CN111979356A - 一种大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以大黄鱼虹彩病毒LYCIV中的ORF021R和ORF129R保守区序列作为扩增靶序列,设计合成了两对特异性引物及对应的TaqMan探针,建立了LYCIV双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法,并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及大黄鱼虹彩病毒的检测方法,特别涉及大黄鱼虹彩病毒(LargeYellow Croaker Iridovirus,LYCIV)的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法。
背景技术
大黄鱼虹彩病毒(Large Yellow Croaker Iridovirus,LYCIV)是虹彩病毒科细胞肿大病毒属的成员,夏季高水温期为大黄鱼虹彩病毒病主要流行季节,高发期水温25℃-28℃,该病主要危害体长10cm左右的当年春苗,蔓延迅速,半个月内死亡率可达30%-50%。对于病毒性疫病,尚没有特效的治疗方法,病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。因此,建立快速灵敏实用的大黄鱼虹彩病毒PCR检测技术,不仅有助于及时对大黄鱼虹彩病毒进行诊断、监控和防治,减少经济损失,而且也是今后加强科学养殖管理,建立苗种检疫体系所必须的。
目前,对大黄鱼虹彩病毒的检测主要采用透射电镜(Transmission ElectronMicroscope,TEM)观察和常规聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测等技术方法。但这些方法有的耗时长,操作繁琐,有的准确度不高,灵敏度低。而TaqMan探针法荧光定量PCR技术巧妙的利用了PCR技术的DNA高效扩增、TaqMan探针与DNA模板的高特异性杂交和光谱技术的敏感性及定量分析的优点,选用双重探针可以同时检测病原的2个基因片段的特异性位点,相较单探针具有更高的准确性和特异性,尤其在鉴别同属近缘不同病毒时更具优势,克服了单探针法在检测同属近缘病毒时可能存在的假阳性及常规PCR检测准确度不高和灵敏度低的不足,极大地提高了检测的准确性、特异性和灵敏性。当前,荧光定量PCR技术已广泛应用于各种病毒的检测,如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒等,但还未见双重TaqMan探针法荧光定量PCR应用于大黄鱼虹彩病毒检测的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性高,简便快捷的大黄鱼虹彩病毒的双重探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法。
本发明所述大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒设有盒体、裂解液、吸附液、洗涤液、荧光定量PCR反应液、阳性对照和阴性对照。
所述裂解液的配方为:终浓度5mol/L盐酸胍,0.1mol/L EDTA,去离子水定容至1L,pH为8.0。
所述吸附液的组成为玻璃粉、浓硝酸与水,所述玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g:(5-6)mL:(10-12)mL,其中玻璃粉以质量计算,浓硝酸和水以体积计算,所述浓硝酸的质量分数可为55%-70%。
所述洗涤液的配方为:终浓度0.1mol/L 氯化钠,1mmol/L EDTA,10mmol/L Tris-HCl,去离子水定容至1L,pH为7.5,再加入等体积的无水乙醇。
荧光定量PCR反应液的配方为:每19μL中包含2×定量PCR预混液10μL(TaKaRaPremix Ex Taq (probe PCR)),正向引物F1 0.4μL,F2 0.4μL,反向引物R1 0.4μL,R2 0.4μL,荧光探针Q1 0.2μL,荧光探针Q2 0.6μL,双蒸水6.6μL;所述正向引物和反向引物的序列为:
正向引物F1(SEQID NO:1)5’-CTGAGGGTGGTCGTCTGGTT-3’
正向引物F2(SEQID NO:2)5’-CAACCACCTGCCGGTTACAG-3’
反向引物R1(SEQID NO:3)5’-ATGGCGACCCTGCTACTTCT-3’
反向引物R2(SEQID NO:4)5’-GTGACGGTGGAATAGCAGGC-3’
所述引物对F1和R1所扩增出的LYCIV-ORF021R基因片段的核苷酸序列为SEQID NO:5。
所述引物对F2和R2所扩增出的LYCIV-ORF129R基因片段的核苷酸序列为SEQIDNO:6。
SEQID NO:5序列为:
