CN109897918B

CN109897918B - 鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法

Info

Publication number: CN109897918B
Application number: CN201910275066.4A
Authority: CN
Inventors: 张文; 徐立蒲; 吕晓楠
Original assignee: BEIJING AQUACULTURE NUTRITION RESEARCH CENTRE
Current assignee: BEIJING AQUACULTURE NUTRITION RESEARCH CENTRE
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2039-04-08
Also published as: CN109897918A

Abstract

本发明公开了一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，该方法包括以下步骤：第一、合成引物与TaqMan探针：根据CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R；根据KHV ORF7基因保守序列，设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团；第二、确定反应体系及条件：采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。

Description

鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，属于鱼类病毒检测技术领域。

背景技术

鲤和锦鲤是我国具有重要市场价值的品种，随着养殖规模的不断扩大，鱼类疫病也频繁出现。其中，鲤浮肿病毒(Carp edema virus，CEV)和锦鲤疱疹病毒(Kioherpesvirus，KHV)都可以感染鲤和锦鲤，对水产养殖产业造成严重危害。CEV是一种线性双链DNA，属于痘病毒，大小约为200nm×400nm。KHV也为双链DNA，属疱疹病毒，是直径167～200nm的二十面体，有囊膜。以上两种病毒均只感染鲤和锦鲤，且引起的临床症状极其相似，包括烂鳃、眼球凹陷、食欲不振、体表出血等，死亡率高达80％～100％。因此，在养殖生产中，当鲤或锦鲤出现凹眼、烂鳃等症状，并有高死亡率时，现场依靠发病症状和流行特点很难区分这两种病毒病，需进一步进行实验室检测。

分子生物学方法是实验室最常用的检测CEV和KHV的方法。现有技术中通常采用由英国CEFAS建立、Matras等公布的单重荧光定量PCR法检测CEV，采用SC/T 7212.1-2011行业标准检测KHV，由于CEVD和KHVD临床症状极其相似，往往需要针对同一样品分别检测CEV和KHV这两种病原，耗时较长。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强和重复性好等优点,已逐渐成为动物病原检测的重要方法。目前，尚未见应用双重实时荧光定量PCR技术同时检测CEV和KHV的相关报道。

CEV和KHV已经成为危害国内外鲤和锦鲤养殖产业的重要病原。鲤和锦鲤养殖具有重要的经济价值和市场价值，目前，对CEVD和KHVD并没有有效的治疗措施，尽快确诊病原，尽早切断传播途径对降低经济损失有重要作用。

目前，诊断CEV主要依靠分子生物学检测方法，还没有筛选到能够稳定易感CEV的敏感细胞系。Oyamatsu等和英国CEFAS建立的套式PCR都存在漏检现象。英国CEFAS建立的实时荧光定量PCR是目前最适用于检测CEV的方法，更适用于CEV的常规监测。针对KHV的敏感细胞系已有大量报道，例如锦鲤鳍细胞(Koi fin cells，KFC)、鲤鱼脑细胞(Common carpbrain cells，CCB)、锦鲤鳃细胞系(The gill of koi，KoG)等，但通常需要传代3～5次，分离培养时间较长，且首次分离成功的很少，故普通PCR检测方法依然是诊断KHV首选，但相对于实时荧光定量PCR法来说，耗时较长，检测操作步骤较多。单重实时荧光定量PCR方法对CEV和KHV的检测已得到较广泛的应用。

发明内容

本发明为了解决上述问题，提供一种新型的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，该方法能够同时检测CEV和KHV，提高了检测效率，在样品量非常大时具有很大优势。

本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：

第一、合成引物与TaqMan探针：

根据CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R；根据KHV ORF7基因保守序列，设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团；

第二、确定反应体系及条件：

采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。

优选地，反应体系确定为：2×Probe PCR Master Mix 10μL，CEV上、下游引物终浓度0.6μmol/L，探针终浓度0.3μmol/L，KHV上、下游引物终浓度0.4μmol/L，探针终浓度0.2μmol/L，QN ROX参考染料0.1μL；模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，56℃退火31s，40个循环。

在一个实施例中，根据CEV P4a基因序列对引物序列进行优化后的CEV-R序列为RATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA。

在一个实施例中，根据CEV P4a基因序列对引物序列进行优化后的CEV-F序列为WGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC。

