CN111154921A - 基于可视化lamp的新型冠状病毒检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种病原体检测领域，是一种以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测试剂盒及其检测方法，其特点是根据新型冠状病毒ORF1ab基因序列设计特异性扩增引物，利用可视化lamp反应体系检测新型冠状病毒核酸。能实现对新型冠状病毒快速、灵敏、特异、准确的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种病原体检测领域，具体涉及一种以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
冠状病毒（Coronavirus，CoV）是一类严重危害人类和畜禽健康的致病微生物，普遍存在于自然界中，自然宿主包括人、牛、猪、犬、禽、猫、蝙蝠、鼠等，广泛宿主特点和自身基因组结构使其演变过程中较易发生基因变化，呈现基因遗传多样性，新冠状病毒和亚型不断出现。目前已知能感染人的冠状病毒共7种，分别为20世纪60年代发现的人冠状病毒229E（HCoV-229E）和OC43（HCoV-OC43），2003年新出现的SARS冠状病毒（Severe acuterespiratory syndrome virus，SARS-CoV），2004年发现的人冠状病毒NL63 （HCoV-NL63），2005年新发现的人冠状病毒香港I（HCoV-HKU1），2012年在中东地区出现的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），2020在武汉出现的新型冠状病毒（Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。
LAMP 技术是一种新颖的核酸扩增技术，与传统核酸扩增技术比较， LAMP 的主要特点是：
灵敏度和特异性高：检出限仅为几个拷贝，与PCR相比高出几个数量级。利用外引物和内引物与目的片段6个特异性部位准确结合发生扩增反应，只有当2对引物与目的片段6个区域都匹配时才进行扩增。LAMP扩增结果只有是和否，相比于PCR具更高特异性。
检测速度快、扩增效率高：LAMP是恒温扩增反应，无需预先热变性双链DNA，避过PCR退火、复性过程，避免温度循环而造成的时间损失，能够满足临床样本的快速检测需要。60-90分钟内完成基本反应并检测扩增产物，加入环引物后，可在30-45分钟内完成反应。通过链取代并形成不同环结构而大量扩增，促使目的基因在反应时间内连续进行指数扩增，拷贝数可达109-1010，浓度可达0.5mg/mL，高于PCR 103-104倍。
设备简单、 操作简便：由LAMP 反应只需要如水浴锅、金属浴等恒温器即可完成此实验，不需要购置昂贵的PCR仪，易于推广应用。除Bst DNA聚合酶必须在模板预变性以后再加样外，其他与PCR基本相同；由于反应温度恒定，反应后通过判断颜色变化而无需电泳。
产物易检测：根据LAMP反应特性，判断产物结果的方法有琼脂糖凝胶电泳检测法、浊度检测法和荧光比色检测法等。LAMP反应过程中产生多种片段的扩增产物，其在电泳中会形成特异性的梯状条带，此为电泳检测法。由于LAMP反应过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀，可根据是否形成白色沉淀来定性判断结果，此为浊度检测法。通过SYBR GreenⅠ、钙黄绿素（Calcein）荧光染料的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否，阳性为绿色，阴性为橙色，此为荧光比色检测法。另外，通过实时浊度计检测反应过程中焦磷酸镁沉淀产生的浊度实现定量检测。
在国境口岸上有效的诊断新型冠状病毒对防控新冠病毒疫情在国境口岸的输入输出，保护中国和世界人民健康具有重要意义。
发明内容
针对新型冠状病毒的实际需求，本发明提供一种以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测试剂盒，其特点是根据新型冠状病毒ORF1ab基因序列设计特异性扩增引物，利用可视化lamp反应体系检测新型冠状病毒核酸。能实现对新型冠状病毒快速、灵敏、特异、准确的检测，并提供其检测方法。
本发明是由以下技术方案来实现的：
本发明首先设计了一组以可视化lamp为基础的新型冠状病毒ORF1ab基因序列检测特异性扩增引物，序列如下：
F3：TTTTGAACTTGATGAAAGGATTG
B3：TGTAGCCATACTCCACTCA
FIP：CGAACTCATTTACTTCTGTACCGAG-ATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTC
BIP：TGTGGCAGATGCTGTCATAAAA-AATCAATGCCCAGTGGTG。
发明还提供一种以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测试剂盒，包括如下成分：
1）新型冠状病ORF1ab基因序列毒检测特异性扩增引物
F3：TTTTGAACTTGATGAAAGGATTG；
B3：TGTAGCCATACTCCACTCA；
FIP：CGAACTCATTTACTTCTGTACCGAG-ATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTC；
BIP：TGTGGCAGATGCTGTCATAAAA-AATCAATGCCCAGTGGTG。
2）可视化lamp反应体系：10×ThermoPol buffer，MgSO4，dNTPs，内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，0.1% Triton X-100，甜菜碱，Tris-HCl（PH 8.8），（NH4）2 SO4，KCl，羟基萘酚蓝（HNB），Bst DNA polymerase，模板cDNA，超纯水。
另外，本发明设计了一种以可视化lamp为基础的新型冠状病毒的检测方法，包括如下步骤：
1）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒的cDNA获取
使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)提取新型冠状病毒的核酸，使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司)合成新型冠状病毒的cDNA。
2）可视化lamp反应体系：