ctgagggtgg tcgtctggtt gtcgatttcc aggttataga aggtggtggc gtgagtacacgccacagtca gcaacagaag aagtagcagg gtcgccat;
SEQID NO:6序列为:
caaccacctg ccggttacag gccacgcacc ccggcaccac tttaccagcc gcttgttattccccccacac caccttacca gccgcctgct attccaccgt cac;
荧光探针Q1(SEQID NO:7)5’-AAGGTGGTGGCGTGAGTACACGCCA-3’;
荧光探针Q2(SEQID NO:8)5’-CCGGCACCACCTTACCAGCCGCCTGCT-3’;
荧光探针Q1(SEQID NO:7)5’端标记6-FAM荧光基团,荧光探针3’端标记能够淬灭荧光基团荧光信号的淬灭基团BHQ1。
荧光探针Q2(SEQID NO:8)5’端标记VIC荧光基团,荧光探针3’端标记能够淬灭荧光基团荧光信号的淬灭基团BHQ1。
所述阳性对照为质粒溶液稀释液,其中pMD18-T-LYCIV-ORF021R和pMD18-T-LYCIV-ORF129R的DNA拷贝数比为1:1;所述阴性对照为无菌水。
本发明所述大黄鱼虹彩病毒的检测方法包括以下步骤:
1)选取待测样品,加入裂解液进行裂解;第1次离心,收集上清,加吸附液,混匀,静置后,第2次离心,收集沉淀物,用洗涤液洗涤沉淀物后,再第3次离心,再收集沉淀物,加水充分悬浮沉淀物,即得PCR模板;
2)将步骤1)所得PCR模板1μL加入PCR反应液中进行荧光定量PCR反应,设立阳性对照和阴性对照,PCR反应的程序为:95℃ 25s;95℃ 5s,60℃ 35s,收集荧光信号,40个循环;
3)PCR反应结束后,分析可视化荧光定量分析软件中扩增曲线,以标准曲线中Ct值大小判断病毒的有无。阴性对照应无Ct值,阳性对照Ct值<35,且出现S型典型扩增曲线。待测样品Ct值≤35且出现典型扩增曲线,可判定为阳性;若待测样品无扩增曲线,或Ct值>35,可判定为阴性。
在步骤1)中,所述第1次离心可为12,000rpm,第1次离心时间可为3min;所述静置时间可为5min,静置期间摇匀1-3次;所述第2次离心可为10,000rpm,第2次离心时间可为15s;第3次离心可为10,000rpm,第3次离心时间可为30s。
在步骤2)中的阳性对照制备方法可为:
1)引物设计,具体方法为:
根据已公开的大黄鱼虹彩病毒基因组序列(GenBank登录号AY779031),采用PrimerPremier 5设计能特异性鉴别大黄鱼虹彩病毒的正向引物F1、F2和反向引物R1、R2:
正向引物F1(SEQID NO:1)5’-CTGAGGGTGGTCGTCTGGTT-3’;
正向引物F2(SEQID NO:2)5’-CAACCACCTGCCGGTTACAG-3’;
反向引物R1(SEQID NO:3)5’-ATGGCGACCCTGCTACTTCT-3’;
反向引物R2(SEQID NO:4)5’-GTGACGGTGGAATAGCAGGC-3’。
2)重组质粒pMD18-T-LYCIV-ORF021R(或pMD18-T-LYCIV-ORF129R)的构建步骤为:
使用本发明设计的大黄鱼虹彩病毒特异检测引物,以大黄鱼虹彩病毒检测阳性的大黄鱼内脏组织样品DNA为模板,经过PCR反应,获得一段98 bp(或103 bp)的ORF021R(或ORF129R)基因片段SEQID NO:5(或SEQID NO:6),然后将PCR产物电泳目的条带使用GelExtraction Kit(OMEGA,USA)切胶回收并连接到pMD18-T载体(TaKaRa, Dalian, China)上,转化至Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞(TransGen Biotech,China)中,筛选阳性克隆并测序验证;
3)阳性对照的制备
提取构建好的pMD18-T-LYCIV-ORF021R(或pMD18-T-LYCIV-ORF129R)质粒,用分光光度计检测质粒的质量和浓度,按照如下公式计算出目的基因的拷贝数,然后用灭菌超纯水稀释成浓度为1×108拷贝/μL。将2种含相同拷贝数的质粒溶液1:1混匀,即为阳性对照。将该阳性对照稀释到1×107拷贝/μL后继续做10倍系列稀释,得1×106-1×102拷贝/μL质粒,用于制作标准曲线。
本发明的优点在于:本发明以大黄鱼虹彩病毒LYCIV中的ORF021R和ORF129R保守区序列作为扩增靶序列,设计合成了两对特异性引物及对应的TaqMan探针,建立了LYCIV双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法,并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒,经实验,该试剂盒的检测灵敏度为100拷贝/μL,模板制备时间约30min,半个工作日即可得到准确的结果,无非特异性扩增,适用于LYCIV感染的苗种、成鱼的检疫,及水质环境的监测。
