CN104388595A - 猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法 - Google Patents

猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCRMGB-TaqMan探针检测方法，该方法利用荧光定量PCR技术，采用MGB探针，建立了猪圆环病毒2型（PCV2）检测方法。本发明具有灵敏度高，特异性强，重复性好，操作简单易被广泛应用的优势，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大的降低本底信号的强度，使检测结果更准确。达到猪圆环病毒2型快速、准确检测的目的。

Description

猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法
技术领域
本发明涉及一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法，属于生物技术领域，适用于PCV2的快速准确检测。 
背景技术
猪圆环病毒2型((PCV2)现被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要因素，同时还发现PCV2与其它疾病相关，这些疾病包括肾病皮炎综合症、繁殖障碍、出生前心肌炎和弥散坏死性肺炎。近年来该病在我国和世界各地迅速传播，感染范围日趋广泛，给养猪业造成巨大的经济损失。 
PCV2是猪圆环病毒((PCV)两种基因型中的一种，为小颗粒、无包膜、环状单股DNA病毒。目前PCV2常用的检测方法主要有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光(IFA)、ELISA、免疫组织化学法(IHC)、原位核酸杂交等，但操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想，常规PCR检测技术可对特定基因进行扩增，但不能进行定量分析，对低拷贝数的靶片段DNA的有效扩增不理想，而且因交叉污染容易出现假阳性。实时荧光定量PCR检测技术是近年来发展起来的一种新的DNA/RNA定量检测技术，已经越来越多的应用于人类和畜禽等动物传染病的诊断中。 
实时荧光定量PCR分为染料法和探针法，探针法较染料法又有着更高的灵敏度和特异性，检测结果更为可靠。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭荧光基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 
本发明采用的MGB探针与普通的TagMan探针相比，又具有实验结果更精确，分辨率更高的优势，MGB探针提高配对与非配对模板间的TM值差异，并且探针3’端的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大的降低本底信号的强度，使检测结果更准确。 
发明内容
本发明目的在于，提供一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法，该方法利用荧光定量PCR技术，采用MGB探针，建立了猪圆环病毒2型(PCV2)检测方法。本发明具有灵敏度高，特异性强，重复性好，操作简单易被广泛应用的优势，MGB 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大的降低本底信号的强度，使检测结果更准确。达到猪圆环病毒2型快速、准确检测的目的。 
本发明所述的一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法，按下列步骤进行： 
a、设计与合成实时荧光定量PCR检测的引物对，其序列为：上游引物F：5’-CCCTATGTAAACTACTCCTC-3’和下游引物R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’； 
b、设计与合成实时荧光定量PCR检测的MGB-TaqMan探针，其序列为：5’-(FAM)ACCATAACCCAGCCCTTCTCC(MGB)-3’； 
c、阳性对照标准品的制备：阳性对照标准品为实验室构建的含有PCV2ORF2序列的克隆质粒pMD18T-PCV2，PCV2ORF2序列来源于GeneBank，在保守序列区设计一对特异性引物，克隆载体pMD18-T，将制备的质粒进行定量，使最终浓度为1×1010copies/μl，温度-20℃保存； 
配制PCR反应体系，按照PCR反应程序进行反应得到目的片段，所述PCR反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5μl，上下游引物各0.5μl，基因组DNA2μl，去离子水补加至总体积25μl；PCR反应程序为：95℃5min，95℃30s，58.6℃30s，72℃2min，72℃10min，35循环； 
配制连接反应液，转化并提取质粒模板，所述连接反应液为快速连接混合液5μl，pMD18-T载体1μl，PCR产物3μl，补加去离子水至总体积10μl； 
测定质粒浓度，使最终浓度为1×1010copies/μl； 
d、定量PCR检测：将梯度稀释的标准质粒作为模板进行定量PCR检测，配制定量PCR反应体系为：Premix EX Taq 12.5μl，上下游引物各0.5μl，探针0.25μl，基因组DNA2μl，去离子水补加至总体积25ul，反应程序为：温度95℃30s，温度95℃5s，温度57.4℃30s，40个循环，绘制标准曲线，然后以待测样品DNA和标准品为模板做定量PCR检测。 
本发明所述的一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法，该方法是通过以下技术方案实现的： 
特异性引物和探针的设计和合成： 
参照GenBank收录的PCV2基因组全序列选择保守区，采用美国ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成了1对TaqMan探针及其引物，探针的荧光标记选择FAM作为报告发光基团，MGB为淬灭基团，探针和引物由Takara公司合成。其序列为：引物F(上游)：5’-CCCTATGTAAACTACTCCTC-3’和引物R(下游)：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’，探针：5’-(FAM)ACCATAACCCAGCCCTTCTCC(MGB)-3’； 
