CN112730829B

CN112730829B - 一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的胶体金试纸条及其应用

Info

Publication number: CN112730829B
Application number: CN202110068172.2A
Authority: CN
Inventors: 辛鲁生; 于江南; 白昌明; 王崇明
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112730829A

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测牡蛎疱疹病毒(Ostreidherpesvirus1,OsHV‑1)的胶体金试纸条方法及其应用。该胶体金试纸条以OsHV‑1膜分子蛋白p21，如SEQ ID NO.1所示和p25，如SEQ ID NO.2所示作为待检抗原分子。本发明快速检测试纸条特异性强、灵敏度高，待检样品制备简单。本发明胶体金检测试纸成本低，无复杂配套试剂，无需另外配置设备；专业或非专业人士均可短时上手操作。本发明快速检测试纸条方便携带及保存，检测时长短，适合现场快速OsHV‑1诊断，能够满足一线养殖户对OsHV‑1诊断的需求，具有广阔的市场应用场景。

Description

一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的胶体金试纸条及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测牡蛎疱疹病毒(Ostreidherpesvirus1 ,OsHV-1)的胶体金试纸条方法及其应用。

背景技术

国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV）2014年发布的病毒分类报告中，将双壳贝类牡蛎中发现的疱疹病毒样颗粒正式命名为牡蛎疱疹病毒（Ostreid Herpesvirus 1, OsHV-1），隶属疱疹病毒目（Herpesvirales），软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae）。19世纪70年代我国山东地区养殖扇贝大规模死亡与此类病毒感染直接相关，据法国海洋开发研究院报道，2008 年法国境内牡蛎养殖业因 OsHV-1 感染遭遇了毁灭性危机。法国科学家奎昆和米塔等率领团队，阐明了困扰牡蛎养殖产业几十余年夏季牡蛎死亡综合征正是由此类病毒感染诱发细菌二次感染造成。近些年贝类流行病学调查研究表明，我国蚶科养殖贝类正频繁遭受此类病毒侵袭，导致蚶科养殖群体大规模死亡。建立现场准确、快速的检测方法可有效监控此类病毒的流行情况，有效提示养殖户尽快采取应对措施，减少因此类病毒感染带来的经济损失。

目前对于OsHV-1的检测，均基于对病毒核酸水平的检测。利用C2/C6（5’CTCTTTACCATGAAGATACCCACC3’/5’ GTGCACGGCTTACCATTTTT 3’）引物进行普通PCR扩增检测或通过该引物对制备探针进行原位杂交检测；利用BF/B4（5’GTCGCATCTTTGGATTTAACAA 3’/5’ ACTGGGATCCGACTGACAAC 3’）引物进行荧光定量PCR检测。现有基于核酸水平检测方法灵敏度虽高，但假阳性率也高，并且对操作水平要求高，需要配套至少恒温水浴或金属浴设备，检测周期较长，现有方法均无法实现现场快速检测的目的，即便后期潜在待开发的基于LAMP等恒温扩增方法，同样存在假阳性率高，繁琐的核酸样品制备流程等问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的主要目的在于提供一种现场方便、快捷、准确的检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1胶体金试纸条。

本发明还提供了一种上述胶体金试纸条的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条以OsHV-1膜分子蛋白p21，如SEQ ID NO.1所示和p25，如SEQ ID NO.2所示作为待检抗原分子。

本发明制备的胶体金试纸条包括底板和吸附层；所述吸附层从加样端开始依次为样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。其中，样品垫及胶体金标记垫由玻璃纤维棉制成；胶体金标记垫上吸附有胶体金标记的抗OsHV-1膜分子蛋白 p21和 p25蛋白的混合多克隆抗体mPcAb；硝酸纤维素膜上设有质控线C，以及检测线T；吸水垫由吸水滤纸制成。

