CN102206715B - 一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，属于生物检测领域，解决了检测猪圆环病毒2型和分型方法程序复杂，周期长的技术问题。本发明的试剂盒中含有荧光PCR反应液，反应液中含有特异性引物，其中上游引物的序列如SEQIDNO：3所示，下游引物的序列如SEQIDNO：4所示，还含有针对PCV-2a型的TaqMan特异性探针a和针对PCV-2b型的TaqMan特异性探针b。本发明还提供了采用上述的试剂盒检测猪圆环病毒2型和分型的方法。本发明的二重荧光PCR检测试剂盒可以快速准确地检测PCV-2，同时能够进行其亚型的鉴定，适用于PCV-2快速诊断、流行病学调查、风险评估及基因型分析。

Description

一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种病毒的检测试剂盒及其方法，特别是一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒及方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus-2，PCV-2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、繁殖障碍(Reproductive failure)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、增生性坏死性肺炎(PNP)及先天性震颤(CT)等多种疾病，但以PMWS最为常见，目前该病在世界范围内广泛流行，死亡率10％～30％不等。郎洪武等(郎洪武，2000)采用ELISA方法对北京、河北、山东、天津、吉林、河南等七省(市)22个猪群的559份血清进行了检测。样品总阳性率为42.9％(240/559)，其中20日龄未断奶仔猪抗体阳性率为0(0/58)、1～2月龄断奶仔猪阳性率为16.5％(23/139)、后备母猪阳性率为43.3％(61/141)、经产母猪阳性率为85.6％(107/125)、育肥猪阳性率为51.0％(49/96)。从这些数字中可以看出，猪的血清样品大多数存在PCV-2抗体，不同猪群相同年龄段的阳性率不同，不同年龄段的阳性比率也有不同。王忠田、杨汉春等(王忠田，2001)用PCR方法对我国北京、天津、河北、山东、山西、广东等地的12个规模化猪场发病猪群进行PCV-2感染的流行病学调查发现，我国的PCV-2感染情况相当严重。加上继发感染和混合感染的因素，给我国养猪业带来了很大的经济损失。

Gagnon CA等人于2006年夏天在加拿大一家发生PMWS的猪场中发现一株PCV-2的变异株，其直接的临床表现就是，猪场猪群的死亡率比一股发生PMWS猪场的死亡率要高许多。同时在美国的猪场中无论是否发生PMWS也都发现这种PCV-2变异株，这种变异株被命名为PCV-2b，而先前发现的未变异株则被命名为PCV-2a。这种变异株的感染在世界范围呈蔓延趋势，在许多国家的猪场中都有分离的报道，我国也有很多学者对PCV-2基因亚型进行了研究和报道，张建武等人(张建武，2009)在2007年针对中国部分地区猪内脏样本进行PCV-2的分子流行病学调查，发现中国地区PCV-2感染已经比较普遍，发病猪场的感染率高于正常猪场，且近两年的PCV-2阳性率明显高于高于前年的阳性率，表明PCV-2的感染呈上升趋势，值得我们关注。但是传统分型鉴定采用的是测序方法，其有一定的局限性，对同一猪体PCV-2不同亚型的混合感染无法判定，且费时、费力，所以应当建立一种快速、方便、直观的荧光PCR检测方法，既可以达到检测目的，又可以达到基因分型的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒及方法，所述的这种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒及方法能够快速的检测猪圆环病毒2型和分型，而且特异性强、敏感性高、成本低。

本发明提供了一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，含有：

(1)、荧光PCR反应液，所述的荧光PCR反应液中含有特异性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示；

(2)、针对PCV-2a型的TaqMan特异性探针a，探针a的序列如SEQ ID NO：5所示，在探针a的5’设计有荧光物质，在探针a的3’设计有带有淬灭物质；

(3)、针对PCV-2b型的TaqMan特异性探针b，探针b的序列如SEQ ID NO：6所示，在探针b的5’设计有荧光物质，在探针b的3’设计有带有淬灭物质；

(4)、热启动Taq酶和酶保护剂；

(5)、PCV-2a型和PCV-2b型质粒DNA阳性对照。

进一步的，所述的特异性引物的浓度为0.32μM。

进一步的，所述的探针a和b的浓度均为10μM。

进一步的，所述的荧光PCR反应液含有浓度均为0.24mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，还含有浓度为2.4mM的Mg²⁺。

