CN109517929B - 用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组和试剂盒 - Google Patents

用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组和试剂盒 Download PDF

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CN109517929B CN201811570879.8A CN201811570879A CN109517929B CN 109517929 B CN109517929 B CN 109517929B CN 201811570879 A CN201811570879 A CN 201811570879A CN 109517929 B CN109517929 B CN 109517929B
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Abstract

本发明涉及用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组和试剂盒，本发明提供用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组，包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的引物。本发明进一步提供包括上述引物组的试剂盒。本发明提供的用于猪圆环病毒检测及2b和2d型分型的引物组、试剂盒和检测方法具有操作简便、成本低、检测的特异性高、灵敏度高、准确性高的优势，临床样品检测的阳性符合率达100％，适用于猪圆环病毒2b和2d型的临床检测和流行病学调查分析，具有很好的应用前景。

Description

用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组和试剂盒。
背景技术
猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)于1974年首次由德国学者Tischer在PK.15细胞培养污染物中分离得到。20世纪90年代，研究者在病猪及一些无明显临床症状的猪体内分离得到一种新型猪小环状样病毒，该病毒与Tischer在PK.15细胞培养污染物中分离的病毒的限制性酶切图谱和抗原性存在很大差别。将PK.15细胞培养污染物中分离得到的病毒命名为PCVl，而从断奶仔猪多系统衰竭综合症(Post-weaning MultisystemicWasting Syndrome，PMWS)病猪中分离的病毒命名为PCV2。PCVl对猪的致病性较低，偶尔可以引起怀孕母猪胎儿感染，造成繁殖障碍；而PCV2对猪的危害极大，可引起一系列临床症状。
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)最早于1998年发现，与PCV2相关的疾病症状最先定义为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。近年来，越来越多的疾病症状如生殖障碍、肠道疾病、呼吸道症状等确认与PCV2感染相关，给全球养猪业造成重大经济损失。血清学调查表明，猪的PCV2阳性率较高，且分布广，遍及世界各地，发病率高，6-8周龄的猪多发。PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到抑制，产生继发感染，导致严重的临床疾病。
由于PCV2感染常以亚临床感染的形式出现，较易被忽视，诸多不确定性因素给PCV2及其相关疾病的研究带来一定困难。目前，全球范围内至少鉴定出5种PCV2的基因型(PCV2a，PCV2b，PCV2c，PCV2d，PCV2e)，而关于PCV2病毒分型的研究报道较少，且2d与2b型猪圆环病毒的基因组同源性高达90％以上，分型较困难，目前尚未有猪圆环病毒2d型及2b型分型检测的相关研究报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组和试剂盒。
为实现上述目的，本发明通过对猪圆环病毒2d型和2b型的基因组序列进行比对分析，选择高度保守的核苷酸序列作为检测的靶序列，分别设计了三对检测引物，其中包括一对针对猪圆环病毒的检测引物、一对针对猪圆环病毒2d型的检测引物和一对针对猪圆环病毒2b型的检测引物。利用上述引物能够高效、特异、准确地检测猪圆环病毒，并进行猪圆环病毒的2d型和2b型的分型。
首先，本发明提供用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组，所述引物组包括如下引物：
SEQ ID NO.1：上游引物PCV-F：
5’-GAGGATTACTTCCTTGGTATTTTGG-3’；
SEQ ID NO.2：下游引物PCV-R：
5’-ATTCTTCTTGCTGGGCATGTTG-3’；
SEQ ID NO.3：上游引物PCV2d-F：
5’-GAAGTAATCGATTGTCCTATCAAGG-3’；
SEQ ID NO.4：下游引物PCV2d-R：
5’-CACAGTCAGAACGCCCTCCTG-3’；
SEQ ID NO.5：上游引物PCV2b-F：
