CN110229932A - 非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒 - Google Patents

非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明选择非洲猪瘟病毒高度保守的p72基因作为检测靶基因，设计特异性引物，建立荧光等温扩增检测方法并研制成非洲猪瘟病毒核酸免提取的检测试剂盒。本发明采用荧光染料指示扩增反应结果，便于准确判定；使用核酸免提取反应液处理样本，无需提取样品DNA，简化了试验操作、减少交叉污染并能降低成本；整个检测过程速度快，只需50min；一次可检测多个样品；所用的荧光恒温扩增仪器成本低；具有扩增效率高、特异性好的优点；适于在生猪养殖、屠宰、检疫、监测的现场及基层单位使用。

Description

非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种非洲猪瘟病毒核酸荧光等温扩增检测技术及成套试剂盒，属于微生物检测技术领域。
背景技术
非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染家猪和各种野猪引起一种烈性传染病，强毒株感染后可导致动物100％的死亡率，该病对全球养猪业造成巨大威胁和经济损失。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病，也是我国重点防范的一类动物疫病。2018年8月3日我国确诊首例非洲猪瘟疫情，之后该病在我国大多数省份相继发生。由于在世界范围内尚未研发出可以有效预防非洲猪瘟的疫苗，该病防控主要依赖及时准确的早期病毒检测，彻底扑杀和处理感染猪，以阻止疫病的扩散蔓延。因此，提升检测能力是该病防控的重要措施之一。
检测非洲猪瘟病毒的常用方法是病毒核酸检测，世界动物卫生组织（OIE）推荐了非洲猪瘟病毒的普通PCR和荧光PCR检测技术，但是普通PCR检测操作容易造成病毒核酸扩增产物污染；而荧光PCR技术则需要价格昂贵的荧光PCR仪，从核酸提取到完成全部检测过程，通常需要2个小时以上。因此，这些检测技术不能满足我国当前在养殖和屠宰环节开展现场快速检测的需要。
核酸等温扩增技术是一种新兴的基因扩增技术,与广泛应用的PCR和荧光PCR相比，具有许多优点。该方法不需要贵重仪器（恒温即可）、操作简单、速度快、灵敏度高，因此得到越来越广泛的应用。现有的核酸等温扩增方法，主要依靠肉眼观察反应溶液的颜色变化来判定结果，主观性强、准确性差。本发明采用荧光剂对双链DNA扩增产物进行染色，用阅读仪检测荧光信号来判定结果，提高了准确性；本发明采用免提取反应液，处理并释放样品中的病毒DNA，直接进行扩增反应，不必提取样品中的DNA，减少了操作步骤和成本，缩短了检测时间，消除了核酸提取过程中的交叉污染；本发明针对非洲猪瘟病毒p72基因设计了6条特异性引物，从而保证扩增的特异性。本发明综合运用这些技术，最终建立了新的非洲猪瘟病毒核酸快速检测方法和试剂盒。本发明相比目前广泛使用的PCR和荧光PCR检测方法，具有检测速度快、灵敏度高、操作简便、试剂与设备成本低等优点，适合在生猪养殖、屠宰、检疫、监测的现场和基层单位使用。本发明的试剂盒于2019年1月通过中国动物疫病预防控制中心组织的非洲猪瘟快速检测试剂评价，是目前唯一被推荐全国使用的非洲猪瘟病毒等温扩增试剂盒（主要技术内容未公开）,对于该病应急防控发挥了重要作用，具有良好应用前景。
发明内容
本发明的目的是建立免提取核酸的非洲猪瘟病毒荧光等温扩增检测方法及试剂盒，使检测过程简便易行，结果判读精确，不用借助昂贵仪器，降低检测成本，检测总时间缩短至50分钟，为非洲猪瘟病毒检测提供快速、灵敏、特异、低成本的技术手段。
为实现上述发明目的，本发明采用Bst DNA聚合酶等温扩增技术、组织样本核酸免提取技术和荧光指示剂，建立非洲猪瘟病毒荧光等温扩增检测方法，研制成试剂盒，具体内容如下：
1.等温扩增引物设计：参考非洲猪瘟病毒24个基因型参考毒株和中国流行病毒株的p72基因序列，筛选保守区域，设计6条引物：
ASFB3：5’-GTAGACGCAATATACGCTTTA-3’；SEQ ID NO.1；
ASFF3：5’-GCCATTTAAGAGCAGACATT-3’；SEQ ID NO.2；
ASFBIP：5’-GTGTATTTCAGGGGTTACAAACAGGTTTTGGAGTCATTAATGAAATCTCGC-3’；SEQ IDNO.3；
