CN105779443B - 鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物。本发明的牡蛎疱疹病毒1型(OsHV‑1)的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV‑1)的特异性好，采用4条引物共识别目的片段6个特异性的区域。用本发明的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV‑1)的灵敏度高，环介导等温扩增最低能实现1fg OsHV‑1核酸的检测，PCR扩增仅能实现对100fg以上OsHV‑1核酸的检测，环介导等温扩增的检测灵敏度比PCR扩增高100倍。用本发明的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV‑1)结果可视化，适于批量样品的检测，也使基层及现场检测成为了可能。

Description

鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物
技术领域
本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物。
背景技术
牡蛎疱疹病毒(OsHV)粒子呈六角形，直径70-90nm，具单层外膜，有的病毒粒子具浓密的类核，受感染的牡蛎消化腺呈苍灰色，散发性死亡，造成了严重的经济损失。此病常发生于发电站排出的热水养殖的牡蛎，发病水温为28-30℃，水温下降后，此病随之消失，发病与水温密切相关。
目前，常规的OsHV检测方法主要有电镜观察、免疫学方法(ELISA等)和PCR等，这些方法可以对OsHV进行特异的检测，但是具有明显的费时、费力、灵敏度低和特异性差等缺点。虽然PCR方法可以作为一种灵敏而特异的病原检测和鉴定技术，但PCR反应需要PCR仪等昂贵的设备，而且需要在实验室内，利用琼脂糖凝胶电泳方法对PCR产物进行分析，这在一定程度上限制了病原快速检测技术的发展。荧光实时定量技术的建立实现了对OsHV的定量检测，而且检测灵敏度很高，可以达到100拷贝病毒粒子，但是，该方法需要荧光实时定量PCR仪等昂贵的设备和试剂，这些局限性使得该方法很难得到推广使用。
近年来，一种新的恒温核酸扩增方法LAMP(loop-mediated isothermalamplification)，即环介导等温扩增技术已经被开发并应用。它采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在恒温条件下进行核酸扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、成本低廉、产物易检测和不需要电泳仪以及PCR仪等优点。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速、灵敏、特异性地鉴定牡蛎疱疹病毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种引物组合物。
本发明所提供的一种引物组合物(引物组合物甲)，由引物OsHV-F3、引物OsHV-B3、引物OsHV-FIP和引物OsHV-BIP组成；所述引物OsHV-F3、所述引物OsHV-B3、所述引物OsHV-FIP和所述引物OsHV-BIP均为单链DNA分子；所述引物OsHV-F3如序列表中序列1所示；所述引物OsHV-B3如序列表中序列2所示；所述引物OsHV-FIP如序列表中序列3所示；所述引物OsHV-BIP如序列表中序列4所示。
所述引物组合物的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型；(b)鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型。所述待测生物样品中的生物具体可为扇贝，更具体可为栉孔扇贝。
当应用所述引物组合物鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型时，具体方法如下：以待测病毒的基因组DNA或待测病毒的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果反应结果呈阳性，待测病毒为候选的牡蛎疱疹病毒1型；如果反应结果呈阴性，待测病毒为候选的非牡蛎疱疹病毒1型。
当应用所述引物组合物鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型时，具体方法如下：以待测生物样品的总DNA或待测生物样品的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果反应结果呈阳性，待测生物样品疑似含有牡蛎疱疹病毒1型；如果反应结果呈阴性，待测生物样品疑似不含有牡蛎疱疹病毒1型。