5’-GAAGTAATCAATAGTGGAATCTAGG-3’；
SEQ ID NO.6：下游引物PCV2b-R：
5’-CAGGAGGGGGCTCAAACCCC-3’。
在此基础上，本发明提供所述引物组在制备猪圆环病毒检测试剂中的应用。
进一步地，本发明提供用于猪圆环病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括所述用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组。
为实现PCR检测，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶、阳性模板。
本发明中，所述试剂盒在用于猪圆环病毒检测和2型分型时，以待测样品的DNA为模板，利用所述引物组进行PCR扩增，根据扩增产物的条带类型判断检测结果。
所述PCR扩增的反应程序如下：94℃～98℃预变性2～10min；94℃～98℃预变性10～30s，52～60℃退火30s，72℃延伸20～60s，共25～35个循环；72℃终延伸2～10min。
所述PCR扩增的20μL反应体系包括如下组分：
Figure BDA0001915483200000031
为提高检测的特异性和准确性，本发明中，上述试剂盒在进行猪圆环病毒检测和分型时，为将猪圆环病毒的检测和2型分型分开进行，即先进行猪圆环病毒的检测，再对猪圆环病毒阳性的检测样品进行2型分型，在进行猪圆环病毒检测时，上述反应体系中的所述引物为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物；在进行2型分型时，上述反应体系中的引物为如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。
因此，上述反应体系中，所述引物为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物；或为如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。
所述反应体系中各引物的摩尔数相同。
优选地，本发明中，所述试剂盒在用于猪圆环病毒检测和2型分型时，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)利用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物的电泳条带类型判断待测样品中是否含有猪圆环病毒；
(3)以步骤(2)中鉴定的猪圆环病毒阳性的待测样品的DNA为模板，利用如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增；
(4)根据步骤(3)得到的扩增产物的电泳条带类型，判断待测样品中是否含有猪圆环病毒2b型或2d型。
根据各引物对的特性，通过对PCR反应条件的优化，进一步提高了扩增的特异性和灵敏度，上述步骤(2)的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸5min；
上述步骤(3)的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃终延伸5min。
在上述引物组和试剂盒的基础上，本发明提供检测猪圆环病毒并进行猪圆环病毒2d型和2b型分型的方法，具体包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用引物对PCV-F/PCV-R进行PCR扩增反应；
(3)将PCR扩增产物进行电泳检测，根据电泳结果判断待测样品中是否含有猪圆环病毒；
(4)以步骤(3)中检测含有猪圆环病毒的样品的DNA为模板，利用引物对PCV2d-F/PCV2d-R和PCV2b-F/PCV2b-R进行PCR扩增反应；
(5)将PCR扩增产物进行电泳检测，根据电泳结果判断待测样品中的猪圆环病毒为2b型或2d型。
上述步骤(2)的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸5min。
上述步骤(2)的PCR扩增反应体系(20μL)如下：
Figure BDA0001915483200000051
上述步骤(3)的结果判断标准为：当PCR产物在958bp处有明显条带时，则判断为对猪圆环病毒呈阳性反应，即待测样品中含有猪圆环病毒。
上述步骤(4)的PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃终延伸5min。
上述步骤(4)的PCR扩增反应体系(20μL)如下：
Figure BDA0001915483200000052
Figure BDA0001915483200000061
上述步骤(5)的结果判断标准为：当PCR产物在343bp处有明显条带，且阴性对照的扩增产物不存在该条带，则显示为对猪圆环病毒2d型呈阳性反应，即待测样品中含有2d型猪圆环病毒。当PCR产物在277bp处有明显条带，且阴性对照的扩增产物不存在该条带，则判断为对猪圆环病毒2b型呈阳性反应，即待测样品中含有2b型猪圆环病毒。
本发明还提供所述引物组或所述试剂盒在检测猪圆环病毒或猪圆环病毒2型分型中的应用。
本发明中，所述猪圆环病毒2型分型为判断猪圆环病毒2b型和猪圆环病毒2d型。
