CN110157839A - 一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，属于人冠状病毒检测技术领域。所述人冠状病毒具体为HCoV‑229E/HCoV‑NL63/HCoV‑OC43/HCoV‑HKUI；所述检测试剂盒具体包括：特异性引物对和探针四组，阳性质控品和阴性质控品；所述每组异性引物对和探针均包括一对特异性引物对和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列；阴性质控品为去离子水或无菌水。本发明试剂盒可单管实现同时检测四种人冠状病毒，不仅检测特异性强、检测灵敏度高，而且检测时间快，避免了逐个检测所带来的耗时长、检测成本高、容易交叉污染等缺点。目前市场上未见有类似相关产品报道，本发明试剂盒在疾病检测、传染病防控、指导临床治疗等方面具有广阔应用前景。

Description

一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，属于人冠状病毒检测技术领域。

背景技术

人冠状病毒(Human Coronaviruses,hCoVs)感染是引起人类呼吸道疾病的重要病原之一，在常见呼吸道病原体中冠状病毒检出率约为3％-10％，是感染婴幼儿、老人及免疫功能低下的成人，从而引发咳嗽、发热、喉炎、支气管炎以及肺炎等临床症状的重要病原。目前，已知的人冠状病毒共有六种，分别是19世纪六十年代发现的人冠状病毒229E(Humancoronavirus 229E,HCoV-229E)和HCoV-OC43，2003年在我国广东出现的严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)冠状病毒SARS-CoV，2004年在荷兰分离鉴定的新型人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，2005年在香港分离鉴定的新型人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)，以及2012年6月在中东地区出现的中东呼吸综合征(Middle Eastrespiratory syndrome,MERS)冠状病毒MERS-CoV。

流行病学研究表明，HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI这四种人冠状病毒在世界各地均有流行，呈全球性分布，临床症状主要表现为发热、咳嗽、鼻炎、喉炎以及支气管炎、肺炎等，给人类生命健康造成一定的负担。SARS-CoV和MERS-CoV这两种冠状病毒感染人后却能造成急性呼吸道症状，严重者引发呼吸系统和肾功能系统衰竭并造成死亡。SARS-CoV自2003年在我国广东首次出现后共造成全球约9000人感染，约800死亡，死亡率近10％。得益于全球有效的疾病防控措施，目前SARS-CoV已经消失未见流行报道。MERS-CoV作为新近出现第六种人冠状病毒，目前全球已有26个国家及地区报道了确诊病例2428例，死亡839例，死亡率高达34.6％。MERS-CoV目前主要在中东沙特阿拉伯地区流行，韩国在2015年出现过一次集中爆发流行，我国也有一例从韩国输入性病例。MERS-CoV不仅是国内疾控重点监测的传染病，同时也是目前国境口岸严防传入的重要传染病之一。

早期防控是防止传染病输入播散、保障公共卫生安全、维护人类生命健康的前提条件，而开发快速、灵敏、特异的分子检测技术方法是早期防控的关键，同时也为指导临床、合理选择抗病毒药物提供重要依据。目前，针对人冠状病毒的检测技术方法主要包括病毒分离培养、血清学检测法、普通PCR法、等温扩增法、溶解曲线法以及荧光定量RT-PCR法。病毒分离培养、血清学检测法以及普通PCR法是比较常规的检测方法，这些方法在实验过程中面临检测灵敏度较低、检测时间过长、对实验室硬件要求高、对操作人员技术要求较高等诸多缺点，无法保证检测的时效性和结果的准确性。等温扩增法和荧光定量RT-PCR法是目前大多数实验室经常用到的分子检测技术方法。等温扩增法存在检测设备、检测试剂昂贵，极易发生交叉污染导致检测结果不确定性等突出问题，而且仅能实现单一病原体检测，无法实现单管多重检测等问题。溶解曲线法主要利用扩增产物Tm值的差异通过熔融曲线的位置差异来区分，这就要求引物设计必须有Tm值得差异，而单一碱基的差异就会改变Tm值，导致检测结果的不可靠性。在多重检测过程中荧光定量RT-PCR法目前同样面临仅能实现单管单重(最多两重或三重)病原体检测的问题，不仅增加了病原体筛查的次数，使得检测结果的时间大大延长，而且增加了操作过程，极大增大了检测成本，不利于疾病的快速诊断和早期防控。hCoVs快速、准确的检测不仅对监测和防控hCoVs的流行具有重要意义，也为临床早期诊断，合理选择抗病毒药物治疗等提供可靠实验室依据。