可视化lamp反应体系：2 μL 10×ThermoPol buffer，6mmol/L MgSO4，1.4 mmol/LdNTPs，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2μmol/L，0.1% Triton X-100，0.8 mmol/L甜菜碱，20 mmol/L Tris-HCl（PH 8.8），10 mmol/L（NH4）2 SO4，10 mmol/L KCl，160 mmol/L HNB，8 U/μL Bst DNA polymerase，2μL模板cDNA，灭菌水补齐至20μL。以fluA、fluB、MERS、229E、HKU1、NL63、OC43为对照，N1和N2为阴性对照。阳性质粒为阳性对照。
3）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒的检测反应程序：
63℃ 1小时，80℃ 10分钟，反应后经2%琼脂糖凝胶电泳和扩增前加入染料HNB作为反应指示剂验证扩增结果。
4）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测的特异性
以其他呼吸道病毒fluA、fluB、MERS、229E、HKU1、NL63和OC43的cDNA为对照，N1（只加入新型冠状病毒扩增引物）和N2（不加任何引物）为阴性对照。阳性质粒为阳性对照。
5）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测的灵敏性
将新型冠状病毒核酸原液使用分光光度计测定浓度，然后进行倍比稀释到十位拷贝数/μL，使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司)合成新型冠状病毒的cDNA。可视化lamp反应体系：2 μL 10×ThermoPol buffer，6mmol/LMgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2μmol/L，0.1% Triton X-100，0.8 mmol/L甜菜碱，20 mmol/L Tris-HCl（PH 8.8），10 mmol/L（NH4）2 SO4，10 mmol/L KCl，160 mmol/L HNB，8 U/μL Bst DNA polymerase，2μL模板cDNA，灭菌水补齐至20μL。 63℃ 1小时，80℃ 10分钟，观察结果。
与现有检测手段相比，本发明的有益效果在于：
1）在国境口岸上有效的诊断新型冠状病毒对防控新冠病毒疫情在国境口岸的输入输出，保护中国和世界人民健康具有重要意义。
2）能实现对新型冠状病毒快速、灵敏、特异、准确的检测。
附图说明
图1：以可视化lamp为基础的新型冠状病毒ORF1ab基因序列检测的特异性。
图2：2%琼脂糖凝胶电泳以可视化lamp为基础的新型冠状病毒ORF1ab基因序列特异性的结果图。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例提供一组以可视化lamp为基础的新型冠状病毒ORF1ab基因序列检测特异性扩增引物，序列如下：
F3：TTTTGAACTTGATGAAAGGATTG
B3：TGTAGCCATACTCCACTCA
FIP：CGAACTCATTTACTTCTGTACCGAG-ATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTC
BIP：TGTGGCAGATGCTGTCATAAAA-AATCAATGCCCAGTGGTG。
实施例2
本实施例提供一种以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测试剂盒，包括如下成分：
1）新型冠状病ORF1ab基因序列毒检测特异性扩增引物
F3：TTTTGAACTTGATGAAAGGATTG
B3：TGTAGCCATACTCCACTCA
FIP：CGAACTCATTTACTTCTGTACCGAG-ATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTC
BIP：TGTGGCAGATGCTGTCATAAAA-AATCAATGCCCAGTGGTG。
2）可视化lamp反应体系：10×ThermoPol buffer，MgSO4，dNTPs，内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，0.1% Triton X-100，甜菜碱，Tris-HCl（PH 8.8），（NH4）2 SO4，KCl，羟基萘酚蓝（HNB），Bst DNA polymerase，模板cDNA，超纯水。
实施例3
本实施例提供了一种以可视化lamp为基础的新型冠状病毒的检测方法，它包括如下步骤：
1）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒的cDNA获取
使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)提取新型冠状病毒的核酸，使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司)合成新型冠状病毒的cDNA。
2）可视化lamp反应体系：
可视化lamp反应体系：2 μL 10×ThermoPol buffer，6mmol/L MgSO4，1.4 mmol/LdNTPs，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2μmol/L，0.1% Triton X-100，0.8 mmol/L甜菜碱，20 mmol/L Tris-HCl（PH 8.8），10 mmol/L（NH4）2 SO4，10 mmol/L KCl，160 mmol/L HNB，8 U/μL Bst DNA polymerase，2μL模板cDNA，灭菌水补齐至20μL。
3）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒的检测反应程序：
63℃ 1小时，80℃ 10分钟，反应后经2%琼脂糖凝胶电泳和扩增前加入染料HNB作为反应指示剂验证扩增结果。
4）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测的特异性
以其他呼吸道病毒fluA、fluB、MERS、229E、HKU1、NL63和OC43的cDNA为对照，N1（只加入新型冠状病毒扩增引物）和N2（不加任何引物）为阴性对照。阳性质粒为阳性对照。
5）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测的灵敏性