上述引物组合物中，所述OsHV-F3、所述OsHV-B3、所述OsHV-FIP和所述OsHV-BIP的摩尔比可为1:1:8:8。
含有所述引物组合物甲的试剂盒也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型；(b)鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型。所述待测生物样品中的生物具体可为扇贝，更具体可为栉孔扇贝。所述试剂盒可为环介导等温扩增试剂盒。所述试剂盒中，所述OsHV-F3、所述OsHV-B3、所述OsHV-FIP和所述OsHV-BIP可各自独立包装，也可混合在一起。所述试剂盒，可包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、
dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、Mg2+和所述引物组合物甲。所述试剂盒中，所述链置换型DNA聚合酶、所述甜菜碱、所述dATP、所述dCTP、所述dGTP、所述dTTP、所述Mg2+、所述OsHV-F3、所述OsHV-B3、所述OsHV-FIP和所述OsHV-BIP的配比可为320×103U：1mol：1.6mmol：1.6mmol：1.6mmol：1.6mmol：4mmol：0.2μmol：0.2μmol：1.6μmol：1.6μmol。所述试剂盒中，所述链置换型DNA聚合酶可为Bst DNA聚合酶。所述试剂盒中，所述等温扩增试剂还可包括荧光染料。所述荧光染料可为GeneFinderTM。
当所述试剂盒的功能为(a)时，所述试剂盒中还可包括记载有下述内容的载体：以待测病毒的基因组DNA或待测病毒的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果检测结果呈阳性(反应体系呈现绿色或反应产物电泳后显示阶梯状条带)，待测病毒为候选的牡蛎疱疹病毒1型；如果检测结果呈阴性(反应体系呈现橙色或反应产物电泳后不显示任何条带)，待测病毒为候选的非牡蛎疱疹病毒1型。
当所述试剂盒的功能为(b)时，所述试剂盒中还可包括记载有下述内容的载体：以待测生物样品的总DNA或待测生物样品的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果检测结果呈阳性(反应体系呈现绿色或反应产物电泳后显示阶梯状条带)，待测生物样品疑似含有牡蛎疱疹病毒1型；如果检测结果呈阴性(反应体系呈现橙色或反应产物电泳后不显示任何条带)，待测生物样品疑似不含有牡蛎疱疹病毒1型。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法。所述制备方法，包括将所述OsHV-F3、所述OsHV-B3、所述OsHV-FIP和所述OsHV-BIP分别单独包装的步骤。所述制备方法，包括将所述链置换型DNA聚合酶、所述甜菜碱、所述dATP、所述dCTP、所述dGTP、所述dTTP、Mg2+、所述OsHV-F3、所述OsHV-B3、所述OsHV-FIP和所述OsHV-BIP分别单独包装的步骤。
所述引物组合物甲在制备试剂盒中的应用也属于本发明保护的范围。所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型；(b)鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型。所述待测生物样品中的生物具体可为扇贝，更具体可为栉孔扇贝。所述试剂盒可为环介导等温扩增试剂或试剂盒。
本发明还保护所述的引物组合物甲的应用，为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型；(b)鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型。
当应用所述引物组合物鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型时，具体方法如下：以待测病毒的基因组DNA或待测病毒的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果反应结果呈阳性，待测病毒为候选的牡蛎疱疹病毒1型；如果反应结果呈阴性，待测病毒为候选的非牡蛎疱疹病毒1型。