发明内容

本发明的目的是解决hCoVs检测过程中耗时较长、检测效率较低、检测成本较高、检测时效性不强等缺陷，提供一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒；其可单管同时检测HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒。

本发明的技术方案，同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，所述人冠状病毒具体为HCoV-229E/HCoV-NL63/HCoV-OC43/HCoV-HKUI；所述检测试剂盒具体包括：特异性引物对和探针四组，阳性质控品和阴性质控品；

所述每组异性引物对和探针均包括一对特异性引物对和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列；阴性质控品为去离子水或无菌水。

根据HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI四种人冠状病毒基因组序列，分别寻找各个冠状病毒的保守序列，作为优选，分别设计了适用于qRT-PCR的特异性引物组和靶探针，引物信息如下：

针对人冠状病毒HCoV-229E，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQID No.1，引物2的序列如SEQ ID No.2；探针1序列如SEQ ID No.3；

针对人冠状病毒HCoV-NL63，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQID No.4，引物4的序列如SEQ ID No.5；探针2序列如SEQ ID No.6；

针对人冠状病毒HCoV-OC43，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQID No.7，引物6的序列如SEQ ID No.8；探针3序列如SEQ ID No.9；

针对人冠状病毒HCoV-HKUI，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQID No.10，引物8的序列如SEQ ID No.11；探针4序列如SEQ ID No.12。

进一步地，采用不同的荧光色对所述四条引物探针进行荧光标记。

进一步地，对所述引物探针的5’端进行标记的荧光基团具体为FAM、VIC、ROX和Cy5，对3’端进行标记的淬灭基团为MGB。

进一步地，组1中探针1的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；组2中探针2的5'端标记VIC荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；组3中探针3的5'端标记ROX荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团；组4中探针4的5'端标记Cy5荧光基团，3'端标记MGB荧光淬灭基团。

具体如下表1所示：

表1

进一步地，所述阳性质控品靶序列中包含了一段覆盖HCoV-229E特异性引物、探针的110bp的目的片段，覆盖HCoV-NL63特异性引物、探针的109bp的目的片段，覆盖HCoV-OC43特异性引物、探针的122bp的目的片段，覆盖HCoV-HKU1特异性引物、探针的143bp的目的片段；所述阳性质控品序列由人工合成后直接用作阳性质控品，或人工合成后构建到质粒载体上，通过摇菌提取克隆质粒作为阳性质控品。

进一步地，所述阳性质控品靶序列具体如SEQ ID No.13。

具体为：

所述四重荧光定量检测试剂盒的应用，将其应用于同时对HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒进行检测。

采用四重荧光定量检测试剂盒进行检测的方法，步骤如下：

(1)样本核酸的提取：取待检测样品，对其进行核酸提取，得到样本核酸；

(2)qRT-PCR检测：采用HCoV-229E/HCoV-NL63/HCoV-OC43/HCoV-HKUI特异性引物和探针序列、2Х反应液、DNA聚合酶和RT逆转录酶及步骤1提取的样本核酸配置反应体系；取阳性质控品和阴性质控品分别配置与样本核酸一致的反应体系；对上述三个反应体系进行qRT-PCR检测；

(3)分析判断：通过步骤(2)阴性质控品所得荧光信号最高点调整阀值，控制阳性质控品在四个检测通道均有S型扩增曲线；随后将样本核酸所得扩增曲线与阳性质控品进行对照，判读结果。

进一步地，可应用于的仪器设备包括但不限于ABI7000/7300/7500/7500Fast/7900HT/StepOned^TM等等，Roche公司的仪器，Bio-Rad公司的仪器，QIAGEN公司的仪器等。

作为优选，以Bio-Rad CFX96仪器为实施例，扩增程序设置如下：42℃反应10min；95℃反应5min；随后进行循环反应40次，循环程序为：94℃反应15～30s，58℃反应45～60s，收集荧光。

检测设置：以Bio-Rad CFX96仪器设置为例，点击“plate”窗口，进入“create New”样本信息编辑界面，在“select Folurophore”中分别选则FAM、VIC、ROX和Cy5荧光通道，分别对应HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI的检测。