进一步的，所述的热启动Taq酶的浓度为1U/uL，所述的酶保护剂的浓度为0.2U/uL。

进一步的，在探针a的5’设计有FAM荧光物质，在探针a的3’设计有带有BHQ淬灭物质。

进一步的，在探针b的5’设计有HEX荧光物质，在探针b的3’设计有带有BHQ淬灭物质。

本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2型和分型的特异性引物，其上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2a型的TaqMan特异性探针，其碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2b型的TaqMan特异性探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了采用上述的试剂盒检测猪圆环病毒2型和分型的方法，包括以下步骤：

(1)待检样本的DNA提取；

(2)荧光PCR检测：按照扩增对象数量，取荧光PCR反应液、探针、热启动Taq酶混于一离心管中，震荡，分装，盖上管盖备用；将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中，最后取阳性对照加入一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中；

(3)结果判定：反应液测定Ct值均大于35或无数值的标本为阴性；FAM通道测定Ct≤30的标本为A型标本；HEX/VIC通道测定Ct≤30的标本为B型标本；测定30＜Ct＜35的标本建议复测，复测结果Ct＜35为阳性，复测结果Ct＞＝35的为阴性。

进一步的，荧光PCR扩增条件为：95℃预变性3min；按以下参数循环40次：95℃变性15sec、58℃采集荧光40sec。

PCV-2可分为PCV-2a和PCV-2b两个亚型，其中PCV-2a为1768bp，登录号为：AB072302-JAPAN-2009，其全基因序列如SEQ ID NO：1所示，PCV-2b为1767bp，登录号为：DQ141322-CHINA-2005，其全基因序列如SEQ ID NO：2所示。

根据PCV-2a和PCV-2b基因序列设计一对特异性引物如下：

上游引物C1：5’-CCA，GAA，TTC，AAC，YTT，AAC，CTT，YCT，TAT-3’；

下游引物C2：5’-GRC，RGT，GGA，CAT，GMT，GAG，A-3’；

其作用是能够特异性同时扩增两种亚型的DNA片段，并且其DNA片段包含两种亚型的变异区。

根据PCV-2a和PCV-2b基因序列的变异区设计两个探针，其序列如下：

a：FAM-AGG，GTA，TAG，AGA，TTT，TGT，TGG，TCC，CCC，CTC-BHQ

b：HEX-CAA，ACC，CCC，kCw，CTG，TGC，CCT，TTG，A-BHQ；

其作用是a与PCV-2a的变异区特异性结合，在PCR扩增中释放FAM荧光信号；b与PCV-2b的变异区特异性结合，在PCR扩增中释放HEX荧光信号，当荧光PCR仪通过相应的通道采集荧光时，就可以特异性观察到两种扩增曲线，既达到检测PCV-2的目的，同时也达到分型的目的。

本试剂盒荧光PCR反应条件的优化过程为：

(1)、引物浓度的优化：

设置引物终浓度范围为50～1000pM，用不同浓度梯度的引物进行荧光PCR试验，结果表明此浓度范围的引物都可以扩增S型曲线，并且当每条引物终浓度为270pM时效果最佳。

(2)Mg²⁺浓度的优化：

设置Mg²⁺终浓度范围为1.5～5.0mM，结果表明此浓度范围内的Mg²⁺均能扩增出S型曲线，并且当Mg²⁺终浓度为2.88mM时，扩增效果最好。

(3)dNTPs浓度的优化：

四种dNTPs等当量混合，设置每种dNTPs终浓度范围为0.1～1mM，结果表明此浓度范围内的dNTPs均能扩增出曲线，并且每种dNTPs终浓度以0.288mM，即总dNTPs终浓度为1.152mM时为最佳。

(4)探针浓度的优化：

设置探针终浓度范围为0.05～1μM，用不同浓度梯度的探针进行荧光PCR试验，结果表明此浓度范围的引物都可以扩增S型曲线，并且当每条探针终浓度以0.2μM时效果最佳。

(4)退火温度的筛选：

根据所采用的PCR引物和探针，运用公式T＝2(A+T)+4(G+C)计算退火温度，再按照实际情况，确定PCR反应的中限温度是59℃，温度范围是56～66℃，结果表明该范围温度下均能扩增出S型曲线，当退火温度为58℃，PCR扩增出的曲线效果最佳。因此，选择58℃作为荧光PCR敏感性和特异性试验的退火温度。

(5)热启动Taq酶和酶保护剂浓度的优化：

设置热启动Taq酶和酶保护剂终浓度范围为0.001～0.1U/μL，用不同浓度梯度的热启动Taq酶和酶保护剂进行荧光PCR试验，结果表明此浓度范围的热启动Taq酶和酶保护剂都可以扩增S型曲线，并且当热启动Taq酶和酶保护剂浓度为以0.067U/μL时效果最佳。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显而易见的。本发明的试剂制备简单、方法简便快捷、特异性强、敏感性高、结果判断容易，对两种亚型的混合感染具有鉴别诊断作用。

