CN109457055A - 检测鹅源星状病毒的引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测鹅源星状病毒的引物组和试剂盒,属于病毒检测技术领域,所述引物组包括内引物、外引物和环引物,所述内引物包括FIP和BIP;所述FIP的序列如SEQ ID No:1所示;所述BIP的序列如SEQ ID No:2所示;所述外引物包括F3和B3;所述F3的序列如SEQ ID No:3所示,所述B3的序列如SEQ ID No:4所示;所述环引物包括LB和LF;所述LB的序列如SEQ ID No:5所示;所述LF的序列如SEQ ID No:6所示;所述引物组和试剂盒适用于LAMP检测,所述引物组和试剂盒检测灵敏度高,特异性好,检测成本低,检测结果可直接可视判定,方便推广应用。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域,尤其涉及检测鹅源星状病毒的引物组和试剂盒。
背景技术
星状病毒(Astrovirus)是一种属于星状病毒科的单股正链RNA病毒,基因组长度在6.4~7.9kb不等。星状病毒科根据感染宿主的不同可分为哺乳动物属和禽类属,其中哺乳动物属根据宿主的不同又分为人星状病毒、猫星状病毒、猪星状病毒、绵羊星状病毒以及貂星状病毒等;禽类星状病毒属包括鸭星状病毒(DAstV)、火鸡星状病毒(TAstV)、禽肾炎病毒(ANV)和鸡星状病毒(CAstV等)。
2017年下半年以来,我国部分地区陆续从鹅病料中分离到新型的鹅源星状病毒。遗传进化分析发现,该新发病毒与之前报道的所有禽类星状病毒的基因型差异较大,与其他禽类的星状病毒同源性仅在30%-50.5%之间,无论是全基因组还是单个的ORF遗传进化分析都属于新的遗传分支,为新型的鹅源肾型星状病毒GoAstV。临床上该病可引起病鹅的关节肿大,生产性能下降,死淘率可达30%以上;剖解可见肾脏、心包等有明显的白色尿酸盐析出。关于该病毒的诊断,传统的病毒分离鉴定,费时费力,不适合临床使用,而且该病毒无血凝性,在鸡胚、鸭胚上不生长,在鹅胚上的繁殖能力也不高。目前最常见的检测方法是应用普通RT-PCR,但该方法易造成标本间的交叉污染,而且需要进行凝胶电泳进行判断,亦不适合临床大批样品进行检测。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种检测鹅源星状病毒的引物组和试剂盒;利用所述引物组进行LAMP反应能够快速准确的检测鹅源星状病毒。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
检测鹅源星状病毒的引物组,所述引物组包括内引物,外引物和环引物,所述内引物包括FIP和BIP;所述FIP的序列如SEQ ID No:1所示;所述BIP的序列如SEQ ID No:2所示;所述外引物包括F3和B3;所述F3的序列如SEQ ID No:3所示,所述B3的序列如SEQ ID No:4所示;所述环引物包括LB和LF;所述LB的序列如SEQ ID No:5所示;所述LF的序列如SEQ IDNo:6所示;所述引物组适用于LAMP检测。
本发明还提供了检测鹅源星状病毒的试剂盒,包括LAMP反应buffer,酶混合物和双蒸水,还包括所述的引物组。
优选的,所述内引物FIP和BIP的使用浓度独立为1.4μmol/L-1.8μmol/L。
优选的,所述外引物F3和B3的使用浓度独立为0.1μmol/L-0.5μmol/L。
优选的,所述环引物LB和LF的使用浓度独立为0.6μmol/L-1.0μmol/L。
优选的,所述酶为链置换型的Bst DNA聚合酶,所述酶的酶活力为6~10U/μL
优选的,所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。
优选的,所述阴性对照品为双蒸水,所述阳性对照品为鹅源星状病毒毒株的cDNA。
本发明的有益效果:本发明提供的检测鹅源星状病毒的引物组,针对鹅源星状病毒ORF2基因设计,适用于LAMP检测,所述引物组的扩增效率好、扩增速度快,能够特异地扩增靶基因。利用所述引物组对鹅源星状病毒检测,灵敏度高(最低检测可达0.5ng/μL),特异性好(其他对照病毒均未扩增),不需要昂贵的仪器设备,检测结果可直接可视判定,方便推广应用。
附图说明
图1为实施例1中对不同样品的LAMP结果可视化观察;
图2为实施例2中不同温度下LAMP反应结果图;
