CN107475458B - 鹅星状病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物传染病学检测领域，本发明公开了鹅星状病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。该方法根据鹅星状病毒基因组保守序列设计引物：外引物F3和B3；内引物FIP和BIP；环引物LB。具体序列分别见SEQ ID NO.1‑5。根据所设计的引物建立一种检测鹅星状病毒的环介导等温扩增方法。该检测方法与鹅常见传染病病原不发生交叉反应。本发明的检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高，无需昂贵仪器设备，方便快速，便于基层使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种鹅星状病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，属于动物传染病学检测领域。
背景技术
禽星状病毒属现有3个属（Avastrovirus 1-3），包括鸭星状病毒(Duckastrovirus)、鸟肾炎病毒(Avian nephritisa strovirus)、火鸡星状病毒(Turkeyastrovirus)等火鸡星状病毒其代表种。星状病毒是单股正链、无囊膜的小RNA病毒，其基因组长度大约6.8kb，从5′端至3′端共包含4部分：1个85个核苷酸的5′端非编码区、3个开放阅读框(Open reading frames, ORFs)（ORF1a、ORF1b、ORF2）、1个80个核苷酸的3′端非编码区、1个30个核苷酸的多聚腺苷酸尾巴。
近年来，随着检测技术的不断优化和检测领域的扩展，从人和动物中获得的星状病毒毒株序列与已知的星状病毒毒株序列在遗传进化上距离较远，可能存在多种不同的基因型，其中在鸭群中报道了3种鸭星状病毒（(Duck astrovirus 1、Duck astrovirus 2和Duck astrovirus 3）。2017年，本团队在福建某鹅养殖场送检的病料中，检测到鹅群中存在星状病毒感染（命名为鹅星状病毒GsFJ2017株，GenBank登录号为MF576430），该片段和禽星状病毒代表株（火鸡星状病毒2型）的核苷酸同源性为69.1%，和赤颈鸭（Anas penelope）星状病毒的核苷酸同源性仅为60.6%。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列，LAMP具有许多独特的优点：①LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高。②LAMP技术扩增的特异性非常高，使用的特异性引物可以识别目的序列上特异性的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响。③阳性扩增反应中会产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸续沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加人染料，根据颜色的变化通过荧光照射装置进行紫外光照射检测；还可以利用浊度仪，根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外，LAMP方法还具有特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度（60℃～66℃），大大降低了检测的费用，特别适合基层现场使用。目前，还未见针对鹅星状病毒LAMP方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测鹅星状病毒的环介导等温扩增反应的引物组及其试剂盒。应用该引物组可为基层现场检测提供一种简便、快捷的检测鹅星状病毒的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
所述检测鹅星状病毒的环介导等温扩增方法的引物组，是由一对外引物、一对内引物和一条环引物组成，其中所述的外引物由F3和B3、内引物由FIP和BIP和环引物LB组成。上述3类引物的序列如下：
F3：5’- ACTGGGGAGGTTTGTACAGTT-3’，
B3：5’- CCTTCCTTATTGACACAAGCCT-3’，
FIP：5’-TCTCAAAATGGGTGAGCCAGACATTCCAAGTGGCCAATATTCAACA-3’，
BIP：5’- ATTGGAAACAGCATGGGTCATTGCCATCGCCATAGCAAATCATGG-3’，
LB：5’- GACGCTCAGAGTACTCAGGGA-3’。
一种含所述引物组的检测试剂盒，所述试剂盒还包括：荧光目视检测试剂、2×反应缓冲液、所述的引物组、BstDNA聚合酶、超纯水。
所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