附图说明：

图1是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之一，显示了TaqMAN探针一端连接发光基团，一端连接淬灭基团，并且连接的DNA链能够与特异性DNA目的片段结合。

图2是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之二，显示了一对特异性引物在TaqDNA聚合酶作用下一方面进行DNA片段的合成，当到达探针结合位置时，它同时发挥限制性酶切作用，将探针中连接发光基团和淬灭基团的DNA链切断，释放发光基团。

图3是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之三，显示了发光基团游离在反应体系中时，受到激发就可以发出荧光，并被仪器收集到，形成扩增曲线，达到检测目的。

图4是荧光PCR图，其中呈S型的曲线分别为PCV-2a和PCV-2b的DNA样本，其余样本均为阴性，表明该试剂盒特异性好。

图5是荧光PCR图，其中，3条呈S型曲线的样本为PCV-2a阳性质粒，其质粒大肠杆菌浓度分别为6.25×10⁵个/mL、6.25×10⁴个/mL、6.25×10³个/mL，当样本中PCV-2a阳性质粒大肠杆菌浓度为6.25×10³个/mL时，荧光PCR在FAM通道可观察明显的S型曲线。

图6是荧光PCR图，其中，3条呈S型曲线的样本为PCV-2b阳性质粒，其质粒大肠杆菌浓度分别为3.14×10⁵个/mL、3.14×10⁴个/mL、3.14×10³个/mL，当样本中PCV-2b阳性质粒大肠杆菌浓度为3.14×10³个/mL时，荧光PCR在VIC通道可观察明显的S型曲线。

图7是荧光PCR图，其中，在-20℃储存时间分别为30d，60d，90d，120d，150d，180d的试剂盒对PCV-2a阳性样本进行检测，结果表明本试剂盒稳定性良好。

图8是荧光PCR图，其中，在-20℃储存时间分别为30d，60d，90d，120d，150d，180d的试剂盒对PCV-2b阳性样本进行检测，结果表明本试剂盒稳定性良好。

图9、图10和图11是3份PCV-2a和7份PCV-2b阳性样本用本试剂盒重复试验三次的荧光PCR图，结果均能扩增出S型曲线，显示试剂盒的稳定性。

图12是采用-20℃保存1～12个月的试剂盒检测PCV-2a的荧光PCR图。

图13是采用-20℃保存1～12个月的试剂盒检测PCV-2b的荧光PCR图。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例描述发明，而不是以任何方式限制发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利范围之内。

实施例1试剂盒组成

荧光PCR反应液2管(25μL/反应×100)，其中的dATP、dTTP、dGTP和dCTP终浓度为0.24mM、Mg²⁺终浓度为2.4mM，引物C1、C2终浓度为0.32μM，探针a、b混合物1管(2μL/反应×100)，浓度都为5μM，热启动Taq酶和酶保护剂混合物1管(2μL/反应×100)，其中热启动Taq酶浓度为1U/μL，酶保护剂浓度为0.2U/μL，阳性质粒对照a和b各1管(250μL/管)，阴性质粒对照1管(250μL/管)。

本试剂盒采用30μL反应体系，反应液组成为：荧光PCR反应液为25μL、酶2μL、探针混合物1μL及模板2μL。

实施例2猪圆环病毒2型二重荧光PCR检测试剂盒的使用方法

1、样本处理：

请自行提取DNA，阳性对照无需提取，直接加样。

2、荧光PCR的检测

(1)按照检测样品数n(n＝待检样品数+2)取PCR反应液、热启动Taq酶和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。

(2)现将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中。

(3)荧光PCR反应条件：94℃预变性3min，按以下参数循环40次：94℃变性15sec、58℃采集荧光40sec。58℃时荧光检测，检测通道：FAM，VIC/HEX。

3、质控标准

(1)阴性对照的Ct值应等于none。

(2)阳性对照的Ct值应≤30，否则，此实验视为无效。(Ct值应以S型曲线拐点的循环数为准)