进一步的，所述OsHV-1膜分子蛋白 p21和 p25蛋白的混合多克隆抗体mPcAb具体制备方法如下：

（1）分别原核表达蛋白序列如SEQ ID NO.1所示的p21重组蛋白，及蛋白序列如SEQID NO.2所示的p25重组蛋白，经Ni离子柱和分子筛进行纯化；

（2）取上述重组p21和p25蛋白分别进行动物免疫；

（3）利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得p21和p25各自对应的多克隆抗体IgG，p25与p21蛋白对应的抗体等体混合后做为混合多克隆抗体mPcAb。

步骤（2）中，所述动物免疫时每只兔的免疫剂量为800μg重组蛋白，免疫次数5次。

本发明制备的多克隆抗体IgG的ELISA效价为1:10³~1:10⁶。

进一步的，所述质控线C含有羊抗或鼠抗兔IgG抗体；所述检测线T含有抗OsHV-1p21和p25蛋白的混合多克隆抗体mPcAb。

本发明还提供了一种上述胶体金试纸条在检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1中的应用。

本发明制备的胶体金检试纸条的使用方法包括如下步骤：

（1）采集待检贝类外套膜样品，加入组织裂解液研磨或捣碎组织，得到待检溶液；

（2）将待检溶液滴入OsHV-1快速胶体金检测试纸条样品垫处，水平放置3~5min观察结果；

（3）若硝酸纤维素膜处质控线C和检测线T显现两条红棕色条带，表示待检样品中含有OsHV-1 p21蛋白或p25蛋白；若仅质控线C显现一条红棕色条带，表示待检样品中未检出OsHV-1 p21和p25蛋白抗原；若检测试纸条未显现任何条带表明检测操作不当或试纸条失效。

进一步的，所述组织裂解液包括0.1M Tris-HCl，0.5% Tween20，1.5% TritonX-100，0.03% NaN₃。

本发明所使用的p21和p25分子在OsHV-1侵染宿主细胞时发挥重要作用，是病毒结构分子，在病毒感染后期表达量颇高。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1、本发明快速检测试纸条以抗体夹心法为依托，优选兔抗OsHV-1 p21蛋白和p25蛋白特异性多克隆抗体作为胶体金标记抗体及制备检测线抗体，特异性强、灵敏度高。

2、本发明待检样品制备简单，只需配合组织裂解液破碎组织即可，无需繁琐的核酸抽提过程。

3、本发明胶体金检测试纸成本低，无复杂配套试剂，无需另外配置设备；专业或非专业人士均可短时上手操作。

4、本发明快速检测试纸条方便携带及保存，检测时长短，适合现场快速OsHV-1诊断，能够满足一线养殖户对OsHV-1诊断的需求，具有广阔的市场应用场景。

附图说明

图1为重组菌表达的p21蛋白SDS-PAGE电泳图；

图中，M为Marker；1为p21纯化后蛋白；2为p21超声离心后上清；3为p21超声离心后沉淀；

图2为重组菌表达的p25蛋白SDS-PAGE电泳图；

图中，M为Marker；1为p25纯化后蛋白；2为p25超声离心后上清；3为p25超声离心后沉淀；

图3为快速检测胶体金试纸条结构示意图；

图中，1为底板（支撑板），2为样品垫，3为胶体金标记垫，4为检测膜，5为吸水垫，6为检测线T，7为质控线C。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

实施例1：制备OsHV-1快速检测试纸条

1. p21及p25蛋白的原核表达及纯化

1）依据GenBank公布的France 2013毒株序列（GenBank：NC_005881.2），以pUC57质粒为框架，由上海生工生物工程有限公司分别合成含OsHV-1 p21、p25基因的重组载体，并分别命名为pUC57-p21、pUC57-p25；