在一个实施例中，探针CEV-Probe序列为FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1。

在一个实施例中，根据KHV ORF7基因保守序列设计的引物KHV-R序列为CACGGATCTTCTATGCTACA。

在一个实施例中，根据KHV ORF7基因保守序列设计的引物KHV-F序列为TTGTTGTGCGTTGATGTTC。

在一个实施例中，根据KHV ORF7基因保守序列设计的探针KHV-Probe序列VIC-CTTGACGGCACTCGTCGAGCCGTAGCCC-BHQ1。

本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法对CEV和KHV的灵敏度为15copies/μL。

本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3％。

与现有技术相比，本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法的有益效果在于：灵敏度高、特异性好，与其他病毒无交叉反应；临床试验结果表明，该方法的结果与实验室常规检测结果一致，针对混合感染样品可特异的检出感染病原，适用于实验室对CEV和KHV的常规检测，可为CEVD和KHVD两种常见鱼类疫病的快速诊断提供必要的技术支撑。

附图说明

图1a是CEV的敏感性曲线。

图1b是CEV的标准曲线。

图2a是KHV的敏感性曲线。

图2b是KHV的标准曲线。

图3是特异性试验曲线。

图4是Real-time PCR组内重复性试验获得的目标扩增曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

第一、合成引物与TaqMan探针：根据Matras等公布的CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R；根据GenBank中KHV ORF7基因保守序列，应用Primer 6.0软件设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团(见表1)。引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成。

表一引物和TaqMan探针序列

第二、确定反应体系及条件：

为了确定最佳引物浓度配比和反应程序，本申请采用多种毒株，进行了大量的特异性试验、重复性试验、干扰性试验，并采用本申请建立的双重实时荧光定量PCR方法，检测本实验室鉴定保存的13份CEV阳性样品、7份KHV阳性样品，评价该方法的可靠性。

本申请采用的毒株包括鲤浮肿病毒(Carp edema virus，CEV)、锦鲤疱疹病毒(Kioherpesvirus，KHV)、金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)、流行性造血器官坏死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis，EHNV)、蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus，BIV)、斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus，CCV)，由北京市水产技术推广站鉴定保存，白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)标准品购自中国水产科学研究院黄海水产研究所。

本申请采用的DNA抽提试剂盒、荧光QuantiNovaTM Probe PCR Kit试剂盒均购自QIAGEN公司；DNA扩增试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；AB 7500荧光定量PCR仪购自Life Technologies公司。

制备标准品：

参照DNA抽提试剂盒说明书，提取鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的DNA，送至北京天成新脉生物技术有限公司，合成CEV P4a基因序列(528bp)和KHV ORF7基因序列(484bp)，分别克隆到pEASY-T1载体和PUC57-Kan载体上，构建CEV-P4a和KHV-ORF7标准质粒，根据质粒浓度计算拷贝数。

双重实时荧光定量PCR反应条件及引物浓度优化：

浓度为1.5×10⁷copies/μL的质粒CEV-P4a和KHV-ORF7混合液作为标准品，采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，应用矩阵法对引物浓度进行最佳配比和筛选，将上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间调整，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL。反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。根据荧光PCR结果曲线和Ct值确定最佳引物浓度配比和反应程序。

敏感性试验与标准曲线的建立：

对质粒CEV-P4a和KHV-ORF7进行10倍系列稀释，将相同稀释倍数的质粒充分混合作为模板，按照已优化好的双重实时荧光定量PCR反应条件进行扩增，建立标准曲线。

特异性试验：

分别以3.0×10⁵copies/μL的质粒CEV-P4a或KHV-ORF7作为模板，同时加入CEV和KHV的引物和探针，按照优化好的反应条件进行二重单检的实时荧光PCR扩增，每个样品孔同时收集FAM和VIC两种荧光信号，确定该方法的引物与探针在CEV和KHV之间的特异性。采用本申请建立的方法，对GFHNV、EHNV、CCV等DNA病毒进行特异性验证。

重复性试验：

将浓度为3.0×10⁵copies/μL的CEV-P4a和KHV-ORF7质粒等体积混合，获得1.5×10⁵copies/μL的质粒混合液作为模板，分为5个标本同时检测。在第4天、第7天重复检测保存于-20℃的模板，通过计算Ct值的标准差(S)和变异系数(CV)验证本申请的方法的批内重复性和批间重复性。