(3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。

4、结果判定

(1)Ct值＞35或无数值的标本为阴性。

(2)FAM通道Ct值≤30的标本为a型标本。

(3)HEX/VIC通道Ct值≤30的标本为b型标本。

(4)30＜Ct值＜35的样本建议重做。重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。

实施例3试剂盒特异性试验

取猪圆环病毒1型毒株、猪伪狂犬毒株、猪细小病毒、PK-15细胞等4个对照样本的DNA各2μL为模板进行试剂盒的特异PCR扩增，同时设阴性对照组。

PCR扩增条件：95℃预变性3min，按以下参数循环40次：95℃变性15sec、58℃采集荧光40sec。

荧光PCR结果表明仅PCV-2a和PCV-2b的DNA扩增出曲线，而作为对照样本的猪圆环病毒1型毒株、猪伪狂犬毒株、猪细小病毒、PK-15细胞的DNA均无此扩增曲线出现(见图4)。

实施例4试剂盒敏感性试验

将计数后的PCV-2a和PCV-2b阳性质粒大肠杆菌进行10倍梯度稀释，PCV-2a(625×10⁶)和PCV-2b(3.14×10⁷)都按1∶10¹，1∶10²，1∶10³，1∶10⁴，1∶10⁵进行稀释，抽提DNA。从每个梯度DNA中各取2μL模板用荧光PCR试剂盒进行检测。扩增条件同上，同时设阴性对照。通过6个浓度梯度的PCV-2a和PCV-2b质粒DNA的荧光PCR反应，结果表明当样本中PCV-2a阳性质粒大肠杆菌浓度为6.25×10³个/mL时，荧光PCR在FAM通道可观察明显的S型曲线(见图5)；当样本中PCV-2b阳性质粒大肠杆菌浓度为3.14×10³/mL时，荧光PCR在VIC通道可观察到明显的S型曲线(见图6)。

实施例5试剂盒的稳定性和重复性试验

试剂盒内所用试剂均在-20℃储存，储存时间为30d，60d，90d，120d，150d，180d时取出，用已知PCR阳性样本检测试剂盒的稳定性。此外，PCV-2a和PCV-2bPCR阳性样本各15份用本试剂盒进行重复性实验3次；15份PCR阴性样本用本试剂盒进行重复性实验3次。扩增条件同上，并记录结果。结果表明在30，60，90，120，150，180d各时段分别取出试剂盒，用PCV-2a和PCV-2bPCR阳性质粒进行荧光PCR检测，均能扩增出曲线，且无非特异性曲线，阴性对照均为阴性(见图7和图8)。3份PCV-2a和7份PCV-2b阳性样本用本试剂盒重复试验三次，结果均能扩增出S型曲线(见图9、10、11)。

实施例6试剂盒的保存期试验

将在-20℃分别保存1～12个月的试剂盒对已知样品进行检测。扩增条件同上。结果表明本试剂盒均在-20℃下可以长期保存，在试验的12个月内均能扩增出S型曲线，阴性对照均为阴性(见图12和图13)。

实施例7普通PCR方法的对比

采集了上海及周边地区猪临床内脏样本共101份，编号后放入4℃冰箱待检。

(一)、样本的前处理

1、将采集的猪内脏样本剪取心、肝、脾、肺及淋巴结共5克左右放入研钵中，加入PBS液进行研磨，取上清，4℃保存备用；

2、样本DNA的提取(参考AXYGEN公司AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒说明书)

(1)取研磨的猪内脏样本上清200μL，加入DNA裂解液Buffer V-L，涡旋震荡混合均匀，静置5min。

(2)加75μL Buffer V-N，涡旋振荡混合均匀，12000×g离心5min。

(3)将上清转移到新的2ml离心管中，加300μL异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6～8次，混合均匀。

(4)将制备管置于2ml离心管中，取步骤3中混合液移入制备管中，6000×g离心1min。

(5)弃滤液，将制备管置回到于2ml离心管中，加500μLBufferW1A，室温静置1min。12000×g离心1min。

(6)弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加800μL Buffer W2，12000×g离心1min。

(7)将制备管置回到2ml离心管中，12000×g离心1min。

(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加40～60μLBuffer TE，室温静置1min，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA，-20℃保存备用。

(二)普通PCR方法检测

参考张建武等的方法(张建武，庄金山，刘长龙.2007年中国部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析[J]中国农业科学，2009，42(8)：2949-2957)合成上下游引物PCF1096/PCR1588。

(1)组织样品中PCR的扩增

PCV-2检测的PCR反应体系如下：PCV-2检测用的上下游引物PCF1096/PCR1588(10μmol·L^-1)各1μL，10×Buffer 2μL，2.5mmol·L-1dNTP 2μL，rTaqDNA聚合酶5U，加入2μL提取的病毒核酸，加入灭菌双蒸水至25μL，PCR循环条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，40循环，72℃10min。当PCR结束后在1％的琼脂糖胶上进行电泳，EB染色后，在紫外灯下成像。

