CN102888471B

CN102888471B - SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒P1的引物

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Publication number: CN102888471B
Application number: CN201210436587.1A
Authority: CN
Inventors: 温立斌; 何孔旺; 高晓静; 王小敏; 李彬; 郭容利; 俞正玉; 茅爱华; 倪艳秀; 张雪寒; 吕立新; 周俊明; 胡屹屹; 汪伟; 叶青; 祝昊丹; 于洋; 沈江萍; 周萍
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-11-06
Filing date: 2012-11-06
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2032-11-06
Also published as: CN102888471A

Abstract

本发明涉及一种利用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测类猪圆环病毒P1的方法，属于分子生物学领域。本发明方法包括特异性引物的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化、样本DNA提取及结果检测判定。本发明检测灵敏度高，稳定性高、特异性好，可以检测样本中类猪圆环病毒P1的含量，同时可以鉴别样本中猪圆环病毒2型的感染。

Description

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒P1的引物

技术领域

本发明涉及一种类猪圆环病毒P1(即是类猪圆环病毒2型因子P1，见温立斌等，一株类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定与分析，中国农业科学，2010年02期，411~416)的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测引物，属于分子生物学领域。

背景技术

猪圆环病毒（porcine circovirus, PCV）属于圆环病毒科，圆环病毒属，为单股环状DNA病毒，是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，可引起圆环病毒相关疾病，其中最重要的是猪断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）。本病最早发现于加拿大（1991），很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，除PMWS外，PDNS（猪皮炎与肾病综合征）、PNP（增生性坏死性肺炎）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。此外，PCV2感染可导致机体免疫抑制，引起免疫失败以及继发感染，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为引起猪免疫障碍的重要传染病(Segale′s等 Porcine circovirus diseases . Anim Health Res Rev, 2005, 6: 119–142)。

类猪圆环病毒P1是新近发现的病毒，可引起感染猪出现类似PMWS症状（Wen 等 A novel porcine circovirus-like agent P1 is associated with wasting syndromes in pigs. PLoS ONE 2012, 7(8): e41565）。它不仅拥有单股环状DNA基因组，而且其核苷酸序列大部分与PCV2的高度同源（Wen 等 Complete genome sequence of a novel porcine circovirus-like agent. J Virol. 2012, 86(1): 639）。SYBR Green I是一种双链DNA结合染料，其特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。与其他实时荧光定量PCR技术相比，SYBR Green I在核酸的实时检测方法有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，而且通过融解曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，区分非特异性扩增。由于P1拥有与PCV2高度同源的序列，目前报道的诊断P1的定量PCR方法尚无法鉴别P1和PCV2，只能结合普通PCR结果综合判断(温立斌等SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1.华北农学报.2009，4：31-35)。本发明利用反向PCR原理，设计新型特异性引物，采用的绝对定量技术，为样本中类猪圆环病毒P1载量消长规律等方面的研究提供方法，为P1流行病学监测、致病机理的研究提供技术支持。同时还可区分P1与PCV2的感染提供技术平台。

发明内容

技术问题

本发明的目的是克服现有技术中存在的上述不足，提供一种类猪圆环病毒P1的荧光定量PCR检测引物和方法。该方法的检测灵敏度可达10¹个拷贝的病毒分子，具有良好的特异性和重复性。不仅可对P1进行定量，还可对PCV2定性加以鉴别，从而为类猪圆环病毒P1的检测和监控提供有效方法。

技术方案

一种类猪圆环病毒P1的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，

上游引物： 5' AAGACCCCCCACTTAAACCC 3' ；

下游引物： 5' GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT 3'

其目的扩增片段为119 bp，扩增序列具体如下： AAGACCCCCCACTTAAACCCTAAATGAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC。

所述的引物用于类猪圆环病毒P1的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法为：

（1）定量标准质粒的构建与制备

以提取的类猪圆环病毒P1 DNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增含有靶序列的基因片段，PCR反应体系为 2×PCR TaqMix 12.5μL、50μmol/L的上游引物0.25μL、50μmol/L的下游引物0.25μL、DNA模板2.5μL、无菌双蒸水9.5μL，总反应体系为25μL；

反应条件为：94℃预变性5min，94℃变形30s,56℃退火30s,72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10 min。PCR反应结束后，产物于质量比2%琼脂糖凝胶中进行电泳；

