疹病毒I型eRDA引物探针的设计及优化
基因的选择及合成
本发明参考GenBank上已公布的猫疱疹病毒FHV-1基因序列，使用Vector NTI软件对下载的多序列进行比对，选择特异性高、较为保守的FHV-1TK基因328bp-482bp的碱基序列的部分片段，通过采用人工合成的基因片段，克隆入PGEM-T easy载体得到的重组质粒，作为后续研究的标准品；所述基因片段序列为：
TATCAAGCAAGATTTGCCGCACCATACCTTCTTTTACATTCCAGACTATCCACAATAACAGGATATCAGAAAGTTGTATGTGAGGAACACCCCGACGTGACCCTAATCATAGATAGACACCCTCTCGCCTCTCTGGTCTGTTTCCCACTCGCAAGATATTTTGTGGGTGATATGACTCTTGGGTCTGTACTTAGTCTAATGGCAACACTTCCACGAGAACCTCCTGGTaagcttCGACAACTACGCGTACGTCGGCCCATAGCTGTAGCTTTGCACGCTTGGAGTGTTGCTGGACGCTGAGGCTGAGGCCAGCTCCCTACGACCAGATGA(SEQ ID NO.8)。
所述的全基因序列合成及质粒制备过程均委托通用生物(安徽)股份有限公司合成。
引物的设计及合成
大量文献报导表明，不同的引物对恒温扩增的特异性和灵敏度具有一定的影响。因此，本研究针对猫疱疹病毒I型TK基因的突变率低、保守性及特异性高的特定片段，最终确定在TK基因的328bp-482bp的碱基序列之间的3个区域设计初步设计了3对引物及1条探针(引物序列如表1所示)，这些序列可以和猫疱疹病毒TK基因的相应序列特异性结合。
表1猫疱疹病毒I型eRDA引物序列
所述的引物及探针均委托福州尚亚生物有限公司合成。
引物的初步筛选及优化
引物组的筛选：用基础eRDA体系上述3对引物组成的9组引物组进行恒温扩增反应，反应产物经纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳，筛选较优引物组。9组引物组其扩增目的片段的大小分别为126bp、131bp、143bp、129bp、134bp、146bp、138bp、143bp、155bp。
结果如图2所示：F1/R2、F3/R1、F3/R3反应产物条带明亮单一、非特异条带较少。选取其中F1/R2组进行后续检测方法的建立。
冻干体系试剂体系的建立：
1)冻干体系试剂的工作液按以下试剂及浓度进行配制
表2
冻干保护剂为：2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱。
滴球及冻干：使用滴珠机以及液氮，将FHV-1可冻干试剂组分Buffer A及Buffer B分别进行滴珠制球，小球体积为20～30μL。将小球转移至西林瓶中，放入冻干机中进行冻干。
将冻干所得小球于湿度低于30％、温度低于25℃环境下，分装至PCR反应八连管中，进行真空封口包装，置于于2-8℃保存。
冻干小球试剂外观观察及检测：
肉眼观察冻干小球试剂的外形，其冻型表面平整，无明显皱缩，且与管壁贴合、容易脱落，则其冻型符合要求(见图3)。
实施例3猫疱疹病毒I型检测试剂检测试剂及方法的优化
FHV-1反应温度的优化
对冻干好的试剂在30min反应时间下优化反应温度。将克隆含有FHV-1目的基因片段的PGEM-T easy质粒作为阳性样本标准品DNA模板，取已知浓度的阳性模板，用1×TE梯度稀释至2copies/μL、1copies/μL；将冻干好的小球试剂，分别用50μL稀释后的质粒DNA模板复溶冻干小球，每个浓度各2重复，分别于37℃、40℃、42℃、45℃等4种不同温度下反应，30min后层析测试，评估100copies/rxn、50copies/rxn。结果显示，42℃反应30min的T线显色较深，效能最佳(见图4)。
FHV-1反应时间的优化
对冻干好的试剂在42℃反应温度下优化反应时间。取已知浓度的阳性模板，用1×TE梯度稀释至2copies/μL、1copies/μL；将冻干好的小球试剂，分别取50μL稀释后的质粒DNA模板复溶冻干小球，每个浓度各2重复，分别测试在42℃反应10min、15min、25min和30min，评估100copies/rxn、50copies/rxn效能情况。结果显示，42℃反应15min的效能即可达到较佳程度(见图5)。
实施例4猫疱疹病毒I型检测试剂的灵敏度、特异性评估
灵敏度测试
为检测本发明检测试剂的灵敏度，将已知浓度的FHV-1质粒DNA模板，用1×TE梯度稀释至2copies/μL、1copies/μL、0.5copies/μL、0.2copies/μL；别取50μL稀释后的质粒DNA模板复溶冻干小球，每个浓度各2重复，于42℃反应15min后进行层析测试，评估100copies/rxn、50copies/rxn、25copies/rxn、10copies/rxn效能情况。结果显示，本试剂可稳定检出25cpsies/rxn的质粒DNA(见图5)。
特异性测试
为检测本发明检测试剂的特异性，用建立的检测方法对FHV-1阳性DNA标准品与其他6种猫相关病原体，包括猫杯状病毒(FCV)、猫冠状病毒(FCoV)、猫衣原体(Cp.felis)、猫支原体(My.felis)、支气管败血波氏杆菌(B.b)、猫瘟病毒(FPV)等进行检测检测结果表明：除FHV-1的检测T线有显色，其余猫相关病原体的检测T线均未显色(见图6)。上述结果说明，本发明FHV-1冻干型恒温扩增检测试剂及方法能特异性扩增出FHV中的靶序列，而不与其他猫病原体核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂特异性好,未出现假阴性。
实施例5