本发明的有益效果在于：本发明通过对猪圆环病毒2d和2b型的基因组比对分析，筛选高度保守序列以及差异序列，最终确定了可用于2d和2b型分型的检测靶序列，并通过筛选和序列优化设计了能够高效特异扩增该靶序列的引物组，同时根据引物和靶序列的特性，通过优化PCR反应体系和反应程序，最终实现了高效、灵敏、特异的猪圆环病毒检测及2b和2d型分型。本发明提供的用于猪圆环病毒检测及2b和2d型分型的引物组、试剂盒和检测方法具有操作简便(根据电泳条带即可判断检测结果)、成本低(无需荧光标记和特殊仪器需求)、检测的特异性高(可准确区分2b和2d型以及其它相似病毒)、灵敏度高、准确性高(临床样品检测的阳性符合率达100％)的优势，适用于猪圆环病毒2b和2d型的临床检测和流行病学调查分析，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例3中猪圆环病毒2d型检测引物的特异性分析，其中M为DNAmarker，CK为空白对照，PCV 2b为PCV 2b的基因组DNA，PCV 2d为PCV 2d的基因组DNA，+为阳性，-为阴性。
图2为本发明实施例3中猪圆环病毒2b型检测引物的特异性分析，其中M为DNAmarker，CK为空白对照，PCV 2b为PCV 2b的基因组DNA，PCV 2d为PCV 2d的基因组DNA，+为阳性，-为阴性。
图3为本发明实施例3中猪圆环病毒2d和2b型检测的引物特异性分析，其中M为DNAmarker，泳道1为采用引物PCV3-F/PCR3-R对PCV3型样本扩增的结果；泳道2为采用引物PCV2d-F/PCV2d-R对PCV3型样本扩增的结果；泳道3为采用引物PCV2b-F/PCV2b-R对PCV3型样本扩增的结果。
图4为本发明实施例4中猪圆环病毒临床样品的检测中PCV-F/PCV-R引物对的检测结果，其中，M为DNA marker，泳道1～10分别为10份病料样品，+为阳性，-为阴性。
图5为本发明实施例4中猪圆环病毒临床样品的2型分型检测结果，其中，M为DNAmarker，泳道1～10分别为10份病料样品，+为PCV 2d阳性，-为PCV 2d阴性。
图6为本发明实施例4中猪圆环病毒临床样品的2型分型检测结果，其中，M为DNAmarker，泳道1～10分别为10份病料样品，+为PCV 2b阳性，-为PCV 2b阴性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1猪圆环病毒的基因组序列分析及检测引物设计
通过对猪圆环病毒2d型和2b型的基因组序列进行比对分析(PCV2d基因组序列的NCBI accession number为JQ002671，PCV2b基因组序列的NCBI accession number为KM924367)，选择高度保守且在2d和2b型之间存在明显差异位点的CAP蛋白的核苷酸序列作为检测的靶序列。根据该靶序列设计了不同的引物，经筛选优化，确定如下三对检测引物：一对针对猪圆环病毒的检测引物(PCV-F/PCV-R)、一对针对猪圆环病毒2d型的检测引物(PCV2d-F/PCV2d-R)和一对针对猪圆环病毒2b型的检测引物(PCV2b-F/PCV2b-R)。
上述引物的序列如下：
SEQ ID NO.1：上游引物PCV-F：
5’-GAGGATTACTTCCTTGGTATTTTGG-3’；
SEQ ID NO.2：下游引物PCV-R：
5’-ATTCTTCTTGCTGGGCATGTTG-3’；
SEQ ID NO.3：上游引物PCV2d-F：
5’-GAAGTAATCGATTGTCCTATCAAGG-3’；
SEQ ID NO.4：下游引物PCV2d-R：
5’-CACAGTCAGAACGCCCTCCTG-3’；
SEQ ID NO.5：上游引物PCV2b-F：
5’-GAAGTAATCAATAGTGGAATCTAGG-3’；
SEQ ID NO.6：下游引物PCV2b-R：
5’-CAGGAGGGGGCTCAAACCCC-3’。
实施例2猪圆环病毒检测方法的建立
根据实施例1设计的检测引物，建立猪圆环病毒的检测方法。为实现更准确的猪圆环病毒2d型和2b型鉴定，首先采用PCV-F/PCV-R检测待测样品中是否含有猪圆环病毒，再利用2b和2d特异性引物鉴定猪圆环病毒2d型和2b型，检测方法具体包括如下步骤：
(1)利用DNALyse Amplification Kit(cat#CW0556S)试剂盒提取待测样品的DNA；
(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用引物对PCV-F/PCV-R进行PCR扩增反应；
(3)将PCR扩增产物进行电泳检测：取10μl PCR扩增产物，加入含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130V，25min；根据电泳结果判断待测样品中是否含有猪圆环病毒：当PCR产物在958bp处有明显条带时，则判断为对猪圆环病毒呈阳性反应，即待测样品中含有猪圆环病毒；
(4)以步骤(3)中检测含有猪圆环病毒的样品的DNA为模板，利用引物对PCV2d-F/PCV2d-R和PCV2b-F/PCV2b-R进行PCR扩增反应；