所述的2×反应缓冲液包括pH8.8 Tris-HCl为40 mM、KCl为20 mM、MgSO4为16 mM、（NH4）2SO4为20 mM、Tween20为0.2wt.%、Betaine为1.6 M、dNTPs mixture每种均为2.8 mM。
LAMP反应体系25μL：2×反应缓冲液 12.5μL，40 pmol FIP和BIP各1μL，20 pmolF3和B3 各1 μL，10 pmol LB 0.5μL，BstDNA聚合酶1μL，荧光目视检测试剂1μL，待检样品cDNA模板1μL，其余用超纯水（5μL）补足至25μL。
说明：环引物LB也可以不加入反应体系（不加入时，使用超纯水补足反应体系），但加入环引物LB可节约LAMP的反应时间。若不加入环引物LB，最适反应时间需重新优化。此外，环引物有时可设计出一组（2条引物），分别为LB和LF。此时加入环引物组（LB和LF）可节约LAMP的反应时间。若不加入环引物组（LB和LF），最适反应时间需重新优化。
本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应的引物组在制备鹅星状病毒快速诊断试剂中的用途。
本发明具有以下优点和效果：
1、污染小：本试剂盒的荧光目视试剂（FD）在反应前加入，污染小。其含有的钙黄绿素起初与锰离子结合而处于荧光粹灭状态。但是随着LAMP反应的进行，被反应副产物中的焦磷酸根离子夺去结合的锰离子，钙黄绿素恢复游离态从而发出荧光，并进而与反应液中的镁离子相结合，使荧光信号得到增强。
2、操作简便、快速：本发明建立的LAMP方法操作简便、无需复杂昂贵仪器。此外，建立的LAMP方法快速高效，从提取样品到结果判定可在60min内完成（时效性和TaqMan实时荧光定量PCR方法相当）。反应结果判定方法简单，在可见光下将阳性、阴性结果进行对比。肉眼可见阳性样品管反应液明显浑浊，阴性管样品管反应液颜色变化不大。经紫外线照射装置（波长240-260nm或350-370nm）照射可见，阳性样品发出翠绿色的荧光，阴性样品则没有。必要时，可进行常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性样品可见有不连续梯状电泳条带。
3、特异性强、灵敏度高：本发明建立的LAMP方法检测出鹅星状病毒，所检测的阴性对照样品（如鹅大肠杆菌病、鹅细小病毒病、鹅源禽坦布苏病毒病和鹅呼肠孤病毒病）和水对照样品均无阳性结果出来，和PCR检测结果一致。但是LAMP方法较常规PCR灵敏度高100倍左右，最低检测限为102 copy/μL。
附图说明
图1为鹅星状病毒LAMP特异性实验（直接观察），其中1：鹅星状病毒；针对性的病原对照4种，分别为：2：鹅大肠杆菌病；3：鹅细小病毒病；4：鹅源禽坦布苏病毒病；5：鹅呼肠孤病毒病。
图2 为鹅星状病毒LAMP方法敏感性试验（琼脂糖电泳）。其中1：DNA分子量标准5000；2：1.02 ×104 copy/μL；3：1.02×103 copy/μL；4：1.02×102 copy/μL；5：1.02×101copy/μL；6：1.02×100 copy/μL；7：阴性对照。
具体实施方式
下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
实施例1
一、实验方法
1 试验毒株和菌株
试验用病原鹅星状病毒、鹅源大肠杆菌、鹅细小病毒、鹅源禽坦布苏病毒和鹅呼肠孤病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
2 待检样品cDNA模板的制备
2.1 核酸提取
用北京全式金生物技术有限公司（也可用其他商品化公司等效试剂盒）的EasyPure Viral DNA/RNA Kit按照说明书方法进行操作提取鹅星状病毒（鹅星状病毒GsFJ2017株，GenBank登录号为MF576430）核酸RNA，并按照试剂盒的方法同时提取试验对照毒株和菌株的核酸（鹅源大肠杆菌、鹅细小病毒提取核酸DNA；鹅源禽坦布苏病毒和鹅呼肠孤病毒提取RNA；提取的DNA可直接用于LAMP检测，提取的RNA需反转录为cDNA才可用于LAMP检测）。
2.2 cDNA模板的制备
用北京全式金生物技术有限公司（也可用其他商品化公司等效试剂盒）的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix按照说明书方法，将提取的核酸RNA反转录为cDNA。cDNA反转录配置反应液体系为：提取的核酸RNA 2μL、随机引物（0.1μg/μL）1μL、2×ES Reaction Mix 10μL、反转录酶1μL、gDNA Remover 1μL，其余用RNase-Free水补足至20μL。cDNA反转录反应条件为：25℃ 10min、42℃ 30min、85℃ 10s。
3 LAMP检测方法的建立
3.1 LAMP的引物设计
根据GenBank中登录的鹅星状病毒（GsFJ2017株，GenBank登录号为MF576430）聚合酶1b蛋白编码的基因序列特点，利用分子生物学软件进行分析比较，利用LAMP引物设计的在线网站(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计引物，包括外引物1对（F3和B3）、内引物1对（FIP和BIP）和环引物一条（LB），具体序列见SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。将设计好的相关引物，经NCBI数据库进行BLAST分析，符合试验预期。