ASFFIP：5’-GTAAAACGCGTTCGATTTTCCCTTTTGTGGTGGTTATTGTTGGTGT-3’；SEQ ID NO.4；
ASFLB：5’-GATGTAAAGTTCATTATTCGTG-3’；SEQ ID NO.5；
ASFLF：5’-TGATACGTGTCCATA-3’；SEQ ID NO.6。
2.引物溶液配制：将人工合成引物ASFF3、ASFB3、ASFFIP、ASFBIP用DEPC处理水稀释至20μmol/L，将人工合成引物ASFLF、ASFLB用DEPC处理水稀释至40μmol/L；将稀释后的引物按ASFF3:ASFB3:ASFFIP:ASFBIP:ASFLF:ASFLB=0.25:0.25:2:2:0.5:0.5的比例混匀。
3.制备阳性对照：以常规方法克隆非洲猪瘟病毒p72基因，构建pMD20-T-VP72载体重组质粒，对质粒中的p72基因进行序列测定。测序结果正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，作为阳性对照。
4.10×等温扩增免提取缓冲液的配制：称取Trisbase：24.23g，KCl：3.73g，(NH4)2 SO4：7g，MgSO47H2O：2.465g，Triton X-100：5mL，Brij-58：5g，加DEPC处理水至400mL，盐酸调pH值至8.8（25℃），定容至500mL。高压灭菌冷却后，置于2~8℃保存备用。
5.荧光等温扩增免提取反应液的制备：取10×等温扩增免提取缓冲液2.5 mL、引物液5.5 mL、5 mol/L 甜菜碱溶液4 mL、10 mmol/L dNTP Mixture 3.5 mL、100 mmol/LMgSO4 溶液1.5 mL、0.1%SYBR GreenI液0.5 mL、0.1%DEPC处理水4.5 mL，混匀后（全程无菌低温）用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
6. Bst DNA聚合酶的制备：Bst DNA聚合酶为外购商品（ NEB 公司），浓度为8U/μL，1000μL/管。将Bst DNA聚合酶无菌定量分装，加贴标签。
7. 矿物油的制备：将液体石蜡油定量分装成小管，加贴标签。
8. 阴性对照的制备：0.1%DEPC水溶液，无菌分装，加贴标签。
9.检测方法与步骤：
（1）在0.2 mL反应管中，每管加入荧光等温扩增免提取反应液22μL和Bst DNA聚合酶1.0μL，再每管加入20μL 矿物油。
（2）加样：每管底部加入1：5稀释的被检测猪血液或组织研磨液2.0μL ，同时设置阳性及阴性对照管。盖紧管帽，瞬时离心，放入专用荧光恒温扩增仪或普通荧光 PCR仪。
（3）经过优化的反应参数：采用64℃、50min，每1min采集一次FAM通道荧光信号，共采集50次。当无Tt（Time Threshold）值，且无特征性扩增曲线，判定样品为阴性；当Tt值≤45.0，且出现典型的扩增曲线，判定样品为阳性；当Tt值＞45.0，且出现典型的扩增曲线，应重做，仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
10.本发明的还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对的组合产品，优选还包括荧光等温扩增免提取反应液（内含SYBR GreenI荧光剂）、Bst DNA 聚合酶、阴性对照以及阳性对照中的一种或多种。优选的，所述Bst DNA聚合酶可加入所述荧光等温扩增免提取反应液中进行整合包装。本发明所述的试剂盒，其中还包含阳性对照和阴性对照；阳性对照为pMD20-T- VP72重组质粒；所述阴性对照为无核酸水。本发明提供的试剂盒能够用于检测非洲猪瘟病毒，可以用于猪的血液和组织中的非洲猪瘟病毒检测。
11.试剂盒验证方法：（1）将阳性对照质粒倍比稀释为10-1～10-6，按9中方法进行检测，验证本试剂盒的灵敏度应达到10-3。(2)检测猪瘟病毒核酸、口蹄疫病毒核酸、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒核酸、伪狂犬病毒核酸，验证本试剂盒的特异性，应无阳性交叉反应。