阳性对照标准品的制备： 
阳性对照标准品为实验室构建的含有PCV2ORF2序列的克隆质粒pMD18T-PCV2，PCV2ORF2序列来源于GeneBank，在保守序列区设计一对特异性引物，克隆载体pMD18-T， 制备一批质粒，测定浓度、纯度均合格的质粒进行定量，使最终浓度为1×1010copies/μl，温度-20℃保存，具体方法如下： 
配制PCR反应体系：2×PCR Master Mix 12.5μl，上下游引物各0.5μl，基因组DNA2μl，去离子水补加至总体积25μl；PCR反应程序为：95℃5min，95℃30s，58.6℃30s，72℃2min，72℃10min，35循环。回收并纯化PCR产物，即为目的片段； 
配制连接反应体系：快速连接混合液5μl，pMD18-T载体1μl，PCR产物3μl，补加去离子水至总体积10μl，温度16℃孵育过夜； 
转化并提取质粒模板：将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂板，选出阳性质粒克隆，测序，测定质粒浓度，使最终浓度为1×1010copies/μl，所提取的质粒即可作为后续试验的模板； 
定量PCR检测： 
将梯度稀释的标准质粒作为模板进行定量PCR检测，绘制标准曲线，然后以待测样品DNA和标准品为模板做定量PCR检测。 
本发明所述的一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法，该方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好。本发明设计的特异性引物和探针，使实时荧光定量PCR检测的定量极限和检测极限极低，大大提高了实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度，可实现大通量样品的检测，可对动物及动物源性样品中的猪圆环病毒2型进行实时荧光定量PCR检测。 
附图说明
图1为本发明的标准曲线图，其中横坐标为质粒模板拷贝数的对数，纵坐标为循环阈值； 
图2为本发明标准曲线的熔解曲线图，其中熔解曲线的峰值出现在一个位置，结果成立； 
图3为本发明不同稀释度标准样品的反应曲线图； 
图4为本发明特异性检测的反应曲线图：其中检测样品分别为猪伪狂犬病毒，猪瘟病毒，猪细小病毒，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒，口蹄疫病毒，猪流感病毒所抽提的DNA或cDNA为模板，结果显示除PCV2之外其他各病原体未出现Ct值且无典型扩增曲线出现，该检测方法特异性强。 
具体实施方式
实施例 
设计与合成实时荧光定量PCR检测的引物对，其序列为：上游引物F：5’-CCCTATGTAAACTACTCCTC-3’和下游引物R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’； 
设计与合成实时荧光定量PCR检测的MGB-TaqMan探针，其序列为：5’-(FAM)ACCATAACCCAGCCCTTCTCC(MGB)-3’； 
阳性对照标准品的制备：阳性对照标准品为实验室构建的含有PCV2ORF2序列的克隆质粒pMD18T-PCV2，PCV2ORF2序列来源于GeneBank，在保守序列区设计一对特异性引物，克隆载体pMD18-T，将制备的质粒进行定量，使最终浓度为1×1010copies/μl，温度-20℃保存； 
配制PCR反应体系，按照PCR反应程序进行反应得到目的片段，所述PCR反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5μl，上下游引物各0.5μl，基因组DNA2μl，去离子水补加至总体积25μl；PCR反应程序为：95℃5min，95℃30s，58.6℃30s，72℃2min，72℃10min，35循环； 
配制连接反应液，转化并提取质粒模板，所述连接反应液为快速连接混合液5μl，pMD18-T载体1μl，PCR产物3μl，补加去离子水至总体积10μl； 
测定质粒浓度，使最终浓度为1×1010copies/μl； 
定量PCR检测：将梯度稀释的标准质粒作为模板进行定量PCR检测，配制定量PCR反应体系为：Premix EX Taq 12.5μl，上下游引物各0.5μl，探针0.25μl，基因组DNA2μl，去离子水补加至总体积25ul，反应程序为：温度95℃30s，温度95℃5s，温度57.4℃30s，40个循环，绘制标准曲线，然后以待测样品DNA和标准品为模板做定量PCR检测； 
阳性对照标准样品的制备： 
设计一对扩增PCV2-ORF2的引物，扩增片段长353bp(1036-1388nt).正向引物P1：5’-AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3’；反向引物P2：5’-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3’该片段包含了探针及其引物所要扩增和检测的片段(1194-1299nt)。将该产物纯化后连接到pMD-18-T载体，并进行克隆。阳性克隆经酶切和测序进行鉴定.培养阳性克隆菌并提取质粒，用核酸蛋白分析仪测定质粒浓度、纯度，对浓度、纯度均合格的质粒进行定量，使最终浓度为1×1010copies/μl，温度-20℃保存； 
定性PCR检测： 
分别以待检样品、阳性质粒、去离子水为模板做检测。PCR反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5μl，上下游引物各0.5μl，基因组DNA2μl，去离子水补加至总体积25μl；PCR反应程序为：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃40s，72℃10min，35循环。结果显示被检样品中76.5％为猪圆环病毒2型阳性样品； 
特异性研究 
动物及动物源性样品中会混合感染多种病毒及细菌，因此该方法必须能够特异的检测PCV2，同时检测了常见的猪病毒及细菌，确定该方法的特异性，实验结果见附图4； 
灵敏性检测 
以建立的荧光定量PCR体系做定性样品检测，结果显示：96.8％的样品为猪圆环病毒2型阳性，比定性PCR检测的检出率提高了20.3％。 