附图说明
图1是大黄鱼虹彩病毒(LYCIV)双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒横截面剖视图(即盒内设置的组成及位置示意图)。在图1中,各标记为:1:盒体、2:裂解液、3:吸附液、4:洗涤液、5:操作说明书、6:荧光定量PCR反应液、7:阴性对照、8:阳性对照。
图2为实施例2同时利用LYCIV的2个基因的引物和对应探针进行的特异性检测的标准曲线,上方标准曲线所检测基因片段为ORF021R,下方标准曲线所检测基因片段为ORF129R,黑色为质粒标准品,灰色为蛙病毒(TFV)或传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)。两个基因除了在构建的质粒标准品中成功扩增,未能同时在同科TFV和同属ISKNV中的检测灵敏度以上扩增。
图3为实施例2同时利用LYCIV的2个基因的引物和对应探针进行的灵敏度检测的标准曲线,上方标准曲线所检测基因片段为ORF021R,下方标准曲线所检测基因片段为ORF129R,灰色为ORF021R质粒标准品,黑色为ORF129R质粒标准品,R2为标准曲线相关系数,Eff%为基因扩增效率。图中从左到右检测拷贝数依次为1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107,即灵敏度为100拷贝/μL。
图4为实施例4应用大黄鱼虹彩病毒双重TaqMan探针法荧光定量PCR批量检测大黄鱼虹彩病毒的标准曲线。黑色为质粒标准品,灰色为具有病毒疑似症状的病灶组织样品及其对应的10-1,000倍稀释样本。
具体实施方式
实施例1 pMD18-T-LYCIV-ORF021R(或pMD18-T-LYCIV-ORF129R)重组质粒的构建
1)从获取的样品中提取病毒模板:取约15mg(1/2米粒大小)样品,滴入10滴裂解液(约300μL)并用牙签掏碎;12,000rpm离心3min,将上清液转至新管,加入20μL吸附液并混匀;室温放置5min后,10,000rpm离心15s,弃上清,滴入10滴洗涤液于沉淀中,并使沉淀充分悬浮;10,000rpm离心30s,去上清;加20μL无菌水,充分悬浮沉淀;10,000rpm离心30s,吸取上清液4μL用于PCR实验。
2)引物设计和质粒构建
(1)结合生物信息学手段,对细胞肿大病毒属病毒的基因组序列进行分析,确定了以LYCIV-ORF021R和LYCIV-ORF129R基因保守区序列作为扩增靶序列,并分别设计了一对特异性引物,其序列为:
正向引物F1(SEQID NO:1)5’-CTGAGGGTGGTCGTCTGGTT-3’
正向引物F2(SEQID NO:2)5’-CAACCACCTGCCGGTTACAG-3’
反向引物R1(SEQID NO:3)5’-ATGGCGACCCTGCTACTTCT-3’
反向引物R2(SEQID NO:4)5’-GTGACGGTGGAATAGCAGGC-3’
(2)PCR扩增LYCIV-ORF021R(或PCR扩增LYCIV-ORF129R,使用引物对F2和R2,扩增体系和后续程序等不变),使用如下体系进行PCR:
2×PCR预混液 25μL
正向引物F1 1μL
反向引物R1 1μL
组织DNA模板 2μL
灭菌超纯水 21μL
PCR反应程序为:94℃ 4min;94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,32个循环;72℃ 5min。
(3)扩增后的PCR产物,经胶回收后连接至pMD18-T载体,构建pMD18-T-LYCIV-ORF021R(或pMD18-T-LYCIV-ORF129R)质粒,并经测序进行序列验证。
实施例2 特异性及灵敏度检测
1)特异性检测
分别用阳性对照及稀释液,阴性对照,传染性脾肾坏死病毒模板,蛙病毒模板按双重TaqMan探针法荧光定量PCR反应体系进行PCR扩增,分析可视化荧光定量分析软件中扩增曲线,并依据标准曲线中检测样品所对应的Ct值大小判断病毒有无。实验结果(参见图2)说明该双重TaqMan探针法荧光定量PCR能特异性检测大黄鱼虹彩病毒,同时所筛选的两个基因在检测灵敏度以上未能同时在TFV和ISKNV中扩增。
2)灵敏度检测
将阳性对照及10倍系列稀释液,即浓度1×107、1×106、1×104、1×103、1×102拷贝数/μL作为双重TaqMan探针法荧光定量PCR模板,每个浓度模板取1μL用于标准曲线的构建,并在荧光定量PCR仪上进行扩增。实验结果(参见图3)说明每个反应管内的荧光信号达到阈值所需的循环数(Ct)和起始模板拷贝数的对数存在明显的线性关系(R2=0.996和R2=0.993),检测的最小模板浓度为100拷贝/μL。
实施例3 所述大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法