利用设计的外引物（F3和B3）对鹅星状病毒、鹅源大肠杆菌、鹅细小病毒、鹅源禽坦布苏病毒和鹅呼肠孤病毒进行常规PCR扩增（鹅星状病毒、鹅源禽坦布苏病毒和鹅呼肠孤病毒使用反转录后的cDNA；鹅源大肠杆菌和鹅细小病毒试验DNA模板），按照2×TransTaq-TPCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（F3和B3，10μM）各1μL、提取的核酸模板1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为：94 ℃ 预变性4min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃35 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。结果仅F3和B3对鹅星状病毒扩增出现特异性目的条带；对其他病原（如鹅源大肠杆菌、鹅细小病毒、鹅源禽坦布苏病毒和鹅呼肠孤病毒）均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的相关引物无交叉干扰，特异性强。
3.2 LAMP方法的建立和优化
按照环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒（SLP204 Laoopamp DNA 扩增反应试剂盒）配置LAMP试验反应液，反应体系为25μL。每25μL反应体系中含有：2×反应缓冲液 12.5μL，40 pmol FIP和BIP 各 1μL，20 pmol F3和B3 各1 μL，10 pmol LB 0.5μL，BstDNA聚合酶1μL，荧光目视检测试剂1μL，待检样品cDNA模板1μL，其余用超纯水（5μL）补足至25μL。实验不同温度（60℃、62℃、64℃、66℃）、不同时间（10min、20min、30min、40min、50min、60min）检测引物组反应性能。优化后的反应条件为64℃反应30min。
3.3 LAMP检测方法的特异性试验
用优化后的LAMP条件，检测相关实验样品模板核酸（鹅星状病毒、鹅源禽坦布苏病毒和鹅呼肠孤病毒使用反转录后的cDNA；鹅源大肠杆菌和鹅细小病毒试验DNA模板），评价建立的LAMP方法的特异性。
3.4 LAMP检测方法的敏感性试验
3.4.1 阳性标准品的构建
根据本团队前期鉴定的鹅星状病毒（鹅星状病毒GsFJ2017株）聚合酶1b蛋白编码的基因序列特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：GoAst-F：5′- GACACCACAGCTTAAGAA -3′和GoAst-R：5′- TATTTTTATACATATCTA -3′，用于扩增约329 bp的聚合酶1b蛋白基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。
用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鹅星状病毒（GsFJ2017株）核酸RNA，按照PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)推荐的50μL体系进行RT-PCR反应，其中PrimeScript 1 Step Enzyme Mix反应液2μL、2×1 Step Buffer（Dye Plus）反应液25μL、上下游引物（GoAst-F和GoAst-R，10μM）各2μL、提取的核酸RNA 2 μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：50℃ 反转录30 min后进行PCR扩增程序；94℃ 预变性4 min；94℃ 50 s，56℃ 30 s，72℃ 35 s，35个循环；循环结束后72℃延伸 10min。
用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将RT-PCR扩增的特异性聚合酶1b蛋白基因片段克隆到pEASY-T1克隆载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养过夜后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用RT-PCR扩增时的引物（GoAst-F和GoAst-R）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- GoAst），分装后置于-20 ℃保存备用。
对鹅星状病毒构建的阳性标准品（T- GoAst）进行连续稀释（质粒浓度分别为1.02×104，1.02×103，1.02×102，1.02×101和1.02×100拷贝/μL），按照优化后的LAMP条件进行检测，获得其敏感性试验数据。
4 建立的LAMP检测方法的临床应用