干扰性试验：

将质粒CEV-P4a和KHV-ORF7按不同浓度进行组合(3.0×10⁷和3.0×10¹；3.0×10¹和3.0×10⁷)，分别进行单重和双重荧光定量PCR检测，确定当模板浓度相差较大时CEV和KHV之间的检测是否存在干扰现象。

临床样品检测应用：

采用本申请建立的双重实时荧光定量PCR方法，检测本实验室鉴定保存的13份CEV阳性样品、7份KHV阳性样品，评价该方法的可靠性。

反应体系及条件的优化：

通过对引物及探针浓度的筛选及退火温度的优化，最佳反应体系确定为：2×Probe PCR Master Mix 10μL，CEV上、下游引物终浓度0.6μmol/L，探针终浓度0.3μmol/L，KHV上、下游引物终浓度0.4μmol/L，探针终浓度0.2μmol/L，QN ROX参考染料0.1μL.模板2.5μL，DEPC水补足20μL。反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，56℃退火31s，40个循环。

敏感性试验结果及标准曲线的建立：

以10倍系列稀释的CEV-P4a或KHV-ORF7质粒混合液(1.5×10⁷～1.5×10¹copies/μL)作为模板，进行双重实时荧光定量PCR扩增，结果见图1a、图1b、图2a和图2b。图1a和图2a中附图标记1-7表示1.5×10⁷拷贝/μL～1.5×10¹拷贝/μL，附图标记8表示空白对照。

图1至图4中，阈值：荧光扩增曲线上仪器自动设定或人为设定的一个值，一般是PCR扩增的3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，在PCR扩增的指数期。

Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

Rn:是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值；

△Rn：是Rn扣除基线后得到的相对荧光值(△Rn＝Rn-基线)；

基线：在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线就是基线。

本申请的方法最低能检测到的CEV浓度为1.5×10¹copies/μL，以质粒拷贝数的lg值为横坐标，Ct为纵坐标建立标准曲线，回归方程为：y＝-3.4551x+38.76；该方法最低能检测到的KHV浓度为1.5×10¹copies/μL，以质粒拷贝数的lg值为横坐标，Ct为纵坐标建立标准曲线，回归方程为：y＝-3.5287x+39.099。结果表明本申请建立的方法对CEV和KHV的灵敏度为15copies/μL。

特异性实验结果：

当反应体系中只加入CEV或KHV基因组DNA作为模板，采用本申请建立的方法进行PCR扩增时，结果只得到相应模板的特异性荧光曲线，表明引物及探针在这两种病毒间具有特异性。对GFHNV、EHNV、CCV等阳性核酸的扩增结果显示，这几种DNA病毒、阴性对照以及空白对照均不能产生扩增曲线，呈现阴性结果，见图3，表明本申请建立的双重实时荧光定量PCR法具有良好的特异性。图3中，1为鲤浮肿病毒；2为锦鲤疱疹病毒；3为金鱼造血器官坏死病毒；4为流行性造血器官坏死病毒；5为蛙虹彩病毒；6为斑点叉尾鮰病毒；7为白斑综合征病毒；8为虾肝肠胞虫；9为空白对照。

重复性试验结果：

以1.5×10⁵copies/μL的质粒混合液作为模板，进行批内重复性试验，结果5个平行样品均获得目标扩增曲线，见图4。图4中1～5为1.5×10⁵拷贝/μL CEV；6～10为1.5×10⁵拷贝/μL KHV；11为空白对照。CEV的SD为0.10，CV为0.49﹪；KHV的SD为0.13，CV为0.66﹪，见表2。第4、7天后进行批间重复性试验，CEV的SD为0.10，CV为0.52％；KHV的SD为0.13，CV为0.67％，见表3。结果表明，本申请建立的双重实时荧光定量PCR法具有良好的重复性。

表2组内重复性试验

表3组间重复性试验

干扰性试验结果：

将质粒CEV-P4a和KHV-ORF7按不同浓度进行组合进行荧光定量PCR检测，发现当两种模板浓度相差很大时，本申请的方法依然能够检出低浓度模板，且与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3％，见表4。