图3为实施例3中LAMP反应灵敏度检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了检测鹅源星状病毒的引物组,所述引物组包括内引物、外引物和环引物,所述内引物包括FIP和BIP;所述FIP的序列如SEQ ID No:1所示;所述BIP的序列如SEQID No:2所示;所述外引物包括F3和B3;所述F3的序列如SEQ ID No:3所示,所述B3的序列如SEQ ID No:4所示;所述环引物包括LB和LF;所述LB的序列如SEQ ID No:5所示;所述LF的序列如SEQ ID No:6所示。
在本发明中,所述引物组适用于LAMP法检测鹅源星状病毒,所述引物组优选的根据GenBank发布的新型鹅源星状病毒毒株序列(GenBank登录号:MH052598)的ORF2基因设计引物,ORF2基因编码病毒的衣壳蛋白,为病毒的结构蛋白。在具体设计过程中,优选的将所述待扩增的序列分为六个独立的区域,分别设计相应的引物。
本发明还提供了检测鹅源星状病毒的试剂盒,包括LAMP反应buffer,酶和双蒸水,还包括所述的引物组。在本发明中,所述内引物FIP和BIP的使用浓度独立优选为1.4~1.8μmol/L,更优选为1.5~1.7μmol/L,更优选为1.6μmol/L;所述外引物F3和B3的使用浓度独立优选为0.1~0.5μmol/L,更优选为0.4μmol/L;所述环引物LB和LF的使用浓度独立优选为0.6~1.0μmol/L,更优选为0.7~0.9μmol/L,最优选为0.8μmol/L。本发明中所述内引物FIP和BIP的使用浓度优选的一致,所述外引物F3和B3的使用浓度优选的一致,所述环引物LB和LF的使用浓度优选的一致。
在本发明中,所述LAMP反应buffer优选为2×buffer;本发明中所述酶和LAMP反应buffer优选的来源于LAMP核糖核酸扩增试剂盒,日本荣研化学株式会社。本发明中所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。所述阴性对照品优选的为双蒸水,所述阳性对照品优选为鹅源星状病毒毒株的cDNA。
本发明中所述试剂盒适用于LAMP法检测鹅源星状病毒,所述LAMP法检测鹅源星状病毒的体系优选为25μl;所述LAMP反应体系优选的包括如下组分:
2×buffer 12.5μL,
酶(Bst DNA聚合酶)1μL,
FIP和BIP,1.6μmol/L各0.2μL
F3和B3,0.4μmol/L各0.2μL
LB和LF,0.8μmol/L各0.2μL
补充ddH2O至25μL。
本发明中,所述LAMP法检测鹅源星状病毒的程序优选的如下:60℃~67℃反应55~65min;更优选的为63~65℃反应58~62min,最优选的为64℃反应60min。
本发明中所述LAMP反应结果检测方法优选的通过浊度测定仪进行,优选的在所述LAMP反应过程中,每5~7s测定反应液的浊度并绘制曲线,来判断结果的阴阳性。本发明中所述浊度测定仪优选的为实时浊度仪型号为LA-320c。本发明采用浊度仪测定LAMP检测结果的原理如下:
LAMP在反应过程中发生以下反应式:
(DNA)n-1+dNTP—→(DNA)n+P2O7 4-;
P2O7 4-+2Mg2+—→Mg2P2O7↓
其中Mg2P2O7即焦磷酸镁,为白色沉淀。
本发明采用浊度仪检测LAMP检测结果,无需开盖,避免污染,通过浊度变化曲线来判断反应产物的阴阳性,避免了检测结果的误判。
本发明中所述LAMP反应检测过程中,优选的还包括在所述反应液中添加Te核酸染料,采用Te核酸染料进行结果的判定,通过颜色的变化直观进行检测,Te是一种pH指示剂,根据反应液pH的变化而呈现出不同的颜色,阴性时为无色,阳性时为亮绿色。
本发明所述方法非常适合在基层检测部门中广泛推广使用,对2017年以来新发的鹅源星状病毒进行快速、特异的测定,与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、成本低、快速简便等优点。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
检测鹅源星状病毒的试剂盒,包括引物组,2×buffer,酶混合物(EM),双蒸水,阳性对照品鹅源星状病毒毒株的cDNA。其中2×buffer,链置换型的Bst DNA聚合酶来源于LAMP核糖核酸扩增试剂盒,日本荣研化学株式会社。
所述试剂盒包括如表1所示引物。
表1引物组序列
实验材料:
LAMP核糖核酸扩增试剂盒(DNAAmplification Kit)来自日本荣研化学株式会社;可视染料(Te colorimetric indicator,Te)来自天津捷易特生物科技有限公司;实时浊度仪La-320C来自日本荣研化学株式会社;分光光度计ND-1000来自NanoDrop公司。
方法:
病毒RNA的提取:
GoAstV毒株XZ来自于徐州某种鹅场,临床表现为雏鹅集体采食量下降,拉绿色稀便,大部分有跛行或瘫痪症状。死淘量随发病每天增加,剖检肾脏、心包和关节有尿酸盐沉积。采集病变明显的肝脏、肾脏等组织。