将新型冠状病毒核酸原液使用分光光度计测定浓度，然后进行倍比稀释到十位拷贝数/μL，使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司)合成新型冠状病毒的cDNA。可视化lamp反应体系：2 μL 10×ThermoPol buffer，6mmol/LMgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2μmol/L，0.1% Triton X-100，0.8 mmol/L甜菜碱，20 mmol/L Tris-HCl（PH 8.8），10 mmol/L（NH4）2 SO4，10 mmol/L KCl，160 mmol/L HNB，8 U/μL Bst DNA polymerase，2μL模板cDNA，灭菌水补齐至20μL。 63℃ 1小时，80℃ 10分钟，观察结果。
结果见图1-2，新型冠状病毒反应管与阳性对照管相似，蓝色加深，而fluA、fluB、MERS、229E、HKU1、NL63、OC43对照组反应管与N1和N2阴性对照管相似。阳性对照也加深。琼脂糖凝胶电泳显示，新型冠状病毒反应管与阳性对照管均出现梯形扩增条带，而fluA、fluB、MERS、229E、HKU1、NL63、OC43对照组反应管与N1和N2阴性对照管均未出现扩增条带，说明以可视化lamp为基础的新型冠状病毒ORF1ab基因序列检测特异性较好。通过观察以可视化lamp为基础的新型冠状病毒ORF1ab基因序列检测的颜色变化，肉眼判断其灵敏性为1.2*103拷贝数/μL。
本发明利用以可视化lamp为基础的新型冠状病毒ORF1ab基因序列检测新型冠状病毒核酸，拓展了新型冠状病毒检测的视角。本试剂盒可对新型冠状病毒快速、灵敏、特异、准确的检测。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛国际旅行卫生保健中心(青岛海关口岸门诊部)
<120> 基于可视化lamp的新型冠状病毒检测试剂盒及其检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttgaactt gatgaaagga ttg 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtagccata ctccactca 19
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgaactcatt tacttctgta ccgagataaa gtacttaatg agaagtgctc 50
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtggcagat gctgtcataa aaaatcaatg cccagtggtg 40
Claims (3)
1.以可视化lamp为基础的新型冠状病毒ORF1ab基因序列检测特异性扩增引物，其特征在于，序列如下：
F3：TTTTGAACTTGATGAAAGGATTG；
B3：TGTAGCCATACTCCACTCA；
FIP：CGAACTCATTTACTTCTGTACCGAG-ATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTC；
BIP：TGTGGCAGATGCTGTCATAAAA-AATCAATGCCCAGTGGTG。
2.以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，包括如下成分：
1）新型冠状病ORF1ab基因序列毒检测特异性扩增引物
F3：TTTTGAACTTGATGAAAGGATTG；
B3：TGTAGCCATACTCCACTCA；
FIP：CGAACTCATTTACTTCTGTACCGAG-ATAAAGTACTTAATGAGAAGTGCTC；
BIP：TGTGGCAGATGCTGTCATAAAA-AATCAATGCCCAGTGGTG；
2）可视化lamp反应体系：10×ThermoPol buffer，MgSO4，dNTPs，内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，0.1% Triton X-100，甜菜碱，Tris-HCl（PH 8.8），（NH4）2 SO4，KCl，羟基萘酚蓝（HNB），Bst DNA polymerase，模板cDNA，超纯水。
3.以可视化lamp为基础的新型冠状病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒的cDNA获取
使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)提取新型冠状病毒的核酸，使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司)合成新型冠状病毒的cDNA；
2）可视化lamp反应体系：
可视化lamp反应体系：2 μL 10×ThermoPol buffer，6mmol/L MgSO4，1.4 mmol/LdNTPs，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2μmol/L，0.1% Triton X-100，0.8 mmol/L甜菜碱，20 mmol/L Tris-HCl（PH 8.8），10 mmol/L（NH4）2 SO4，10 mmol/L KCl，160 mmol/L HNB，8 U/μL Bst DNA polymerase，2μL模板cDNA，灭菌水补齐至20μL；
3）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒的检测反应程序：
63℃ 1小时，80℃ 10分钟，反应后经2%琼脂糖凝胶电泳和扩增前加入染料HNB作为反应指示剂验证扩增结果；
4）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测的特异性
以其他呼吸道病毒fluA、fluB、MERS、229E、HKU1、NL63和OC43的cDNA为对照，N1（只加入新型冠状病毒扩增引物）和N2（不加任何引物）为阴性对照；阳性质粒为阳性对照；
5）以可视化lamp为基础的新型冠状病毒检测的灵敏性
将新型冠状病毒核酸原液使用分光光度计测定浓度，然后进行倍比稀释到十位拷贝数/μL，使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa公司)合成新型冠状病毒的cDNA；可视化lamp反应体系：2 μL 10×ThermoPol buffer，6mmol/LMgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2μmol/L，0.1% Triton X-100，0.8 mmol/L甜菜碱，20 mmol/L Tris-HCl（PH 8.8），10 mmol/L（NH4）2 SO4，10 mmol/L KCl，160 mmol/L HNB，8 U/μL Bst DNA polymerase，2μL模板cDNA，灭菌水补齐至20μL； 63℃ 1小时，80℃ 10分钟，观察结果。
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