当应用所述引物组合物鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型时，具体方法如下：以待测生物样品的总DNA或待测生物样品的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果反应结果呈阳性，待测生物样品疑似含有牡蛎疱疹病毒1型；如果反应结果呈阴性，待测生物样品疑似不含有牡蛎疱疹病毒1型。
上述引物组合物中，所述OsHV-F3、所述OsHV-B3、所述OsHV-FIP和所述OsHV-BIP的摩尔比可为1:1:8:8。
当应用所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型时，具体方法如下：以待测病毒的基因组DNA或待测病毒的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果检测结果呈阳性(反应体系呈现绿色或反应产物电泳后显示阶梯状条带)，待测病毒为候选的牡蛎疱疹病毒1型；如果检测结果呈阴性(反应体系呈现橙色或反应产物电泳后不显示任何条带)，待测病毒为候选的非牡蛎疱疹病毒1型。
当应用所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型时，具体方法如下：以待测生物样品的总DNA或待测生物样品的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果检测结果呈阳性(反应体系呈现绿色或反应产物电泳后显示阶梯状条带)，待测生物样品疑似含有牡蛎疱疹病毒1型；如果检测结果呈阴性(反应体系呈现橙色或反应产物电泳后不显示任何条带)，待测生物样品疑似不含有牡蛎疱疹病毒1型。
以上任一所述环介导等温扩增中，所述OsHV-F3、所述OsHV-B3、所述OsHV-FIP和所述OsHV-BIP的摩尔比可为1:1:8:8。
以上任一所述环介导等温扩增中，链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Mg2+、所述OsHV-F3、所述OsHV-B3、所述OsHV-FIP和所述OsHV-BIP的配比可为320×103U：1mol：1.6mmol：1.6mmol：1.6mmol：1.6mmol：4mmol：0.2μmol：0.2μmol：1.6μmol：1.6μmol。
以上任一所述环介导等温扩增的反应温度可为60-65℃，具体可为64℃。以上任一所述环介导等温扩增的反应时间可为15-60分钟，具体可为30-60分钟或60分钟。
本发明还保护一种进行环介导等温扩增的引物组合物(引物组合物乙)，由四条或六条引物组成；所述引物组合物的靶标区域包括特异DNA分子；所述特异DNA分子为牡蛎疱疹病毒1型的基因组中所述引物OsHV-F3和所述引物OsHV-B3的靶序列。
本发明还保护一种特异DNA分子，为牡蛎疱疹病毒1型的基因组中所述引物OsHV-F3和所述引物OsHV-B3的靶序列。
本发明还保护所述引物组合物乙或所述特异DNA分子的应用，为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型；(b)鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型。
以上任一所述待测病毒可为牡蛎疱疹病毒1型、对虾白斑综合征病毒、大菱鲆红体病虹彩病毒或虾黄头病毒锦鲤疱疹病毒。
实验证明，本发明的牡蛎疱疹病毒1型(OsHV-1)的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV-1)的特异性好，采用4条引物共识别目的片段6个特异性的区域，在引物组合物特异性检测中只有牡蛎疱疹病毒1型(OsHV-1)的DNA体系肉眼观察清晰可见荧光颜色，反应液呈现绿色，其它对虾白斑综合征病毒(WSSV)的DNA体系、大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)的DNA体系、虾黄头病毒(YHV)的DNA体系和锦鲤疱疹病毒(KHV)的DNA体系和负对照的反应体系基本无任何明显颜色变化，无特异性扩增；用本发明的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV-1)的灵敏度高，环介导等温扩增最低能实现1fg OsHV-1核酸的检测(每个25μL体系中)，PCR扩增仅能实现对100fg以上OsHV-1核酸的检测，环介导等温扩增的检测灵敏度比PCR扩增高100倍。用本发明的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV-1)，仅要求一台可调的恒温水浴锅等类似的简单仪器，不必苛求昂贵的仪器设备；用本发明的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV-1)检测快速，能在60min内完成反应；用本发明的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV-1)结果可视化，扩增产物无需电泳分析，反应结束后就可直接通过反应产物的颜色变化判断检测结果，又可以避免开盖污染造成下次反应的假阳性，适于基层或现场快速诊断。用本发明的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV-1)适用于批量样品的检测及一般实验室的检测，也使基层及现场检测成为了可能。本发明非常适合在条件简陋的实验室或养殖场推广使用。