本发明选择非洲猪瘟病毒高度保守的p72基因作为检测靶基因，设计特异性引物建立ASFV特异性的荧光等温扩增检测方法。本发明采用Bst DNA聚合酶，具有扩增效率高、特异性好的优点；采用荧光染料指示反应结果，便于准确判定；无需提取样品DNA,简化了检测操作；整个检测过程速度快，只需50min。且本发明一次可检测多个样品，适于大批样品的检测。
具体实施方式
以下对本发明做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施实例1：引物设计及非洲猪瘟病毒pMD20-T-VP72基因重组质粒的构建
1.引物设计：根据GenBank上收录的非洲猪瘟病毒24个基因型参考毒株p72基因序列(见表1)，筛选保守区域，设计8对共16条引物，并进行比较和筛选。
表1非洲猪瘟参考毒株
最终确定的等温扩增引物的核苷酸序列如下：
ASFB3：5’-GTAGACGCAATATACGCTTTA-3’；SEQ ID NO.1；
ASFF3：5’-GCCATTTAAGAGCAGACATT-3’；SEQ ID NO.2；
ASFBIP：5’-GTGTATTTCAGGGGTTACAAACAGGTTTTGGAGTCATTAATGAAATCTCGC-3’；SEQ IDNO.3；
ASFFIP：5’-GTAAAACGCGTTCGATTTTCCCTTTTGTGGTGGTTATTGTTGGTGT-3’；SEQ ID NO.4；
ASFLB：5’-GATGTAAAGTTCATTATTCGTG-3’；SEQ ID NO.5；
ASFLF：5’-TGATACGTGTCCATA-3’；SEQ ID NO.6。
2.pMD20-T-VP72重组质粒的构建：根据已发表的非洲猪瘟病毒(GenBank:AM999764）VP72基因序列，委托上海奕跃生物科有限公司合成VP72基因，克隆到pMD20-T载体，形成pMD20-T-VP72质粒。按常规方法转化Top10细菌感受态细胞（购买的产品），用氨苄抗性的琼脂平板筛选克隆菌，用PCR鉴定。PCR反应体系：25 μL的反应体系中，含有2.5 μL10 × PCR 缓冲液，2 μL 2.5mmol/L的dNTPs，10 μmol/L的上下游引物VP72F（5 ’ -ATGGCATCAGGAG GAGCTT-3 ’）、VP72R（5 ’ -TTAGGTACTGTAACGCAGCACAG -3 ’）各0.5μL，5U/μL Taq酶0.5 μL，菌液1μL。PCR反应程序：94℃/5 min；94℃/30sec，54℃/30sec，72℃/2min，30个循环；最后72℃延伸10 min。将PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒，送测序公司进行测序，测序结果与参考模板的序列比对一致。
实施例2非洲猪瘟病毒荧光等温扩增反应体系的建立
通过对非洲猪瘟病毒VP72基因序列进行比对分析，设计并筛选引物，初步建立非洲猪瘟病毒荧光等温扩增检测方法，并对该检测方法的引物浓度、Mg2+浓度、SYBR GreenI荧光染料用量、Bst DNA 聚合酶用量、反应温度等反应条件进行优化选择，从而确定该检测方法的最适条件：
反应体系共25μL，包括荧光等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、模板三部分。其中，一个检测的反应液由2.5μL的10 × Thermopolbuffer、5.5 μL的引物液、4 μL 5 mol/L甜菜碱溶液、3.5μL dNTP Mix（10 mmol/L）、1.5 μL的MgSO4（100 mmol/L）、0.5 μL的SYBR GreenI液及4.5 μL 的DEPC处理水组成；一个检测的Bst DNA聚合酶由1μL 的Bst DNA聚合酶（8 U/μL）组成；一个检测的模板为2.0 μL样品组成；最后在25μL反应体系的基础上加20 μL矿物油（液体石蜡油）。可以使用荧光恒温扩增仪或者常用的荧光PCR仪。
最终确定非洲猪瘟病毒荧光等温扩增检测方法的扩增条件是64℃、50 min，每分钟收集一次荧光。当无Tt（Time Threshold）值，且无特征性扩增曲线，判定样品为阴性；当Tt值≤45.0，且出现典型的扩增曲线，判定样品为阳性；当Tt值＞45.0，且出现典型的扩增曲线，应重做，仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
实施例3非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒的组装
1.按如下方法配制试剂盒的各组份：