Claims (1)

1.一种猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法，其特征在于，按下列步骤进行：
a、设计与合成实时荧光定量PCR检测的引物对，其序列为：上游引物F：5’-CCCTATGTAAACTACTCCTC-3’和下游引物R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’；
b、设计与合成实时荧光定量PCR检测的MGB-TaqMan探针，其序列为：5’-(FAM) ACCATAACCCAGCCCTTCTCC (MGB)-3’；
c、阳性对照标准品的制备：阳性对照标准品为实验室构建的含有PCV2ORF2序列的克隆质粒pMD18T-PCV2，PCV2ORF2序列来源于GeneBank，在保守序列区设计一对特异性引物，克隆载体pMD18-T，将制备的质粒进行定量，使最终浓度为1×1010copies/μl，温度-20℃保存；
配制PCR反应体系，按照PCR反应程序进行反应得到目的片段，所述PCR反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5μl，上下游引物各0.5μl，基因组DNA2μl，去离子水补加至总体积25μl；PCR反应程序为：95℃ 5min，95℃ 30s，58.6℃30s，72℃2min，72℃ 10min，35循环；
配制连接反应液，转化并提取质粒模板，所述连接反应液为快速连接混合液5μl，pMD18-T载体1μl，PCR产物3μl，补加去离子水至总体积10μl；
测定质粒浓度，使最终浓度为1×1010copies/μl；
d、定量PCR检测：将梯度稀释的标准质粒作为模板进行定量PCR检测，配制定量PCR反应体系为：Premix EX Taq 12.5μl，上下游引物各0.5μl，探针0.25μl，基因组DNA2μl，去离子水补加至总体积25ul，反应程序为：温度95℃ 30s，温度95℃ 5s，温度57.4℃ 30s，40个循环，绘制标准曲线，然后以待测样品DNA和标准品为模板做定量PCR检测。
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