附图说明
图1为LAMP反应温度和反应时间优化的琼脂糖凝胶电泳图；A为反应温度的优化，泳道1-4分别代表反应温度为62、63、64和65℃；B为反应时间的优化，泳道1-4分别代表反应时间为15、30、45和60min；泳道M代表DL2000DNA Marker。
图2为LAMP反应体系优化的琼脂糖凝胶电泳图；A为Mg2+浓度的优化，泳道1-7代表Mg2+的浓度分别为0、2、4、6、8、10和12mM；B为dNTP浓度的优化，泳道1-5代表dNTP浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mM；C为外引物和内引物的浓度比例的优化，泳道1-5代表比例分别为1:2、1:4、1:8、1:10和1:12，泳道M代表DL2000DNA Marker。
图3为肉眼直接观察LAMP反应产物确定是否有靶序列进行了扩增；A为通过观察管中白色沉淀确定是否有靶序列进行了扩增；B为通过加入荧光染料后的颜色变化确定是否有靶序列进行了扩增；1和2为加入牡蛎疱疹病毒1型的基因组DNA作为模板；NC为加入水作为模板。
图4为LAMP和PCR检测OsHV-1的灵敏度比较；A为LAMP反应产物分析；B为PCR反应产物分析；泳道1-8分别为10倍系列稀释的病毒DNA(1ng/μL-0.1fg/μL)，泳道1为1ng/μL，泳道2为100pg/μL，泳道3为10pg/μL，泳道4为1pg/μL，泳道5为100fg/μL，泳道6为10fg/μL，泳道7为1fg/μL，泳道8为0.1fg/μL；泳道M代表DL2000DNA Marker。
图5为LAMP反应的特异性检测；PC代表正对照，泳道1代表牡蛎疱疹病毒1型的LAMP反应产物，泳道2代表栉孔扇贝的LAMP反应产物，泳道3代表对虾白斑综合征病毒的LAMP反应产物，泳道4代表大菱鲆红体病虹彩病毒的LAMP反应产物，泳道5代表虾黄头病毒的LAMP反应产物，泳道6代表锦鲤疱疹病毒的LAMP反应产物，NC代表将等体积水作为模板的阴性对照，泳道7代表牡蛎疱疹病毒1型的LAMP反应产物用限制性内切酶Mob I酶切后的产物。
图6为LAMP和PCR检测样品的应用；A为LAMP反应产物的琼脂糖凝胶电泳图；B为PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳图；C为加入荧光染料后检测LAMP反应产物；1-10代表感染了OsHV-1的栉孔扇贝的基因组DNA；11-20代表未感染OsHV-1的栉孔扇贝的基因组DNA；PC为正对照；NC为阴性对照；M代表DL2000DNA Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述定量试验，如无特殊说明，均进行五次重复试验，结果取平均值。
DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)：天根生化科技有限公司,货号为DP304。甜菜碱：Sigma-Aldrich公司,货号为B2629。Bst DNA聚合酶：New EnglandBiolabs.Inc.公司,货号为R0607S。GeneFinderTM：北京金博益生物技术有限公司公司,货号为GBY-9。
牡蛎疱疹病毒1型(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)：参考文献：高文辉,白昌明,蔡生力,王崇明.基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因的巢式PCR检测方法的建立及应用[A].中国水产学会.2015年中国水产学会学术年会论文摘要集[C].中国水产学会,2015:1.。牡蛎疱疹病毒1型为DNA病毒。
对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)：参考文献：闫冬春.对虾白斑综合征病毒(WSSV)宿主研究进展[J].海洋湖沼通报，2007，01：136-140.。对虾白斑综合征病毒为DNA病毒。