病毒RNA的提取按照宝生物Viral RNAkit操作进行,提取RNA立即使用或超低温-86℃保存。
RT反转录过程:
反转录体系:5×RT Buffer 4μL、AMV Enzyme Mix 2μL、Random Primer(50μM)0.5μL、RNA模板100pg~1μg(7μL)、RNase Free H2O补至20μL。反应条件为:42℃ 30min、4℃结束。所得cDNA在-20℃保存。
LAMP反应:
LAMP反应体系如下:2×buffer 12.5μL,Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)8U/μL 1μL,FIP和BIP(1.6μmol/L)各0.2μL、F3和B3(0.4μmol/L)各0.2μL、LB和LF(0.8μmol/L)各0.2μL、模板cDNA2μL补充ddH2O至25μL。将混合物置于60℃-67℃恒温反应60min。以双蒸水为阴性对照。
LAMP反应结果检测:
实时浊度仪检测:LAMP在反应过程中发生以下反应式:
(DNA)n-1+dNTP—→(DNA)n+P2O7 4-
P2O7 4-+2Mg2+—→Mg2P2O7↓
其中Mg2P2O7即焦磷酸镁,为白色沉淀。依据这个原理,采用实时浊度仪LA-320c,每隔6秒测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性。
基于Te颜色改变检测:Te是一种pH指示剂,根据反应液pH的变化而呈现出不同的颜色,阴性时为无色,阳性时为亮绿色。
检测样品
1号为阳性对照品XZ-GoAStV18;2到12号分别为阴性样本:2号为ddH2O;3-12分别为新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9AIV)、水禽源副黏病毒4型(APMV-4)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭源星状病毒(DkAstV)、禽白血病病毒(ALV)、鸡贫血病毒(CAV)、坦布苏病毒(Tembusu)、腺病毒4型(FAdV-4)、鹅星状病毒毒株2010分离毒株(GoAstV10)。
可视化检测结果如图1所示,阳性对照品LAMP检测为有色即阳性,其余样品为无色,即阴性。可见所述试剂盒能够应用于鹅源星状病毒检测。
实施例2
实施例1中所述试剂盒使用时最佳的LAMP检测温度筛选
温度从60-67℃,梯度为1℃,进行筛选;XZ-GoAStV18反应时间为60min。
结果如图2所示,从图2可以看出64℃、65℃、66℃时先发生了LAMP反应,由于64℃最先发生了LAMP反应,所以将最佳温度选为64℃。
实施例3
实施例1中试剂盒的灵敏性检测
将10倍梯度稀释的XZ-GoAStV18阳性对照品cDNA模板(原始模板浓度为550ng/μL)用于LAMP反应,检测温度64℃,检测结果见图3。LAMP能检测到样本的第3个稀释度,整个反应时间小于60min。图3中包括浊度检测结果和运用Te染料判定结果;图3中从左到右,模板浓度依次为:1,10倍稀释;2,100倍稀释;3,1000倍稀释;4,10000倍稀释;5,100000倍稀释;6,1000000倍稀释;7,10000000倍稀释,8,双蒸水(阴性对照)。可见所述方法最低检测可达0.5ng/μL。
实施例4
临床应用
通过对40枚鹅胚(11日龄,来自山东章丘鹅养殖场)接种病毒后的尿囊液进行上述LAMP方法检测。尿囊液病毒RNA的提取按照宝生物Viral RNAkit操作进行,提取RNA立即使用或超低温-86℃保存。
RT反转录cDNA过程:5×RT Buffer 4μL、AMV Enzyme Mix 2μL、RandomPrimer(50μM)0.5μL、RNA模板1μg、RNase Free H2O补至20μL。反应条件为:42℃ 30min、4℃结束。
LAMP反应体系如下:2×buffer 12.5μL,Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)浓度8U/μL 1μL,FIP和BIP(1.6μmol/L)各0.2μL、F3和B3(0.4μmol/L)各0.2μL、LB和LF(0.8μmol/L)各0.2μL、模板cDNA2μL补充ddH2O至25μL。将混合物置于64℃恒温反应60min。以双蒸水为阴性对照。用该方法可快速鉴定出36份阳性样品(36/40)。这一结果与FQ-PCR(实时荧光PCR)试验的测定结果完全一致,FQ-PCR也检出36份阳性样品(36/40)。