步骤(3)分析判断过程具体如下：

a、调整阈值：阈值设定原则为以刚好超过阴性质控品的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整；

b、质量控制：阴性质控品无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，实验成立；否则实验结果无效；

c、结果判定：

c1、若检测样品有S型扩增且Ct或Cq值≤38，根据检测目标所对应的荧光通道进行判读；

c2、若有S型扩增，且38<Ct或Cq值<40，判定为不确定样品，需重新提取核酸后进行检测；

c3、若复检样品与c2的结果一致，则可判定样品为弱阳性；

c4、若无明显S型扩增曲线，但报告有Ct或Cq值，为非特异性扩增，判定为阴性。

本发明的有益效果：本发明可快速同时甄别四种人冠状病毒HCoV-229E/HCoV-NL63/HCoV-OC43/HCoV-HKUI；其具有检测灵敏度高、特异性强、可实现多重快速检测、操作简单、应用方便等突出的优点，为临床诊断、疾病监测检测、检验检疫等领域的病原体快速检测提供了切实可行的技术方法。

附图说明

图1是实施例1样本扩增曲线示意图。

图2是实施例2样本扩增曲线示意图。

图3是实施例3样本扩增曲线示意图。

图4是实施例4样本扩增曲线示意图。

图5是本发明试剂盒与A公司试剂盒对HCoV-HKU1样本扩增曲线示意图。

具体实施方式

本发明实施例中，提供的同时检测HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒qRT-PCR试剂盒含有扩增体系，检测方法如下步骤：

(1)样本制备：样本核酸可从鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液等样本中用核酸提取试剂盒直接提取，或可手动提取，也可用全自动核酸提取仪提取，提取的核酸直接用于下一步扩增反应。

(2)qRT-PCR检测：

选用One-step qRT-PCR Kit(TOYOBO)以25μL反应体系为例具体配置如下：2Х反应液12.5μL；DNA聚合酶1μL；RT逆转录酶1μL；四组特异性引物对共8条，每条引物0.5μL，终浓度0.5μM；四条探针序列各0.375μL，终浓度0.2μM；配置三管上述反应体系，各在其中加入5μL步骤(1)提取的样本RNA、阳性质控品和阴性质控品，随后采用超纯水定容至25μL；

以Bio-Rad CFX96仪器为实施例，扩增程序设置如表2所示。

表2

检测设置：以Bio-Rad CFX96仪器设置为例，点击“plate”窗口，进入“create New”样本信息编辑界面，在“select Folurophore”中分别选则FAM、VIC、ROX和Cy5荧光通道，分别对应MERS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI的检测。

(3)结果分析与判定：

a、调整阈值：阈值设定原则为以刚好超过阴性质控品的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整；

b、质量控制：阴性质控品无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，实验成立；否则实验结果无效；

c、结果判定：

c1、若检测样品有S型扩增且Ct或Cq值≤38，根据检测目标所对应的荧光通道按照表3进行判读；

c2、若有S型扩增，且38<Ct或Cq值<40，判定为不确定样品，需重新提取核酸后进行检测；

c3、若复检样品与c2的结果一致，则可判定样品为弱阳性；

c4、若无明显S型扩增曲线，但报告有Ct或Cq值，为非特异性扩增，判定为阴性。

表3

荧光通道	FAM	VIC	ROX	Cy5
					HCoV-229E	阳性(+)	阴性(-)	阴性(-)	阴性(-)
HCoV-NL63	阴性(-)	阳性(+)	阴性(-)	阴性(-)
					HCoV-OC43	阴性(-)	阴性(-)	阳性(+)	阴性(-)
HCoV-HKU1	阴性(-)	阴性(-)	阴性(-)	阳性(+)

实施例1

待测样品为：咽拭子。

对应表3进行结果判读，具体扩增曲线如图1所示。

如图1，阴性质控品或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在FAM荧光通道出现S型扩增曲线，且Ct(或Cq)值≤38，判读该待检样本HCoV-229E阳性。

实施例2

待测样品为：咽拭子。

对应表3进行结果判读，具体扩增曲线如图2所示。

如图2，阴性质控品或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在VIC荧光通道出现S型扩增曲线，且Ct(或Cq)值≤38，判读该待检样本HCoV-NL63阳性。