大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)：参考文献：樊廷俊,王丽燕,耿晓芬,丛日山,李明玉,于秋涛,杨秀霞.大菱鲆红体病虹彩病毒体外增殖条件的研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2006,05:767-774.。大菱鲆红体病虹彩病毒为DNA病毒。
虾黄头病毒(Yellow head disease,YHV)：参考文献：熊炜,邱璐,李健,蒋静,王巧全,胡永强.上海检验检疫局从泰国进境草虾中检出虾黄头病毒[J].检验检疫科学,2006,06:61-62.。虾黄头病毒为RNA病毒。
锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)：参考文献：朱霞,王好,李新伟,周井祥.锦鲤疱疹病毒病的研究进展[J].中国兽医科学,2011,01:106-110.。锦鲤疱疹病毒为DNA病毒。
栉孔扇贝：参考文献：马元庆,张秀珍,孙玉增,靳洋,刘义豪,孙珊,魏潇.栉孔扇贝对重金属的富集效应研究[J].水产学报,2010,10:1572-1578.。
感染牡蛎疱疹病毒1型的栉孔扇贝的发病表征：贝壳开闭缓慢无力,对外界刺激反应迟钝；病贝足丝脱落,失去固着作用；去掉贝壳发现外套腔内分泌物增多，积有少量淤泥，消化腺轻微肿胀，肾脏易剥离，外套膜向壳顶部收缩，外套眼失去光泽；患病严重的扇贝鳃丝轻度糜烂，肠道空或半空；病贝的软体部无脓疱及其他明显的病灶，炎症反应不明显；扇贝出现上述症状2～3d后很快死亡，死亡率在90％以上。
实施例1、引物组合物的制备
鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒1型的引物组合物，由引物OsHV-F3、引物OsHV-B3、引物OsHV-FIP和引物OsHV-BIP组成。各引物均为单链DNA分子。
各引物的核苷酸序列分别如下：
OsHV-F3(序列表中序列1)：5'-gtgctgagacggaatgtg-3'；
OsHV-B3(序列表中序列2)：5'-tggatgacacccttatgc-3'；
OsHV-FIP(序列表中序列3)：5'-gacatctggcggtattttcaatatgtttttgcagtttaaatctcccaac-3'；
OsHV-BIP(序列表中序列4)：5'-ggttagatctacaattgcgccattttcaccattcttttgacacagg-3'。
鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物中，OsHV-F3、OsHV-B3、OsHV-FIP和OsHV-BIP均独立包装。
实施例2、牡蛎疱疹病毒1型鉴定的条件优化
提取牡蛎疱疹病毒1型的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行环介导等温扩增，然后取环介导等温扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶置于GeneFinderTM中染色后在凝胶成像系统下观察。
环介导等温扩增的反应体系的组成如下(25μL)：OsHV-FIP、OsHV-BIP、OsHV-F3、OsHV-B3、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、甜菜碱、MgSO4、KCl、(NH4)2SO4、Triton X-100、Bst DNA聚合酶、模板和Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.8)。环介导等温扩增的反应条件如下：恒温反应一定时间，然后80℃作用2min以终止反应。分别进行如下参数优化：MgSO4在环介导等温扩增体系中的浓度为0-12mM；dNTPs在环介导等温扩增体系中的浓度为0.4-1.6mM；外引物(OsHV-F3和OsHV-B3)与内引物(OsHV-FIP和OsHV-BIP)的浓度比例为1：(2-12)；反应温度为62℃、63℃、64℃或65℃；反应时间为15、30、45或60min。
最终优化后的参数如下：
环介导等温扩增的反应体系的组成(25μL)：溶剂为Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.8)；溶质的浓度如下：OsHV-FIP 1.6μM、OsHV-BIP 1.6μM、OsHV-F3 0.2μM、OsHV-B3 0.2μM、dNTPs 1.6mM(dATP、dCTP、dGTP和dTTP均为1.6mM)、甜菜碱1M、MgSO4 4mM、KCl 10mM、(NH4)2SO4 10mM、Triton X-100 0.1％(体积比)、Bst DNA聚合酶8×106U和1μL模板溶液(1μL模板溶液中DNA的浓度为10ng/μL)。