对本研究室收集的74份鹅组织病料经研磨处理后，按照商品化试剂盒提取相应RNA后，用北京全式金生物技术有限公司的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix按照说明书方法，将提取的核酸RNA反转录为cDNA，按照优化后的LAMP条件进行检测。
LAMP反应体系25μL：2×反应缓冲液 12.5μL，40 pmol FIP和BIP 各 1μL，20 pmolF3和B3 各1μL，10 pmol LB 0.5μL，BstDNA聚合酶1μL，荧光目视检测试剂1μL，待检样品cDNA模板1μL，其余用超纯水（5μL）补足至25μL。
二、实验结果
2.1 结果判定
经紫外线照射装置（350-370nm）照射可见，阳性样品（鹅星状病毒GsFJ2017株）发出翠绿色的荧光，阴性样品（鹅源大肠杆菌、鹅细小病毒、鹅源禽坦布苏病毒和鹅呼肠孤病毒）均未见可见荧光（见图1）。
2.2 敏感性试验判定
反应结束后，经紫外线照射装置（350-370nm）照射可见，鹅星状病毒的浓度在1.02×102 copy/μL（即102 copy/μL）（见图2）时为最低检测限。将结果进行常规琼脂糖凝胶电泳可见，在1.02×104 copy/μL、1.02×103 copy/μL、1.02×102 copy/μL（即102 copy/μL）均可见有不连续梯状电泳条带；在1.02×101 copy/μL、1.02×100 copy/μL和阴性对照均未见有不连续梯状电泳条带。可见，本发明的LAMP的最低检测限为102 copy/μL。
2.3 临床样品的检测
对本研究室收集的74份鹅组织病料经研磨处理后，按照商品化试剂盒提取相应RNA后，用北京全式金生物技术有限公司的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix按照说明书方法，将提取的核酸RNA反转录为cDNA，按照优化后的LAMP条件进行检测。结果可见，2份鹅星状病毒感染阳性，阳性率为2.70%（2/74）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 鹅星状病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
<130> 7
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actggggagg tttgtacagt t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccttccttat tgacacaagc ct 22
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tctcaaaatg ggtgagccag acattccaag tggccaatat tcaaca 46
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attggaaaca gcatgggtca ttgccatcgc catagcaaat catgg 45
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacgctcaga gtactcaggg a 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gacaccacag cttaagaa 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tatttttata catatcta 18
Claims (3)
1.一种鹅星状病毒环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的引物由1对外引物F3和B3、1对内引物FIP和BIP和1条环引物LB组成，上述引物序列如下：
F3：5’- ACTGGGGAGGTTTGTACAGTT-3’，
B3：5’- CCTTCCTTATTGACACAAGCCT-3’，
FIP：5’-TCTCAAAATGGGTGAGCCAGACATTCCAAGTGGCCAATATTCAACA-3’，
BIP：5’- ATTGGAAACAGCATGGGTCATTGCCATCGCCATAGCAAATCATGG-3’，
LB：5’- GACGCTCAGAGTACTCAGGGA-3’。
2.一种含权利要求1所述引物组的鹅星状病毒检测试剂盒。
3.如权利要求2所述的鹅星状病毒检测试剂盒的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP反应体系25μL：2×反应缓冲液 12.5μL，40 pmol FIP和BIP 各1μL，20 pmol F3和B3各1μL，10pmol LB 0.5 μL，BstDNA聚合酶1μL，待检样品cDNA模板1μL，荧光目视检测试剂1μL，其余用超纯水补足至25μL。
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