通过上述一系列试验最后确定一种简单快速的检测方法,从制备模板到检测出结果仅需半个工作日。
1)检测试剂配制:
裂解液:终浓度5mol/L盐酸胍,0.1mol/L EDTA,去离子水定容至1L,pH为8.0。
吸附液:将玻璃粉、浓硝酸与水按1g:(5-6)mL:(10-12)mL的比例配制吸附液,其中玻璃粉以质量计算,浓硝酸和水以体积计算,所述浓硝酸的质量分数可为55%-70%。
洗涤液:终浓度0.1mol/L 氯化钠,1mmol/L EDTA,10mmol/L Tris-HCl,去离子水定容至1L,pH为7.5,再加入等体积的无水乙醇,摇匀。
荧光定量PCR反应液:每19μL中包含2×定量PCR预混液10μL,正向引物F1 0.4μL,F2 0.4μL,反向引物R1 0.4μL,R2 0.4μL,荧光探针Q1 0.2μL,荧光探针Q2 0.6μL,双蒸水6.6μL。
阳性对照:质粒溶液稀释液,其中pMD18-T-LYCIV-ORF021R和pMD18-T-LYCIV-ORF129R的DNA拷贝数比为1:1。
阴性对照:无菌水。
灭菌牙签,灭菌后烘干。
2)主要仪器及耗材
荧光定量PCR仪,台式高速离心机,涡旋震荡器,移液枪,0.5mL离心管,1.5mL离心管,200μL PCR管,灭菌枪头,不锈钢镊子,一次性滴管,一次性手套。
3)检测步骤
1. 待测样品的选取:约15mg(约1/2米粒大小)鱼组织。鱼苗可整只检测,长度4cm-30cm鱼可用镊子取脾、肾等组织。
2. 将取得的鱼组织置于1.5mL离心管内,滴入10滴裂解液,用牙签捣碎(约1-2min)。
3. 12,000rpm离心3min,将上清转移至新管内,加20μL吸附液(内含白色物质,用前充分摇匀),混匀后室温静置5min,期间摇匀3次。
4. 10,000rpm离心15s,弃上清,再离心3s,用移液枪吸干残余液体,滴入10滴洗涤液于沉淀中,用移液枪轻轻搅动至沉淀充分悬浮起来。
5. 10,000rpm离心30s,弃上清,再离心3s,用移液枪吸干残余液体,将沉淀置于PCR仪中60℃烘3min(打开离心管盖)。
6. 加20μL蒸馏水,充分悬浮沉淀,10,000rpm离心30s,吸取上清1μL于PCR反应管(内含19μL荧光定量PCR反应液),用涡旋震荡器混匀,5,000rpm离心3s,即可上机检测。阳性对照和阴性对照不需处理,直接取1μL于反应管做荧光定量PCR即可。PCR反应的程序为:95℃ 25s;95℃ 5s,60℃ 35s,收集荧光信号,40个循环。
7. PCR反应结束后,分析可视化荧光定量分析软件中扩增曲线,以标准曲线中Ct值大小判断病毒的有无。阴性对照应无Ct值,阳性对照Ct值<35,且出现S型典型扩增曲线。待测样品Ct值≤35且出现典型扩增曲线,可判定为阳性;若待测样品无扩增曲线,或Ct值>35,可判定为阴性。
实施例4应用大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测大黄鱼虹彩病毒
对大黄鱼虹彩病毒高发期,海水网箱养殖的具有疑似症状的大黄鱼进行双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测,并将每个样品所提DNA进行10倍系列稀释3个梯度作模板,上机进行双重TaqMan探针法荧光定量PCR,结果说明(参见图4)养殖中发病大黄鱼虹彩病毒的病毒量至少约为105拷贝/μL,本发明所建立方法可以满足生产上大黄鱼虹彩病毒的病原检疫需要,对常规提取的DNA,再稀释100-1,000倍亦可以成功检出大黄鱼虹彩病毒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方
法
<130> 8
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgagggtgg tcgtctggtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caaccacctg ccggttacag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 4
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<212> DNA
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<400> 5
ctgagggtgg tcgtctggtt gtcgatttcc aggttataga aggtggtggc gtgagtacac 60
gccacagtca gcaacagaag aagtagcagg gtcgccat 98
<210> 6
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caaccacctg ccggttacag gccacgcacc ccggcaccac tttaccagcc gcttgttatt 60