2）以上述合成重组载体pUC57-p21、pUC57-p25为模板，根据模板基因序列设计含有多克隆位点的引物对扩增基因p21和p25，特异性引物对如下：

P21：

p21F 5’GGATCCATGACTTTAGCTGCTAAGTT3’ （SEQ ID NO.3）

p21R 5’GCGGCCGCACTAATGTAAATATACCCTTC3’ （SEQ ID NO.4）

P25：

p25F 5’GAATTCATGGCAACAGACCAACAAGA3’ （SEQ ID NO.5）

p21R 5’GCGGCCGCATTACTTAAAGAGGTCTTCAT3’ （SEQ ID NO.6）

3）扩增产物连接T载体，测序验证。然后酶切连接至原核表达载体pET30a载体，构建原核表达载体pET30a-p21和pET30a-p25；

4）将原核表达载体pET30a-p21和pET30a-p25分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得表达菌株BL21- pET30a-p21和BL21-pET30a-p25；

5）利用大肠杆菌原核表达系统分别表达纯化OsHV-1 p21和p25蛋白，具体步骤如下：

将过夜培养重组菌按1:50体积比转接至新鲜LB培养基中，继续培养至细菌生长对数期OD₆₀₀= 0.4~0.6；加入终浓度为0.8 mmol/L的异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，37℃，200 r/min诱导表达12 h以上；4℃，5000g离心收获表达菌；将沉淀菌体按培养体积的1/15加入PBS缓冲液重悬，超声破碎后离心收集上清和沉淀；经Ni离子柱变性纯化蛋白后并复性，过分子筛进一步纯化、去除盐离子；收获p21和p25蛋白作为免疫抗原和包被抗原，SDS-PAGE电泳图分别如图1、图2所示，-20℃保存备用。

2.p21和p25多克隆抗体制备

1）动物免疫

新西兰大白兔通过背腹部皮下多点注射的方法免疫。首先，用弗氏完全佐剂分别与纯化的p21和p25蛋白等体积混合乳化，每只兔免疫剂量为800 μg蛋白；在首次免疫三周后分别用弗氏不完全佐剂与纯化的两蛋白等体混合乳化，利用相同剂量蛋白加强免疫4次，间隔周期二周；在最后一次免疫后7天，耳缘静脉采血，ELISA检测血清效价，结果显示兔抗血清效价在1:10³到1:10⁷之间。

2）抗体血清大量采集及多克隆抗体纯化

新西兰大白兔采用颈动脉插管取血。4℃静置过夜，3000 g离心收集抗体血清；采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体，ELISA检测纯化后多克隆抗体效价，结果显示纯化后多克隆效价可达1:10⁶左右，-80℃保存备用。

3. 胶体金标记抗体的制备

1）胶体金的制备：100mL超纯水加入 1 mL 1%（w/v）氯金酸溶液煮沸；在搅拌状态下迅速加入1.8 mL 2% （w/v）柠檬酸钠溶液，溶液颜色变为紫红色后，继续煮沸约10 min；待溶液冷却至室温，补水至原体积，4℃避光保存备用。

2）最适标记蛋白浓度测定：首先利用0.2 M K₂CO₃调节胶体金溶液pH值，调节至8.5-9.0，静置10~20 min；取待标记的多克隆抗体，在微孔板中以25 μL 超纯水 2倍梯度稀释待标记多克隆抗体；各孔加入125 μL 胶体金溶液，室温静置10~20 min；加入125 μL 1mol/L 氯化钠溶液；各孔颜色随蛋白浓度的降低而由红色变为蓝色。以颜色未变蓝的多克隆抗体稀释度为胶体金最适标记浓度。经测定结果分析多克隆抗体最佳标记浓度为 10 μg/mL。

3）多克隆抗体的胶体金标记：取2 mL 最适蛋白浓度的待标记多克隆抗体，加入10mL 胶体金溶液（pH 8.5~9.0），迅速混匀，室温作用20~30 min；加入1/10体积 10%（w/v，PBS, pH 7.4）牛血清白蛋白BSA，迅速混匀，室温作用1 h；4℃，12000 r/min离心30 min，小心移去上清；沉淀用 1 mL 复性液（0.1 M Tris-HCl，0.5% （w/v）Casein，0.05%（w/v）NaN₃）