(5)将PCR扩增产物进行电泳检测：取10μl PCR扩增产物，加入含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130V，25min；根据电泳结果判断待测样品中的猪圆环病毒为2b型或2d型：当PCR产物在343bp处有明显条带，且阴性对照的扩增产物不存在该条带，则显示为对猪圆环病毒2d型呈阳性反应，即待测样品中含有2d型猪圆环病毒。当PCR产物在277bp处有明显条带，且阴性对照的扩增产物不存在该条带，则判断为对猪圆环病毒2b型呈阳性反应，即待测样品中含有2b型猪圆环病毒。
进一步地，根据各步骤PCR扩增反应使用引物的特性，对PCR反应程序进行优化，通过优化退火温度，最终确定上述步骤(2)的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸5min。上述步骤(4)的PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃终延伸5min。
在确定PCR反应程序的基础上，对PCR反应体系进行优化，通过优化Mg2+的用量、dNTPs的用量，最终确定如下PCR反应体系：
步骤(2)的PCR扩增反应体系(20μL)如下：
Figure BDA0001915483200000101
步骤(4)的PCR扩增反应体系(20μL)如下：
Figure BDA0001915483200000102
实施例3猪圆环病毒检测的特异性分析
利用实施例1设计的检测引物和实施例2提供的检测方法分析猪圆环病毒2b型和2d型检测的特异性。
分别以猪圆环病毒2b型基因组DNA和猪圆环病毒2d型基因组DNA为模板，利用实施例2提供的检测方法进行检测，结果分别如图1和图2所示，结果表明，PCV2d-F/PCV2d-R仅在猪圆环病毒2d型样品中能够扩增出343bp的目的条带(图1)；PCV2b-F/PCV2b-R仅在猪圆环病毒2b型样品中能够扩增出277bp的目的条带(图2)。
以PCV3型病毒的基因组DNA为模板，利用实施例2提供的检测方法进行检测，结果如图3所示，采用PCV2b-F/PCV2b-R和PCV2d-F/PCV2d R进行PCR扩增，未扩增出任何片段，而采用PCV3特异性引物(PCV3-F:CCACAGAAGGCGCTATGTC和PCV3-R:CCGCATAAGG GTCGTCTTG)进行扩增，则能够扩增出330bp目的片段(图3)。
以上实验结果证明实施例1的检测引物和实施例2的检测方法的特异性较高。
实施例4猪圆环病毒临床样品的检测
收集湖北地区10份疑似仔猪PCVAD病料，利用实施例2提供的检测方法进行检测，结果显示，10份病料采用PCV-F/PCV-R引物对检测，均能扩增出958bp条带，均为猪圆环病毒阳性(图4)，阳性率达到100％；采用PCV2d-F/PCV2d-R引物对和PCV2d-F/PCV2d-R引物对进行PCR扩增后，有7份病料能够扩增出343bp的目的条带，含有2d型猪圆环病毒(图5)；3份病料能够扩增出277bp的目的条带，含有2b型猪圆环病毒(图6)。将上述PCR鉴定为2d和2b型猪圆环病毒的基因组DNA样本进行全基因组测序，全基因组基因测序结果与上述PCR鉴定结果完全一致，表明本发明提供的猪圆环病毒检测和分型的引物组和检测方法具有高度的准确性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组和试剂盒
<130> KHP181118540.9
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggattact tccttggtat tttgg 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attcttcttg ctgggcatgt tg 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagtaatcg attgtcctat caagg 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacagtcaga acgccctcct g 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagtaatca atagtggaat ctagg 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggaggggg ctcaaacccc 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccacagaagg cgctatgtc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgcataagg gtcgtcttg 19

Claims (2)

1.用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组在制备猪圆环病毒检测和分型试剂中的应用；
所述引物组由如下引物组成：
SEQ ID NO.1：上游引物PCV-F：
5’-GAGGATTACTTCCTTGGTATTTTGG-3’；
SEQ ID NO.2：下游引物PCV-R：
5’-ATTCTTCTTGCTGGGCATGTTG-3’；
SEQ ID NO.3：上游引物PCV2d-F：
5’- GAAGTAATCGATTGTCCTATCAAGG-3’；