PCR产物经电泳鉴定后，通过胶回收纯化目的片段，然后将目的片段119 bp与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，进行测序鉴定，重组质粒用质粒小提试剂盒进行提纯，获得定量标准质粒；

（2）抽提样品病毒DNA，与标准质粒按照以下定量PCR反应体系和程序进行扩增：

PCR反应体系为：12.5μL 2×UltraSYBR Mix, 10μM正向引物、反向引物各0.025μL，待测样品的DNA 2μL，补充双蒸水至25μL；

PCR反应程序为：95℃ 10min; 95℃ 15 sec, 60℃ 30 sec,进行40个循环；

待测样品的结果判定：当待测样品实时荧光定量PCR检测结果有“S”型扩增曲线，Ct值≤34.0且 Tm值介于82.0℃——83.0℃之间时，判定待测样品中含有类猪圆环病毒P1。

有益效果

本发明采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR进行类猪圆环病毒P1的检测，具有以下优点和效果：

1. 检测快速、高效：该检测方法在PCR反应结束后，可立即通过仪器自带软件进行结构判定，不需要琼脂糖凝胶电泳、EB染色来观察结果，减少了环境污染和样品交叉污染，从核酸提取到结果判定仅需3小时，一次可以进行96个样品的检测。

2. 准确定量：通过制备标准品及绘制标准曲线，再根据待测样品的Ct值，可以对待测样品中的类猪圆环病毒P1进行定量，准确度高。

3. 精确定量，灵敏度高：在标准品10⁰——10⁸拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达9个数量级，检测下限可达10个拷贝以下，具有极高的灵敏度。

4. 特异性强：特异性引物可与类猪圆环病毒P1特异性结合，与PCV2虽然也可结合，但通过融解曲线分析，可以鉴别PCV2的感染，解决了以前定量PCR技术无法鉴别P1与PCV2混合感染的问题。

附图说明

图1. 类猪圆环病毒P1绝对定量的标准曲线示意图

图2.实施例中荧光定量PCR特异性检测的融解曲线图 (A) P1; （B）PCV2; (C–E) PRV, PRRSV和PPV

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域的技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和实质，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验试剂和材料

类猪圆环病毒P1、猪圆环病毒2型PCV2 、猪细小病毒PPV、猪伪狂犬病毒PRV和猪蓝耳病病毒PRRSV均为公知公用（(类猪圆环病毒P1即是类猪圆环病毒2型因子P1，见温立斌等，一株类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定与分析，中国农业科学，2010年02期，411~416；猪圆环病毒2型PCV2 、猪细小病毒PPV、猪伪狂犬病毒PRV见潘群兴等，检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法，中国病毒学，2005年6期，603~606；猪蓝耳病病毒PRRSV见李彬等，我国长江流域PRRSV ORF3基因的遗传变异分析，华北农学报，2011年3期，204~209）由江苏省农业科学院兽医研究所自行分离、鉴定及提供，DH5α购于北京全式金生物技术有限公司，pMD18-T载体购于TaKaRa Biotechnology Co., Ltd，胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于Biomiga公司，病毒DNA提取试剂盒购于北京天恩泽基因科技有限公司，ABI 7500型定量PCR仪购于美国生物应用系统公司。

实验方法

1. 引物设计

从基因数据库中检索获得所有类猪圆环病毒P1的基因组序列，通过DNAman软件进行序列比对，得到类猪圆环病毒P1的特异性保守序列。通过OLIGO6.0软件对该保守序列进行引物设计，得到一对特异性引物，目的扩增片段为119bp。

上游引物： 5' AAGACCCCCCACTTAAACCC 3' ；

下游引物： 5' GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT 3'。

2. 定量标准质粒的构建与制备

以提取的GenBank登录号为：EF514716的类猪圆环病毒2型因子P1基因组全长质粒DNA序列（公知公用，见温立斌等，一株类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定与分析，中国农业科学，2010年02期，P413左1.3.3 部分PCR产物的克隆与测序）为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增含有靶序列的基因片段，PCR反应体系为 2×PCR TaqMix 12.5μL、上游引物（50μmol/L）0.25μL、下游引物（50μmol/L）0.25μL、DNA模板2.5μL、无菌双蒸水9.5μL，总反应体系为25μL。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变形30s,56℃退火30s,72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10 min。PCR反应结束后，产物于2%琼脂糖凝胶中进行电泳。