(2)组织样品中PCV-2ORF2的克隆及鉴定

在紫外灯下将上述PCR的目的条带取出，按照DNA胶回收试剂盒的步骤进行回收，取回收产物与pBS-T载体连接，连接反应体系为：回收的PCR产物7μL，10×连接Buffer 1μL，pBS-T载体1μL，T4DNA连接酶1μL，4℃连接过夜，然后转化TOP10感受态菌，在IPTG、X-gal诱导下37℃培养12～16h，挑取白斑菌落接种LB液体培养基培养过夜后提取质粒，选取大小阳性的质粒用限制性内切酶Xbal I和HindIII进行阳性重组子的双酶切鉴定。

(3)血清或组织样品中PCV-2ORF2的核苷酸序列的测定与分型

取上述经双酶切鉴定的阳性重组质粒送Invitrogen公司进行序列测定，并连同已发表的PCV-2 ORF2的核苷酸序列进行比对，确定其基因亚型。

(三)荧光PCR方法检测

(1)按照检测样品数n(n＝待检样品数+2)取PCR反应液、热启动Taq酶和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。

(2)现将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中。

(3)荧光PCR反应条件：94℃预变性3min，按以下参数循环40次：94℃变性15sec、60℃采集荧光40sec。60℃时荧光检测，检测通道：FAM，VIC/HEX。

(四)检测结果

同时用普通PCR方法和荧光PCR方法对上海及周边地区101份猪临床内脏样本进行PCV-2基因型检测，结果见表1。

表1.普通PCR方法和荧光PCR方法对猪临床内脏样本进行PCV-2基因型检测结果的比较

综上所述：传统基因型分析一股采用普通PCR扩增、目的片段测序和序列比对的方法，这种方法在PCR技术领域一直被普遍采用，但是其自身的缺点也比较明显：费力，程序繁琐，步骤复杂，人工成本太高，不利于大量样本的检测；费时，周期长，从检测到获得结果最快也要一周；成本高，采用普通PCR方法检测一份样本要100元左右，用荧光PCR方法的成本只要25元；人员要求高，测序的结果需要具有一定专业知识人员进行序列比对才能最终判定结果，而荧光PCR结果判定简单、直观；普通PCR方法无法对同一猪体PCV-2不同亚型的混合感染进行判断，而荧光PCR可以对同一样本的PCV-2a和PCV-2b的混合感染进行判定。

本发明的猪圆环病毒2型检测和分型的检测试剂盒克服了以上检测方法的不足。并应用该试剂盒对上海及周边地区101份猪临床内脏样本进行PCV-2基因型检测，并与普通PCR方法进行了比较，结果表明普通PCR法和荧光PCR法的PCV-2a的阳性率都为1.98％，PCV-2b的阳性率都为27.72％，两种方法的阳性符合率为100％，充分体现了本试剂盒特异性强、敏感性高、成本低、快捷、人员要求低、结果判断方便、直观等优点，本试剂盒采用一步法既可以达到PCV-2的检测目的，又可以达到判定其基因亚型的目的，对于PCV-2的鉴别诊断、基因型分析、流行病学调查及其风险评估具有重要的应用价值。

Claims (7)

1.一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于它含有：

（1）、荧光PCR反应液，所述的荧光PCR反应液中含有特异性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示；

（2）、针对PCV-2a型的TaqMan特异性探针a，探针a的序列如SEQ ID NO：5所示，在探针a 的5’设计有荧光物质，在探针a 的3’设计有淬灭物质；

（3）、针对PCV-2b型的TaqMan特异性探针b，探针b的序列如SEQ ID NO：6所示，在探针b 的5’设计有荧光物质，在探针b 的3’设计有淬灭物质；

    （4）、热启动Taq酶和酶保护剂；

（5）、PCV-2a型和PCV-2b型质粒DNA阳性对照。

2.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物的浓度为0.32μM。

3.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于：所述的探针a和b的浓度均为10μM。

4.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于：所述的荧光PCR反应液还含有浓度均为0.24mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，还含有浓度为2.4mM的Mg²⁺。

5.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于：所述的热启动Taq酶的终浓度为1U/uL，所述的酶保护剂的终浓度为0.2U/uL。

6.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于：在探针a 的5’设计有FAM荧光物质，在探针a 的3’设计有BHQ淬灭物质。

7.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于：在探针b 的5’设计有HEX荧光物质，在探针b 的3’设计有BHQ淬灭物质。

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