实施例3

待测样品为：咽拭子。

对应表3进行结果判读，具体扩增曲线如图3所示。

如图3，阴性质控品或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在ROX荧光通道出现S型扩增曲线，且Ct(或Cq)值≤38，判读该待检样本HCoV-OC43阳性。

实施例4

待测样品为：咽拭子。

对应表3进行结果判读，具体扩增曲线如图4所示。

如图4，阴性质控品或空白对照无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在Cy5荧光通道出现S型扩增曲线，且Ct(或Cq)值≤38，判读该待检样本HCoV-HKU1阳性。

实施例5

选择与人冠状病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他病原体，如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒为待检样本，用本发明试剂盒进行检测，操作严格按照试剂盒说明书进行，在CFX96实时荧光定量PCR仪器上进行检测，检测结果均为阴性，表明本发明试剂盒具备较好检测特异性。

实施例6

选用本发明所述试剂盒与A公司单重检测试剂盒对HCoV-NL63进行检测，结果如图5所示，采用本发明四重qRT-PCR试剂盒与A公司单重检测试剂盒检测HCoV-NL63病毒，本发明所述试剂盒阳性质控品Ct值远低于A公司，且能检出HCoV-NL63阳性。A公司未能检出HCoV-NL63，检测灵敏度低于本发明所述试剂盒。

实施例7

分别使用3个批次的本发明试剂盒对阳性质控品、阴性质控品、中、低三个浓度的标准品进行10次重复检测，批内不精密度Ct值的CV范围为：HCoV-229E为0.69～1.41％，HCoV-NL63为0.72～1.55％，HCoV-OC43为0.77～1.47％，HCoV-HKU1为0.89～1.65％；批间不精密度Ct值的CV范围为：MERS-CoV为1.12～1.19％，HCoV-NL63为1.04～1.40％，HCoV-OC43为1.03～1.52％，HCoV-HKU1为0.95～1.40％；批内和批间精密度Ct值的CV值均小于5％，阴性对照均为阴性，表明本发明试剂盒精密度良好，检测结果如下表4所示。

表4

本发明试剂可单管实现同时检测HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒，不仅检测特异性强、检测灵敏度高，而且检测时间快，避免了逐个检测所带来的耗时长、检测成本高、容易交叉污染等缺点。目前市场上未见有类似相关产品报道，本发明试剂盒在疾病检测、传染病防控、指导临床治疗等方面具有广阔应用前景。

以上显示和描述了发明的基本原理、主要特征和发明的优点。本行业的技术人员应该了解，发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是发明的原理，在不脱离发明精神和范围的前提下发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的发明的范围内。发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110> 中华人民共和国无锡海关

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 一种同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物1(Human coronavirus)

<400> 1

tagaaagggc aaacgggtgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物2(Human coronavirus)

<400> 2

cccagacgac accttcaaca 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 探针1(bioluminescent probe)

<400> 3

cttggcacag gaccccataa agatg 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物3(Human coronavirus)

<400> 4

tcccaggaat cttgtcccta 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物4(Human coronavirus)

<400> 5

aggcaaatca acacgttgcc 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 探针2(bioluminescent probe)

<400> 6

atgttcaaga gcgttggcgt atgcg 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物5(Human coronavirus)

<400> 7

aggaccgcat gctaaagacc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物6(Human coronavirus)

<400> 8

cctcatcgct acttgggtcc 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 探针3(bioluminescent probe)

<400> 9

caaccaggct gatgtcaata ccccg 25

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物7(Human coronavirus)

<400> 10

gcccatatgc caatgcatcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物8(Human coronavirus)

<400> 11

aggcggaaac ctagtaggga 20

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 探针4(bioluminescent probe)

<400> 12

aggggtcttc tgggttgcta atcac 25

<210> 13

<211> 508

<212> DNA

<213> 阳性质控品靶序列(synthetic sequence)

<400> 13

aactagaaag ggcaaacggg tggatttgtc acccaagctg catttttatt atcttggcac 60

aggaccccat aaagatgcaa aatttagaga gcgtgttgaa ggtgtcgtct gggttgcatt 120

cccaggaatc ttgtccctat tggtaagggt aataaagatg agcagattgg ttattggaat 180

gttcaagagc gttggcgtat gcgcaggggg caacgtgttg atttgcctcc taacaggacc 240

gcatgctaaa gaccagtacg gcaccgatat tgacggagtc tactgggtcg ctagcaacca 300

ggctgatgtc aataccccgg ctgacattgt cgatcgggac ccaagtagcg atgaggctac 360

cggcccatat gccaatgcat cctatggtga atccctcgaa ggggtcttct gggttgctaa 420

tcaccaagct gacacttcta ctccctccga tgtttcgtca agggatccta ctactcaaga 480

agctatccct actaggtttc cgcctggt 508

Claims (10)