(1)引物溶液配制：将人工合成引物ASFF3、ASFB3、ASFFIP、ASFBIP用DEPC处理水稀释至20μmol/L，将人工合成引物ASFLF、ASFLB用DEPC处理水稀释至40μmol/L，按ASFF3:ASFB3:ASFFIP:ASFBIP:ASFLF:ASFLB=0.25:0.25:2:2:0.5:0.5的比例将稀释后的引物混匀。
(2)制备阳性对照：以常规方法克隆非洲猪瘟病毒p72基因，构建pMD20-T-VP72重组质粒，对质粒中的p72基因进行序列测定。测序结果正确后，转化大肠杆菌获得的重组质粒菌，将其扩大培养，提取重组质粒。用Nanodrop2000仪器测定重组质粒的含量，再计算出每微升体积中p72基因DNA的拷贝数，用TE缓冲液稀释至104拷贝数/μL，按照200μL/管的规格进行无菌定量分装，作为试剂盒的阳性对照。
(3)10×等温扩增免提取缓冲液的配制：称取Trisbase：24.23g，KCl：3.73g，(NH4)2SO4：7g，MgSO47H2O：2.465g，Triton X-100：5mL，Brij-58：5g，加DEPC处理水至400mL，盐酸调pH值至8.8（25℃），定容至500mL。高压灭菌冷却后置于2~8℃保存备用。
(4)荧光等温扩增免提取反应液的制备：取10×等温扩增免提取缓冲液2.5 mL、引物液5.5 mL、5 mol/L 甜菜碱溶液4 mL、10 mmol/L dNTP Mixture 3.5 mL、100 mmol/LMgSO4 溶液1.5 mL、0.1%SYBR GreenI液0.5 mL、0.1%DEPC处理水4.5 mL，混匀后（全程无菌低温）用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
(5)Bst DNA聚合酶的制备：Bst DNA聚合酶为外购商品（NEB公司），8U/μL，1000μL/管。将Bst DNA聚合酶无菌定量分装，加贴标签。
(6)矿物油的制备：将液体石蜡油定量分装成小管，加贴标签。
(7)阴性对照的制备：0.1%DEPC水溶液，无菌分装，加贴标签。
按以下要求组装成试剂盒：
将荧光等温扩增免提取反应液、Bst DNA聚合酶、矿物油、阴性对照及阳性对照等按表2要求数量，用外包装盒包装，加贴签（包含标识名称、批号、生产日期、保存期和生产单位信息等）。
表 2 非洲猪瘟病毒荧光等温扩增检测试剂盒（免提取） 组成清单
组 份 规 格
荧光等温扩增免提取反应液 1100 μ L/管×1管
Bst DNA 聚合酶 50 μ L/管×1管
阴性对照 1000 μ L/管×1管
阳性对照 200 μ L/管×1管
矿物油 1000 μ L/管×1管
说明书 1 份/盒
实施例4：非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒灵敏度验证
用DEPC处理水将pMD20-T-VP72重组质粒（DNA含量为104拷贝/μL）作1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释，作为敏感性质控样品。按照试剂盒的“用法与判定”进行检测和判定。1:10、1:100、1:1000质控样品的检测结果均为阳性，1:10000为阳性或阴性，1:100000为阴性。检测40份经临床确诊为非洲猪瘟病毒阳性的样品，包括猪血液、淋巴结和脾脏组织，检测结果均为阳性。
实施例5：非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒特异性试验
采用3个批次的非洲猪瘟病毒荧光等温扩增检测试剂盒，检测高致病性猪蓝耳病疫苗、猪瘟冻干弱毒疫苗、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2 型和正常猪淋巴结、脾脏10%悬液的核酸，均无阳性交叉反应。对60份临床诊断并鉴定为阴性的样品进行检测，结果全部为阴性，特异性为100%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京森康生物技术开发有限公司
<120> 非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒
<130> 2019
<141> 2019-06-20
<150> 2019104943623
<151> 2019-06-10