FQ-PCR的引物和探针如下:GoAstV-F:5'tggtggtggtgcggtttt 3'(SEQ ID:7);GoAstV-R:5'gggcaacgtaccatcataacg 3'(SEQ ID:8);Probe:5'FAM tgtagagacggactggac MGB 3'(SEQID:9);反应体系:2×Premix Ex(for qPCR)10μL、Forward Primer(10μM)0.2μL、ReversePrimer(10μM)0.2μL、Probe(10μM)0.5μL、cDNA2μL补dd H2O至20μL;反应过程:95℃ 2min,94℃ 5s、60℃ 30s进行40cycles,60℃收集荧光信号。阳性样品的FQ-PCR反应体系通道出现特定的扩增曲线。可见本发明所述方法和实时荧光PCR方法检测结果完全一致,阳性检测率为90%(36/40)。
因此证明该方法特异好、敏感度高,而且不需要昂贵的荧光定量PCR仪、检测结果直接可视判定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东省农业科学院家禽研究所
<120> 检测鹅源星状病毒的引物组和试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgccgttttc cctgatgctg aatcgaacta tggtccaaag cc 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atacccagga tggtgcactt gctgtgttgc tccttctcat cg 42
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgaagcaa cggtcactt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggtctgcgc atttgaaac 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcactggtca tgagtgaga 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcattgcag agattcct 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggtggtggt gcggtttt 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggcaacgta ccatcataac g 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtagagacg gactggac 18
Claims (8)
1.检测鹅源星状病毒的引物组,其特征在于,所述引物组包括内引物、外引物和环引物,所述内引物包括FIP和BIP;所述FIP的序列如SEQ ID No:1所示;所述BIP的序列如SEQID No:2所示;所述外引物包括F3和B3;所述F3的序列如SEQ ID No:3所示,所述B3的序列如SEQ ID No:4所示;所述环引物包括LB和LF;所述LB的序列如SEQ ID No:5所示;所述LF的序列如SEQ ID No:6所示;所述引物组适用于LAMP检测。
2.检测鹅源星状病毒的试剂盒,包括LAMP反应buffer,酶和双蒸水,其特征在于,还包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述内引物FIP和BIP的使用浓度独立地为1.4μmol/L-1.8μmol/L。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述外引物F3和B3的使用浓度独立地为0.1μmol/L-0.5μmol/L。
5.根据权利要求2~4任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述环引物LB和LF的使用浓度独立地为0.6μmol/L-1.0μmol/L。
6.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述酶为链置换型的Bst DNA聚合酶,所述酶的酶活力为6~10U/μL。
7.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述阴性对照品为双蒸水,所述阳性对照品为鹅源星状病毒毒株的cDNA。
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