PCR产物经电泳鉴定后，通过胶回收纯化目的片段，然后将目的片段与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，进行测序鉴定。

重组质粒用质粒小提试剂盒进行提纯，获得定量标准质粒。根据紫外分光光度计测定OD260和OD280值计算质粒浓度，并换算为质粒拷贝数。

质粒浓度（μg/μl）=OD260×稀释倍数×50/1000；

质粒拷贝数=质粒浓度×6.02×10²³/1000M，M为质粒分子量

3. 荧光定量PCR方法的优化与建立

通过对反应体系中不同浓度的定量PCR引物，变性、退火/延伸的温度和时间等实验结果进行比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增曲线、反应效率接近于1的反应体系。本发明使用的荧光定量PCR仪为ABI 7500。经优化后确定反应体系采用两步法，95℃预变性 10min; 95℃变性 15 sec, 60℃退火/延伸 30 sec,进行40个循环。25μl最佳反应体系为：

Figure 2012104365871100002DEST_PATH_IMAGE002A

4.灵敏性分析

用无菌TE缓冲液将定量标准质粒稀释至4.5×10⁸、4.5×10⁷、4.5×10⁶、4.5×10⁵、4.5×10⁴、4.5×10³、4.5×10²、4.5×10¹、4.5×10⁰copies/μl ,用上述优化后的最佳反应体系进行反应，检测结束后荧光PCR仪自动绘制标准曲线。结果表明，本方法检测范围可达9个数量级，在此数量级的范围内都有“S”型扩增曲线，在10⁸~10⁰范围内具有良好的线性关系，灵敏度可达10个拷贝以下（图1）。

5.特异性分析

以10⁶ copies/μl的含有特定类猪圆环病毒P1基因组片段的标准质粒， PPV、PCV2、 PRV的DNA和PRRSV的cDNA为模板进行特异性检测，结果显示，实验过程中PPV、 PRV和PRRSV的模板中无荧光量的增加，虽然PCV2的模板中可见荧光量的增加，但通过融解曲线分析可将P1与PCV2鉴别开来（图2）。说明本发明设计的特异性引物具有很好的特异性。

6.稳定性分析

选取4个不同浓度的定量标准质粒（10⁷~10⁴ copies/μl），分别进行批间重复检测和批内重复检测，每个浓度重复三次进行，通过检测其Ct值得变异系数进行稳定性的评价，从下表可以看出批内变异系数在0.12%~0.67%之间，批间变异系数在2.02%~3.04%之间。说明本检测方法稳定性良好。

Figure 2012104365871100002DEST_PATH_IMAGE004

7.病毒DNA的提取及结果判定

采用北京天恩泽基因科技有限公司柱式病毒DNAout kit抽提病毒DNA，与标准质粒按照优化的定量PCR反应体系，一并用美国生物应用系统公司ABI 7500型定量PCR仪进行扩增。因为建立的标准品浓度最低为9个拷贝，对应的Ct值为33.98，因此以Ct值34作为判定待测样品结果的界限，检测限为10个拷贝以下。

虽然高拷贝的PCV2模板中也可见少量荧光量的增加，也呈“S”型扩增曲线，但其融解温度不在类猪圆环病毒P1的82.0℃——83.0℃之间，借此可以鉴别开来。

本发明所述的一种类猪圆环病毒P1实时荧光定量PCR检测方法简单、快速、准确、特异性强、稳定性好，检测极限低。同时采用设计的反向扩增引物，其扩增P1与PCV2基因片段的长短不同，因此扩增效率与融解温度有所不同，表现为高拷贝的PCV2只能扩增出较低拷贝数的模板，同时融解温度也不同，所以可有效鉴别P1与PCV2的感染。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒P1的引物

<130> 0

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 上游引物：

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 1

aagacccccc acttaaaccc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 下游引物：

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 2

gagaggcggg tgttgaagat 20

Claims

1.一种类猪圆环病毒P1的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，

上游引物： 5' AAGACCCCCCACTTAAACCC 3' ；

下游引物： 5' GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT 3'

其目的扩增片段为119 bp。