ccccccacac caccttacca gccgcctgct attccaccgt cac 103
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaggtggtgg cgtgagtaca cgcca 25
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccggcaccac cttaccagcc gcctgct 27
Claims (4)
1.一种大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含特异性引物和探针,其序列如下:
正向引物F1:5’-CTGAGGGTGGTCGTCTGGTT-3’;
正向引物F2:5’-CAACCACCTGCCGGTTACAG-3’;
反向引物R1:5’-ATGGCGACCCTGCTACTTCT-3’;
反向引物R2:5’-GTGACGGTGGAATAGCAGGC-3’;
荧光探针Q1:5’-AAGGTGGTGGCGTGAGTACACGCCA-3’;
荧光探针Q2:5’-CCGGCACCACCTTACCAGCCGCCTGCT-3’;
所述荧光探针Q1的5’端标记6-FAM荧光基团,3’端标记能够淬灭荧光基团荧光信号的淬灭基团BHQ1;
荧光探针Q2的5’端标记VIC荧光基团, 3’端标记能够淬灭荧光基团荧光信号的淬灭基团BHQ1。
2.一种如权利要求1所述试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备盒体;
(2)配制检测试剂:
裂解液的配方为:终浓度5mol/L盐酸胍,0.1mol/L EDTA,去离子水定容至1L,pH为8.0;
吸附液的组成为玻璃粉、浓硝酸与水,所述玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g:5~6 mL:10~12 mL,所述浓硝酸的质量分数为55%-70%;
洗涤液的配方为:终浓度0.1mol/L 氯化钠,1mmol/L EDTA,10mmol/L Tris-HCl,去离子水定容至1L,pH为7.5,再加入等体积的无水乙醇;
荧光定量PCR反应液的配方为:每19μL中包含2×定量PCR预混液10μL,正向引物F1 0.4μL,F2 0.4μL,反向引物R1 0.4μL,R2 0.4μL,荧光探针Q1 0.2μL,荧光探针Q2 0.6μL,双蒸水6.6μL;
阳性对照为DNA拷贝数比1:1的pMD18-T-LYCIV-ORF021R和pMD18-T-LYCIV-ORF129R的混合溶液;
阴性对照为无菌水;
(3)将裂解液、吸附液、洗涤液、操作说明书、荧光定量PCR反应液、阴性对照、阳性对照置入盒体内,即得到大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述阳性对照的制备方法为:
1)引物设计,具体方法为:
根据已公开的大黄鱼虹彩病毒基因组序列,采用Primer Premier 5设计能特异性鉴别大黄鱼虹彩病毒的正向引物F1、F2和反向引物R1、R2:
正向引物F1:5’-CTGAGGGTGGTCGTCTGGTT-3’;
正向引物F2:5’-CAACCACCTGCCGGTTACAG-3’;
反向引物R1:5’-ATGGCGACCCTGCTACTTCT-3’;
反向引物R2:5’-GTGACGGTGGAATAGCAGGC-3’;
2)重组质粒pMD18-T-LYCIV-ORF021R或pMD18-T-LYCIV-ORF129R的构建步骤为:
使用大黄鱼虹彩病毒特异检测引物,以大黄鱼虹彩病毒检测阳性的大黄鱼内脏组织样品DNA为模板,经过PCR反应,获得一段98 bp或103 bp的ORF021R或ORF129R基因片段,然后将PCR产物电泳目的条带使用Gel Extraction Kit切胶回收并连接到pMD18-T载体上,转化至Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞中,筛选阳性克隆并测序验证;
3)阳性对照的制备
提取构建好的pMD18-T-LYCIV-ORF021R或pMD18-T-LYCIV-ORF129R质粒,用分光光度计检测质粒的质量和浓度,按照如下公式计算出目的基因的拷贝数,然后用灭菌超纯水稀释成浓度为1×108拷贝/μL;将2种含相同拷贝数的质粒溶液1:1混匀,即为阳性对照;将该阳性对照稀释到1×107拷贝/μL后继续做10倍系列稀释,得1×106-1×102拷贝/μL质粒,用于制作标准曲线:
4.一种利用权利要求1所述试剂盒判定大黄鱼虹彩病毒的方法,其特征在于,以标准曲线中Ct值大小判断病毒的有无;阴性对照应无Ct值,阳性对照Ct值<35,且出现S型典型扩增曲线;待测样品Ct值≤35且出现典型扩增曲线,可判定为阳性;若待测样品无扩增曲线,或Ct值>35,可判定为阴性。
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