表4干扰性试验结果

临床样品应用检测结果：

采用本申请建立的CEV和KHV双重实时荧光定量PCR法，对经单重PCR检测阳性的13份CEV样品和采用SC/T 7212.1-2011行业标准检测阳性的7份KHV样品进行扩增，结果13份CEV阳性样品在FAM荧光通道均有特异的荧光曲线和Ct值，在VIC荧光通道无扩增曲线和Ct值，且病毒浓度为1.05×10²—7.09×10⁴copies/μL。7份KHV阳性样品在VIC荧光通道均有特异性的荧光曲线和Ct值，病毒浓度为3.91×10²—3.02×10⁵copies/μL，在FAM荧光通道6份样品无扩增曲线和Ct值；1份样品有特异的荧光曲线和Ct值，且病毒浓度为5.6×10⁴copies/μL。

本申请根据Matras等公布的CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，合成1对特异性引物和1条TaqMan探针；根据KHV ORF7基因保守序列，设计筛选1对特异性引物和1条TaqMan探针。引物序列间无相互干扰，通过矩阵法筛选出了CEV和KHV的最佳引物和探针浓度组合，优化反应条件，成功建立双重实时荧光定量PCR方法，大大缩短了检测时间，全程约需1.5h，与用单重荧光定量PCR分别检测两种病毒相比，减少1.5h，与普通PCR相比则减少约4h；本申请的方法具有较高的敏感性，可检测到15copies/μL的CEV或KHV；具有良好的特异性，不与其它病毒发生交叉反应；由于扩增产物不需电泳，则有效避免普通PCR方法可能产生的气溶胶污染风险。

临床样品检测结果表明，有1份KHV阳性样品也为CEV阳性。经查，该样品为2015年由本实验室采集，由于实验室是2016年后开始开展大量CEV相关研究，并未对2016年之前的样品进行CEV复检，因此针对该样品只进行了KHV鉴定。采用单重实时荧光定量PCR对该样品进行扩增，有明显扩增曲线和Ct值，为CEV阳性，表明本申请建立的双重实时荧光定量PCR方法检测结果与实验室常规方法结果一致。通过对临床样品的检测证明CEV和KHV在临床上确实有混合感染的情况发生。在同一样品中两种病原的含量可能相差较大，本申请通过干扰性试验，探讨当模板浓度相差较大时，高浓度模板对低浓度模板是否存在干扰现象。结果表明，当两种模板浓度相差很大时，本申请的方法依然能够检出低浓度模板，且与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3％。

综上，本申请建立的双重实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性好，与其他病毒无交叉反应；临床试验结果表明，该方法的结果与实验室常规检测结果一致，针对混合感染样品可特异的检出感染病原，适用于实验室对CEV和KHV的常规检测，可为CEVD和KHVD两种常见鱼类疫病的快速诊断提供必要的技术支撑。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法为非疾病诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一、合成引物与TaqMan探针：

根据CEV P4a基因序列，对现有引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R，合成1对特异性引物和1条TaqMan探针；根据KHVORF7基因保守序列，设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团；

所述CEV P4a基因序列对引物序列进行优化的下游引物为CEV-R，所述优化后的CEV-R序列为 RATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA；

所述CEV P4a基因序列对引物序列进行优化的上游引物为CEV-F，所述优化后的CEV-F序列为WGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC；

所述CEV P4a基因序列探针为CEV-Probe，所述CEV-Probe序列为FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1；

所述KHV ORF7基因保守序列设计的下游引物为KHV-R，所述KHV-R序列为CACGGATCTTCTATGCTACA；

所述KHV ORF7基因保守序列设计的上游引物为KHV-F，所述KHV-F序列为TTGTTGTGCGTTGATGTTC；

所述KHV-Probe序列为VIC-CTTGACGGCACTCGTCGAGCCGTAGCCC-BHQ1；

第二、确定反应体系及条件：

采用20 µL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10µL，上、下游引物和探针终浓度在0.2µmol/L～0.8µmol/L之间，QN ROX 参考染料0.1µL，模板2.5µL，DEPC水补足20µL；反应程序为：95 ℃预变性2 min，1个循环；95 ℃ 5 s，50～60 ℃退火31 s，40个循环。

2.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，反应体系确定为：2×Probe PCR Master Mix 10µL，CEV上、下游引物终浓度0.6µmol/L，探针终浓度0.3µmol/L，KHV上、下游引物终浓度0.4 µmol/L，探针终浓度0.2µmol/L，QN ROX 参考染料0.1 µL；模板2.5 µL，DEPC水补足20 µL；反应程序为：95 ℃预变性2min，1个循环；95 ℃ 5 s，56 ℃退火31 s，40个循环。

3.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法对CEV和KHV的灵敏度为15 copies/µL。

4.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3%。