环介导等温扩增的反应条件：64℃反应60分钟，然后80℃反应2min。
参数优化时的部分结果见图1和图2。图1为对反应温度和反应时间进行优化时的结果，反应体系组成采用优化后的具体值。图2为对反应体系中的各个参数进行优化时的结果，当优化某个参数时其它参数采用优化后的具体值，反应条件采用优化后的具体值。当反应温度为63℃时开始出现LAMP特异性条带，但是63℃和65℃条带不清晰且扩增产物的量不大，扩增产物量最大且条带最清晰的扩增温度是64℃，因此64℃作为LAMP的最佳反应温度。反应时间为30min-60min都可以得到清晰明亮的特异性条带，但为了使LAMP反应更加彻底，得到更好的检测结果，选择60min作为LAMP的最佳反应时间。
实施例3、应用引物组合物鉴定牡蛎疱疹病毒1型
提取牡蛎疱疹病毒1型的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行环介导等温扩增，环介导等温扩增结束后进行直接肉眼观察(如果反应管中呈现沉淀或浑浊，代表阳性扩增结果；如果反应管中保持澄清，代表阴性扩增结果)。
提取牡蛎疱疹病毒1型的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行环介导等温扩增，环介导等温扩增结束后，向25μL反应体系中加入1μL染液(染液即为稀释100倍GeneFinderTM核酸染料)，在紫外灯照射下观察颜色变化(如果颜色变绿，代表阳性扩增结果；如果颜色不变，保持橙色，代表阴性扩增结果)。
环介导等温扩增采用实施例2中最终优化后的参数。用等体积的水代替模板溶液，作为NC处理。
结果见图3。直接肉眼观察时，牡蛎疱疹病毒1型的检测结果为阳性，NC的检测结果为阴性。在紫外灯照射下观察时，牡蛎疱疹病毒1型的检测结果为阳性，NC的检测结果为阴性。
实施例4、引物组合物的灵敏性
1、提取牡蛎疱疹病毒1型的基因组DNA。
2、取步骤1得到的基因组DNA，采用水进行10倍梯度稀释，得到DNA浓度为1ng/μL-0.1fg/μL的基因组DNA稀释液。
3、以基因组DNA稀释液为模板进行环介导等温扩增，然后取环介导等温扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶置于GeneFinderTM中染色后在凝胶成像系统下观察。
环介导等温扩增的反应体系的组成(25μL)：溶剂为Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.8)；溶质的浓度如下：OsHV-FIP 1.6μM、OsHV-BIP 1.6μM、OsHV-F3 0.2μM、OsHV-B3 0.2μM、dNTPs 1.6mM(dATP、dCTP、dGTP和dTTP均为1.6mM)、甜菜碱1M、MgSO4 4mM、KCl 10mM、(NH4)2SO4 10mM、Triton X-100 0.1％(体积比)、Bst DNA聚合酶8×106U和1μL模板溶液。
环介导等温扩增的反应条件：64℃反应60分钟，然后80℃反应2min。
4、以基因组DNA稀释液为模板，进行PCR扩增，然后取PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶置于GeneFinderTM中染色后在凝胶成像系统下观察。
PCR扩增的引物如下(靶片段为314bp，为牡蛎疱疹病毒1型基因组DNA中的其它区段)：
OsHV-1-P3：5'-TACCGCCAGATGTCCTCCTA-3'；
OsHV-1-P4：5'-TACCCAATTCCAACCCTGTT-3。
PCR扩增的反应体系(25μL)10倍Taq酶用浓缩缓冲液2μL、25mmoL/L的MgCl2 2μL、dNTP 0.5μL、引物OsHV-1-P3 0.5μL、引物OsHV-1-P4 0.5μL、Taq酶1U、加水到总体积为25μL。
PCR扩增的反应条件：94℃4min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，共35个循环；72℃5min。
步骤3和步骤4的结果见图4。结果显示，环介导等温扩增最低能实现1fg OsHV-1核酸的检测(每个25μL体系中)，PCR扩增仅能实现对100fg以上OsHV-1核酸的检测，环介导等温扩增的检测灵敏度比PCR扩增高100倍。
实施例5、引物组合物的特异性
分别制备各个模板：提取牡蛎疱疹病毒1型的基因组DNA，作为模板1；提取对虾白斑综合征病毒的基因组DNA，作为模板2；提取大菱鲆红体病虹彩病毒的基因组DNA，作为模板3；提取虾黄头病毒的总RNA并反转录为cDNA，作为模板4；提取锦鲤疱疹病毒的基因组DNA，作为模板5；提取栉孔扇贝的基因组DNA，作为模板6。