SEQ ID NO.4：下游引物PCV2d-R：
5’- CACAGTCAGAACGCCCTCCTG -3’；
SEQ ID NO.5：上游引物PCV2b-F：
5’- GAAGTAATCAATAGTGGAATCTAGG-3’；
SEQ ID NO.6：下游引物PCV2b-R：
5’- CAGGAGGGGGCTCAAACCCC-3’；
所述试剂在用于猪圆环病毒检测和2型分型时，包括如下步骤：
（1）提取待测样品的DNA；
（2）利用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物的电泳条带类型判断待测样品中是否含有猪圆环病毒；
（3）以步骤（2）中鉴定的猪圆环病毒阳性的待测样品的DNA为模板，利用如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增；
（4）根据步骤（3）得到的扩增产物的电泳条带类型，判断待测样品中是否含有猪圆环病毒2b型或2d型；
其中，步骤（2）的PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸5min；
步骤（2）的PCR扩增的20 μL反应体系的组成为：
10×PCR反应缓冲液 2 μL；
Mg2+ 2mM；
引物PCV-F 10μmol/L，1μL；
引物PCV-R 10μmol/L，1μL；
dNTPs 0.2 mM；
DNA 聚合酶 0.5~1U；
待测样品DNA 100~200 ng/μL，2 μL；
ddH2O 补足20 μL；
步骤（3）的PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃终延伸5min；
步骤（3）的PCR扩增的20 μL反应体系的组成为：
10×PCR反应缓冲液 2 μL；
Mg2+ 2mM；
引物PCV2d-F 10μmol/L，1μL；
引物PCV2d-R 10μmol/L，1μL；
引物PCV2b-F 10μmol/L，1μL；
引物PCV2b-R 10μmol/L，1μL；
dNTPs 0.2 mM；
DNA 聚合酶 0.5~1U；
待测样品DNA 100~200 ng/μL，2 μL；
ddH2O 补足20 μL。
2.用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组在检测猪圆环病毒和猪圆环病毒2型分型中的非疾病诊断目的的应用；
所述引物组由如下引物组成：
SEQ ID NO.1：上游引物PCV-F：
5’-GAGGATTACTTCCTTGGTATTTTGG-3’；
SEQ ID NO.2：下游引物PCV-R：
5’-ATTCTTCTTGCTGGGCATGTTG-3’；
SEQ ID NO.3：上游引物PCV2d-F：
5’- GAAGTAATCGATTGTCCTATCAAGG-3’；
SEQ ID NO.4：下游引物PCV2d-R：
5’- CACAGTCAGAACGCCCTCCTG -3’；
SEQ ID NO.5：上游引物PCV2b-F：
5’- GAAGTAATCAATAGTGGAATCTAGG-3’；
SEQ ID NO.6：下游引物PCV2b-R：
5’- CAGGAGGGGGCTCAAACCCC-3’；
所述应用包括如下步骤：
（1）提取待测样品的DNA；
（2）利用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物的电泳条带类型判断待测样品中是否含有猪圆环病毒；
（3）以步骤（2）中鉴定的猪圆环病毒阳性的待测样品的DNA为模板，利用如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增；
（4）根据步骤（3）得到的扩增产物的电泳条带类型，判断待测样品中是否含有猪圆环病毒2b型或2d型；
其中，步骤（2）的PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸5min；
步骤（2）的PCR扩增的20 μL反应体系的组成为：
10×PCR反应缓冲液 2 μL；
Mg2+ 2mM；
引物PCV-F 10μmol/L，1μL；
引物PCV-R 10μmol/L，1μL；
dNTPs 0.2 mM；
DNA 聚合酶 0.5~1U；
待测样品DNA 100~200 ng/μL，2 μL；
ddH2O 补足20 μL；
步骤（3）的PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性5min；94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃终延伸5min；
步骤（3）的PCR扩增的20 μL反应体系的组成为：
10×PCR反应缓冲液 2 μL；
Mg2+ 2mM；
引物PCV2d-F 10μmol/L，1μL；
引物PCV2d-R 10μmol/L，1μL；
引物PCV2b-F 10μmol/L，1μL；
引物PCV2b-R 10μmol/L，1μL；
dNTPs 0.2 mM；
DNA 聚合酶 0.5~1U；
待测样品DNA 100~200 ng/μL，2 μL；
ddH2O 补足20 μL。
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