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
gtagacgcaa tatacgcttt a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
gccatttaag agcagacatt 20
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
gtgtatttca ggggttacaa acaggttttg gagtcattaa tgaaatctcg c 51
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
gtaaaacgcg ttcgattttc ccttttgtgg tggttattgt tggtgt 46
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 5
gatgtaaagt tcattattcg tg 22
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 6
tgatacgtgt ccata 15

Claims (4)

1.一种快速检测非洲猪瘟病毒的核酸免提取的荧光等温扩增试剂盒，包括6条特异性引物，其核苷酸序列如下：
ASFB3：5’-GTAGACGCAATATACGCTTTA-3’；SEQ ID NO.1；
ASFF3：5’-GCCATTTAAGAGCAGACATT-3’；SEQ ID NO.2；
ASFBIP：5’-GTGTATTTCAGGGGTTACAAACAGGTTTTGGAGTCATTAATGAAATCTCGC-3’；SEQ IDNO.3；
ASFFIP：5’-GTAAAACGCGTTCGATTTTCCCTTTTGTGGTGGTTATTGTTGGTGT-3’；SEQ ID NO.4；
ASFLB：5’-GATGTAAAGTTCATTATTCGTG-3’；SEQ ID NO.5；
ASFLF：5’-TGATACGTGTCCATA-3’；SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包荧光等温扩增免提取反应液（内含SYBR GreenI荧光染色剂）、Bst DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照以及矿物油中的一种或多种。
3.一种非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒的制备方法，具体包括：
（1）引物溶液配制：按权利要求1所述核苷酸序列合成引物，将人工合成引物ASFF3、ASFB3、ASFFIP、ASFBIP用DEPC处理水稀释至20μmol/L，将人工合成引物ASFLF、ASFLB用DEPC处理水稀释至40μmol/L；将稀释后的引物按ASFF3:ASFB3:ASFFIP:ASFBIP:ASFLF:ASFLB=0.25:0.25:2:2:0.5:0.5的比例混匀；
（2）荧光等温扩增免提取反应液的制备：0.1%SYBR GreenI液0.5 mL、10倍浓度反应缓冲液2.5 mL、引物液5.5 mL、5 mol/L甜菜碱溶液4 mL、10 mmol/L dNTP Mixture 3.5 mL、100 mmol/L MgSO4溶液1.5 mL、0.1%DEPC处理水4.5 mL，混匀后用滤膜除菌，分装成小管；
（3）Bst DNA聚合酶的制备：浓度为8U/μL，按1000μL/管无菌分装；
（4）制备阳性对照：以常规方法克隆非洲猪瘟病毒p72基因，构建pMD20-T-VP72载体质粒，对质粒中的p72基因进行序列测定；测序结果正确后，转化Top10细菌感受态细胞，扩大培养，提取质粒作为阳性对照；
（5）经过优化的反应条件为：在反应管中加入荧光等温扩增免提取反应液22μL和BstDNA聚合酶1.0μL，加入20μL矿物油，再加样品2.0μL（无需预先提取核酸）；反应条件参数为64℃、50min，每分钟收集一次荧光信号。
4.权利要求1和权利要求2所述的试剂盒在检测猪血液和猪组织内非洲猪瘟病毒中的应用。
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Cited By (5)

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