1.同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述人冠状病毒具体为HCoV-229E/HCoV-NL63/HCoV-OC43/HCoV-HKUI；所述检测试剂盒具体包括：特异性引物对和探针四组，阳性质控品和阴性质控品；

所述每组异性引物对和探针均包括一对特异性引物对和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列；阴性质控品为去离子水或无菌水。

2.如权利要求1所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：

针对人冠状病毒HCoV-229E，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQ IDNo.1，引物2的序列如SEQ ID No.2；探针1序列如SEQ ID No.3；

针对人冠状病毒HCoV-NL63，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQ IDNo.4，引物4的序列如SEQ ID No.5；探针2序列如SEQ ID No.6；

针对人冠状病毒HCoV-OC43，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQ IDNo.7，引物6的序列如SEQ ID No.8；探针3序列如SEQ ID No.9；

针对人冠状病毒HCoV-HKUI，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQ IDNo.10，引物8的序列如SEQ ID No.11；探针4序列如SEQ ID No.12。

3.如权利要求2所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：采用不同的荧光色对所述四条探针序列进行荧光标记。

4.如权利要求3所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：对所述探针序列的5’端进行标记的荧光基团具体为FAM、VIC、ROX和Cy5，对3’端进行标记的淬灭基团为MGB。

5.如权利要求1所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述阳性质控品靶序列中包含了一段覆盖HCoV-229E特异性引物、探针的110bp的目的片段，覆盖HCoV-NL63特异性引物、探针的109bp的目的片段，覆盖HCoV-OC43特异性引物、探针的122bp的目的片段，覆盖HCoV-HKU1特异性引物、探针的143bp的目的片段；所述阳性质控品序列由人工合成后直接用作阳性质控品，或人工合成后构建到质粒载体上，通过摇菌提取克隆质粒作为阳性质控品。

6.如权利要求5所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述阳性质控品靶序列具体如SEQ ID No.13。

7.采用权利要求1-6之一所述四重荧光定量检测试剂盒的应用，其特征是：将其应用于同时对HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒进行检测。

8.采用四重荧光定量检测试剂盒进行检测的方法，其特征是步骤如下：

（1）样本核酸的提取：取待检测样品，对其进行核酸提取，得到样本核酸；

（2）qRT-PCR检测：采用HCoV-229E/HCoV-NL63/HCoV-OC43/HCoV-HKUI特异性引物和探针序列、2Х反应液、DNA聚合酶和RT逆转录酶及步骤1提取的样本核酸配置反应体系；取阳性质控品和阴性质控品分别配置与样本核酸一致的反应体系；对上述三个反应体系进行qRT-PCR检测；

（3）分析判断：通过步骤（2）阴性质控品所得荧光信号最高点调整阀值，控制阳性质控品在四个检测通道均有S型扩增曲线；随后将样本核酸所得扩增曲线与阳性质控品进行对照，判读结果。

9.如权利要求8所述采用四重荧光定量检测试剂盒进行检测的方法，其特征是步骤（2）所述qRT-PCR扩增程序如下：42℃反应10 min；95℃反应5min；随后进行循环反应40次，循环程序为：94℃反应15~30s，58℃反应45~60s，收集荧光。

10.如权利要求8所述采用四重荧光定量检测试剂盒进行检测的方法，其特征是步骤（3）分析判断过程具体如下：

a、调整阈值：阈值设定原则为以刚好超过阴性质控品的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整；

b、质量控制：阴性质控品无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，实验成立；否则实验结果无效；

c、结果判定：

c1、若检测样品有S型扩增且Ct或Cq值≤38，根据检测目标所对应的荧光通道进行判读；

c2、若有S型扩增，且38<Ct或Cq值<40，判定为不确定样品，需重新提取核酸后进行检测；

c3、若复检样品与c2的结果一致，则可判定样品为弱阳性；

c4、若无明显S型扩增曲线，但报告有Ct或Cq值，为非特异性扩增，判定为阴性。