本发明提供的恒温扩增、可视化检测猫疱疹病毒I型方法，具体流程如下：
步骤一：样本提取：
撕开提取管预封膜，将采集的含待测的口鼻拭子样本浸入提取管中，搅拌15圈，反复捏2-3次管底，丢弃拭子；盖上管盖，室温静置1～2min。
步骤二：样品制备：
上样：将上述提取样本提取液滴2滴(约50μL)至FHV-1冻干检测试剂中，充分混匀。
步骤三：反应：
将混匀试剂放入简易恒温仪中，42℃反应15min。
步骤四：结果检测：
反应结束后，将反应产物用层析液稀释15倍，进行试纸条检测，5min后观察结果。依据质控线(C线)和检测线(T线)的情况进行肉眼观察判读即可，判读方法如下：
a、结果为阳性:在C线和T线均有一条红色条带，表明待检样本中有猫疱疹病毒感染；
b、b、结果为阴性:仅在C线有一条红色条带，在T线没有红色条带,表明待检样本无猫疱疹病毒感染；
c、结果无效:在C线和T线均无红色条带，表明试纸条失效。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，提取猫疱疹病毒I型的核酸；
S2，选取猫疱疹病毒的特异性保守TK基因作为靶标基因，采用增强型重组酶依赖扩增技术对提取的核酸进行扩增；
S3，对扩增的产物进行胶体金免疫层析检测。
2.根据权利要求1所述的猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述提取采用核酸释放剂，所述核酸释放剂包括5mM～100mM盐酸、10mM～100mM甲酸、50～200mM NaCl、5mM～75mM海藻糖、0.01％～20％(w/v)NP-40。
3.根据权利要求1所述的猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测方法，其特征在于，步骤S2中，增强型重组酶依赖扩增技术的上游引物序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3；下游引物选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
4.根据权利要求1所述的猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述增强型重组酶依赖扩增技术的试剂包括冻干试剂A试剂和冻干试剂B试剂；所述A试剂包括50mM～200mM Tris-HCl缓冲液、5mM～30mM MgAc、1％～10％(w/v)PEG20K、5mM～50mMATP、200mM～500mM dNTPs、10mM～50mM四水磷酸肌酸钠、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水；所述B试剂包括0.4μM上游引物、0.4μM下游引物、0.03μM荧光探针、100ng/μL～300ng/μL肌酸激酶CKM、200ng/μL～400ng/μL重组酶UvsX、20ng/μL～80ng/μL重组酶加载因子UvsY、200ng/μL～500ng/μL单链结合蛋白GP32、50ng/μL～250ng/μL脱氧核糖核酸聚合酶、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水。
5.根据权利要求4所述的猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测方法，其特征在于，所述增强型重组酶依赖扩增技术的反应温度为35～50℃。
6.根据权利要求4所述的猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测方法，其特征在于，所述增强型重组酶依赖扩增技术的反应时间为10～30min。
7.一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测试剂，其特征在于，包括冻干试剂A试剂和冻干试剂B试剂；所述A试剂包括50mM～200mM Tris-HCl缓冲液、5mM～30mM MgAc、1％～10％(w/v)PEG20K、5mM～50mM ATP、200mM～500mM dNTPs、10mM～50mM四水磷酸肌酸钠、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水；所述B试剂包括0.4μM上游引物、0.4μM下游引物、0.03μM荧光探针、100ng/μL～300ng/μL肌酸激酶CKM、200ng/μL～400ng/μL重组酶UvsX、20ng/μL～80ng/μL重组酶加载因子UvsY、200ng/μL～500ng/μL单链结合蛋白GP32、50ng/μL～250ng/μL脱氧核糖核酸聚合酶、2％～40％(w/v)甘露醇、1％～30％(w/v)的海藻糖、5μM～100μM甜菜碱、DEPC水。
8.根据权利要求6所述的猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测试剂，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。
9.一种核酸释放剂，其特征在于，包括5mM～100mM盐酸、10mM～100mM甲酸、50～200mMNaCl、5mM～75mM海藻糖、0.01％～20％(w/v)NP-40。
10.一种猫疱疹病毒I型的恒温扩增检测引物组，其特征在于，包括上游引物和下游引物，上游引物选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；下游引物选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
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