）重悬，调整胶体金标记抗体至0.2 mg/mL，4℃避光保存备用。

4. 检测膜的制备

用包被液（0.05M PBS（pH7.0-7.4），3% 海藻糖， 0.05% NaN3）将等体混合的抗p21和p25蛋白多克隆抗体mPcAb浓度调整至2.0 mg/mL，平行相同条件处理羊抗兔IgG抗体。利用喷点仪器将mPcAb和羊抗兔IgG抗体喷点于硝酸纤维素膜中央，形成检测线T和质控线C印迹，间隔5 mm；将检测膜烘干后，室温保存备用。

5.胶体金标记垫的制备

按照每毫升溶液铺10cm²的量将获得的金标抗体混合液喷涂于金标抗体结合垫上。烘干后置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

6.样品垫及吸水垫的制备

用含0 .1 mol/L Tris-HCl，0 .2% Tween 20（v/v）和 0 .1%（w/v）NaN3的TBS（pH7 .2）溶液浸泡玻璃纤维棉；烘干制得样品垫，加干燥剂室温密闭保存。选用吸水滤纸做为吸水垫。

7.检测试纸条的组装

先将胶体金标记垫（下）和样品垫（上）依次粘贴于底板（支撑板）样品端，各层间重叠1 mm～2 mm，将检测膜粘贴于支撑板中央，最后，将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，与检测膜重叠1 mm～2 mm。试纸条结构如图所示：

试纸条包括底板（支撑板）1和固定在底板上的吸附层，吸附层从样品端依次为样品垫2、胶体金标记垫3、检测膜4和吸水垫5，检测膜上设有羊抗兔IgG抗体印制的质控线7和mPcAb印制的检测线6。

实施例2：利用OsHV-1快速检测试纸条检测OsHV-1

1.检测样品溶液的制备

采集待检贝类外套膜组织，加入适量组织裂解液进行研磨破碎。

2.样品检测

将待检测样品溶液滴入检测试纸条样品垫上，水平放置3~5 min观察结果。

3.检测结果判定

检测试纸条检测垫出现两条棕红色条带（即检测线与质控线均显色），表示待检样品中含有OsHV-1抗原；仅显现一条棕红色条带（质控线）为阴性，表示待检样品未检测出OsHV-1 p21蛋白或p25蛋白；检测试纸条未显现任何条带表明检测操作不当或检测试纸条失效。

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的胶体金试纸条及其应用

<160>6

<210>1

<211>221

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Met Thr Leu Ala Ala Lys Leu Ile Val Leu Val Tyr Val Ala Leu Cys

1 5 10 15

Phe Val Asn Glu Ser Thr Ser Gln Asp His Ser Asn Ile Tyr His Glu

20 25 30

Thr Leu Thr Ser Leu His His Lys Gly Glu Phe His Val Lys Gly Leu

35 40 45

Phe Gln Thr Pro Val Gln Tyr Ala Gly Glu Glu Thr Val Leu Asp Leu

50 55 60

Tyr Val Lys Lys Asn Ser Gly Gly Asp Val Lys Ala Val Tyr Cys Leu

65 70 75 80

Gly Asn Lys Arg Ser Ile Met Asn Gln Phe Thr Asp Thr Gly Thr Thr

85 90 95

Thr Asp Gly Tyr Asp Leu Trp Arg Val Lys Ile Glu Ser Thr Pro Glu

100 105 110

His Ile Ser Arg Met Ile Ser His Gly Pro Ile Ala Cys Asn Leu Ile

115 120 125

Trp Glu Lys Val Ile Thr Pro Ala Lys Gly Asn Val Ala Glu Ile Lys

130 135 140

Gly Leu Asp Leu Val Asn Phe Asn Val Asn Phe Pro Arg Gln Ser Thr

145 150 155 160

Asp His Val Val Ser Arg Pro Ser Thr Asn Ser Gln Thr Val Asp Lys

165 170 175

Leu Leu Asn Asp Thr Leu Ala Lys Ala Arg Gly Val Pro Met Ser Val

180 185 190

Ser Val Ile Ser Gly Ile Cys Ala Ile Ile Leu Val Ile Phe Pro Ile

195 200 205

Phe Ile Thr Ile Ala Asn Leu Arg Arg Val Tyr Leu His

210 215 220

<210>2

<211>188

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Met Ala Thr Asp Gln Gln Asp Leu Asp Ile Ile Ser Ser Thr Ala Glu