分别采用各个模板进行环介导等温扩增。环介导等温扩增采用实施例2中最终优化后的参数。用等体积的水代替模板溶液，作为NC处理。
取环介导等温扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶置于GeneFinderTM中染色后在凝胶成像系统下观察。结果见图5的泳道1-6。只有牡蛎疱疹病毒1型为阳性结果，其它4种病毒以及栉孔扇贝均为阴性结果。结果表明，本发明提供的引物组合物特异性良好，与其它病毒的DNA没有交叉反应，和扇贝的DNA也没有交叉反应。
取环介导等温扩增产物，用限制性内切酶MobI进行酶切，然后将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶置于GeneFinderTM中染色后在凝胶成像系统下观察。MobI识别位点位于引物OsHV-BIP上，酶切后的片段大小约为74bp和134bp的产物。结果见图5的泳道7。结果和预期片段大小一致。进一步通过测序的方法对该两个片段的序列信息进行了验证，测序结果也与预期的核苷酸序列一致。
实施例6、应用引物组合物检测扇贝是否感染了牡蛎疱疹病毒1型
样本：10份感染OsHV-1的栉孔扇贝(将OsHV-1侵染栉孔扇贝，得到感染OsHV-1的栉孔扇贝)和10份没有感染OsHV-1的栉孔扇贝。
提取各个样本的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行环介导等温扩增。环介导等温扩增采用实施例2中最终优化后的参数。用等体积的水代替模板溶液，作为NC处理。用等体积的OsHV-1的基因组DNA代替模板溶液，作为PC处理。取环介导等温扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶置于GeneFinderTM中染色后在凝胶成像系统下观察，结果见图6A。环介导等温扩增结束后，向25μL反应体系中加入1μL染液(染液即为稀释100倍GeneFinderTM核酸染料)，在紫外灯照射下观察颜色变化,结果见图6C。
提取各个样本的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增(PCR扩增的引物、反应体系和反应条件同实施例4的步骤4)，然后取PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶置于GeneFinderTM中染色后在凝胶成像系统下观察，结果见图6B。
结果表明，LAMP方法检测10份感染OSHV-1的扇贝样品的结果均为阳性，而10份没有感染OsHV-1的扇贝样品的检测结果均为阴性。PCR方法对该20份样品的检测结果和LAMP方法的一致。该两种方法检测样品的结果呈现100％的一致性。同时，采用向反应混合物中加入核酸染料的方法，对LAMP检测该20份样品的扩增结果进行了肉眼直接观察，结果显示，该种方法检测样品的结果和电泳分析结果一致。该方法表明在LAMP检测OsHV-1的实验中，LAMP产物的检测可以不必进行电泳分析，而可以通过这种简单的方法直接对LAMP扩增结果的进行鉴定，简化了实验步骤。

Claims (6)

1.一种引物组合物，由引物OsHV-F3、引物OsHV-B3、引物OsHV-FIP和引物OsHV-BIP组成；所述引物OsHV-F3、所述引物OsHV-B3、所述引物OsHV-FIP和所述引物OsHV-BIP均为单链DNA分子；所述引物OsHV-F3如序列表中序列1所示；所述引物OsHV-B3如序列表中序列2所示；所述引物OsHV-FIP如序列表中序列3所示；所述引物OsHV-BIP如序列表中序列4所示。
2.含有权利要求1所述的引物组合物的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为环介导等温扩增试剂盒。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的功能为如下（a）或（b）：（a）鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型；（b）鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型。
5.权利要求2所述试剂盒的制备方法，包括将所述OsHV-F3、所述OsHV-B3、所述OsHV-FIP和所述OsHV-BIP分别单独包装的步骤。
6.权利要求1所述的引物组合物在制备试剂盒中的应用。
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