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Cys Asp Phe Trp Glu Thr Arg Ser Gly Gly Val Thr

20 25 30

Thr Ile Thr Ile Thr Arg Ile Asn Arg Asp Ala Ile Val Leu Leu Ala

35 40 45

Gly Val Cys Pro Gly Glu Ser Phe Ser Val Ser Tyr Asn Lys Glu Lys

50 55 60

Ile Leu Val Asn Ser Tyr Pro Phe Asn Ile Asn Asn Val Asp Val Val

65 70 75 80

Gly Gly Thr Thr Asp Ile Asn Asp Phe Asn Ser Lys Met Lys Ser Leu

85 90 95

Tyr Leu Pro Val Asn Gly Met Thr Val Leu Met Leu Thr Glu Gly Arg

100 105 110

Ile Asn Asn Pro Glu Ile Ala Val Val Thr Glu Asp Gly Asn Leu Glu

115 120 125

Val Val Gly Ser Lys Lys Lys Thr Leu Val Lys Leu Leu Leu Leu Phe

130 135 140

Leu Ser Leu Met Val Val Ile Val Gly Val Trp Trp Lys Tyr Phe Ser

145 150 155 160

Thr Ser Glu Leu Ser Ala Ser Ala Leu Phe Asp Thr Val Gly Gln Ser

165 170 175

Val Lys Ser Lys Gly Asn Tyr Glu Asp Leu Phe Lys

180 185

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

GGATC CATGA CTTTA GCTGC TAAGT T 26

<210>4

<211>29

<212> DNA

<213>人工合成

<400>4

GCGGC CGCAC TAATG TAAAT ATACC CTTC 29

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

GAATT CATGG CAACA GACCA ACAAG A 26

<210>6

<211>29

<212> DNA

<213>人工合成

<400>6

GCGGC CGCAT TACTT AAAGA GGTCT TCAT 29

Claims

1.一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条以OsHV-1膜分子蛋白p21，如SEQ ID NO.1所示和p25，如SEQ ID NO.2所示作为待检抗原分子；

所述胶体金试纸条包括底板和吸附层；所述吸附层从加样端开始依次为样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；其中，样品垫及胶体金标记垫由玻璃纤维棉制成；胶体金标记垫上吸附有胶体金标记的抗OsHV-1膜分子蛋白 p21和 p25蛋白的混合多克隆抗体mPcAb；硝酸纤维素膜上设有质控线C，以及检测线T；吸水垫由吸水滤纸制成；

所述OsHV-1膜分子蛋白 p21和 p25蛋白的混合多克隆抗体mPcAb具体制备方法如下：

（1）分别原核表达蛋白序列如SEQ ID NO.1所示的p21重组蛋白，及蛋白序列如SEQ IDNO.2所示的p25重组蛋白，经Ni离子柱和分子筛进行纯化；

（2）取上述重组p21和p25蛋白分别进行动物免疫；

（3）利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得p21和p25各自对应的多克隆抗体IgG，p25与p21蛋白对应的抗体等体积混合后做为混合多克隆抗体mPcAb。

2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述动物免疫时每只兔的免疫剂量为800μg重组蛋白，免疫次数5次。

3.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述多克隆抗体IgG的ELISA效价为1:10³~1:10⁶。

4.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述质控线C含有羊抗或鼠抗兔IgG抗体；所述检测线T含有抗OsHV-1 p21和p25蛋白的混合多克隆抗体mPcAb。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的胶体金试纸条在非诊断目的检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述胶体金试纸条的使用方法包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述组织裂解液包括0.1M Tris-HCl，0.5%Tween20，1.5% TritonX-100，0.03% NaN₃。