CN111849922B - 一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明是属于临床免疫学技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体及其应用。本发明通过免疫有效截短后的非洲猪瘟病毒蛋白p54，以及系统地筛选杂交瘤技术，最终获得了单抗克隆抗体4‑4C。所获单克隆抗体能够与非洲猪瘟全病毒反应，达到单克隆抗体基本要求；此外，该单克隆抗体的特异性好，与非洲猪瘟病毒其他蛋白之间无交叉反应；再者，该单克隆抗体通过Elisa检测后，其效价高达1600000；最后该单克隆抗体具有阻断效果，所建立的阻断Elisa检测方法，与OIE推荐使用的西班牙检测试剂盒检测效果相当，且缩短了检测时间，具有为猪场检测非洲猪瘟抗体水平的能力。

Description

一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明是属于临床免疫学技术领域，涉及非洲猪瘟病毒的检测与鉴定技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体，还涉及一种分泌非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，同时还涉及截短蛋白p54制备的单克隆抗体在制备检测非洲猪瘟病毒试剂盒中的应用。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、高度接触性的动物传染病，具有发病率高，病程短，死亡率高等特点。非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒科，双链DNA病毒，其基因组大，170-190bp，且基因多变，基因组两端各有一个多变区，基因型多达24个，编码150-200个蛋白。自2018年我国出现非洲猪瘟以来，给我国养猪行业带来巨大经济损失，同时也影响生猪产业相关的国际贸易。虽然目前非洲猪瘟疫情已经慢慢得到控制，但是并没有有效疫苗能预防非洲猪瘟的爆发，因此非洲猪瘟的防控以及检测至关重要。

目前主要的血清学检测方法为酶联免疫吸附试验(Elisa)。Elisa检测法主要有应用于抗体水平检测，具有操作简便，特异性好，灵敏度高等特点。并且该方法适合于大批量样品的检测，OIE亦将Elisa法作为诊断非洲猪瘟病毒的首选血清学方法。国内并没有国家批准的ASFV抗体检测试剂盒，OIE推荐使用的是西班牙英吉纳(Ingezim)试剂盒，该试剂盒的包被抗原是非洲猪瘟病毒蛋白p72，利用针对p72蛋白的单克隆抗体建立的阻断Elisa检测方法。Elisa法检测抗体主要为间接Elisa方法和阻断Elisa方法。二者都是将抗原吸附于固相载体，检测抗体。不同的是，间接Elisa法的酶标抗体是二抗，与待检抗体结合，底物降解的量与抗体量相等；阻断Elisa方法的酶标抗体是一抗，与抗原结合，与待测血清抗体具有相同的靶标。阻断ELISA方法由于采用的是蛋白纯度很高的单抗，大大提高了检测的特异性，减少了间接ELISA方法的交叉反应和非特异性反应。由于国外检测试剂盒价格昂贵且耗时长，因此，本发明通过杂交瘤技术获得单克隆抗体，尝试建立阻断Elisa方法，能够替代国外试剂盒，达到能够检测非洲猪瘟病毒抗体水平的效果。

然而在制备单克隆抗体的过程，有诸多问题。首先，免疫原的选择至关重要，免疫原直接影响后续杂交瘤细胞的筛选，继而影响所获得的单克隆抗体的质量。本发明使用的免疫原是通过有效截短后的非洲猪瘟病毒蛋白p54，该免疫原通过westernblot检测后发现其具有免疫学活性，且它表达在上清，是可溶性的优质免疫原。其次，免疫了优质抗原后，在细胞融合以及阳性克隆细胞筛选过程中均有阻碍，例如，尽管细胞融合的成功率高，但所融合成功的细胞并不具备分泌单一抗体的能力；在细胞筛选过程中，部分杂交瘤细胞状态不稳定，在多次亚克隆后，染色体丢失，不能继续分泌单一抗体；在获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞后，通过免疫小鼠，获取腹水，所得腹水效价不高；而有的单抗制备后，由于识别的靶点与待测血清不一致，无法建立阻断Elisa检测方法。

根据以上问题，本发明通过免疫有效截短后的非洲猪瘟病毒蛋白p54，以及系统地筛选杂交瘤技术，最终获得了单抗克隆抗体4-4C。所获单克隆抗体能够与非洲猪瘟全病毒反应，达到单克隆抗体基本要求；此外，该单克隆抗体的特异性好，与非洲猪瘟病毒其他蛋白之间无交叉反应；再者，该单克隆抗体通过Elisa检测后，其效价高达1600000；最后该单克隆抗体具有阻断效果，所建立的阻断Elisa检测方法，与OIE推荐使用的西班牙检测试剂盒检测效果相当，且缩短了检测时间，具有为猪场检测非洲猪瘟抗体水平的能力。

发明内容

本发明提供了一种抗非洲猪瘟病毒p54单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞4-4C分泌得到，该抗体对非洲猪瘟病毒抗体有阻断效果，该杂交瘤细胞已于2020年7月16日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：C2020122，分类命名：杂交瘤细胞株4-4C，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了抗非洲猪瘟病毒p54单克隆抗体的应用，利用本发明的抗体可制备检测非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体试剂盒，为非洲猪瘟的临床抗体检测提供方法。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株4-4C的获得是利用原核表达非洲猪瘟病毒截短p54蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术建立抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞库获得的。该杂交瘤细胞已于2020年7月16日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：C2020122，分类命名：杂交瘤细胞株4-4C，地址：中国武汉武汉大学。

所获得的杂交瘤细胞株4-4C在37℃，5％CO₂的培养箱中以半贴壁的方式生长，用显微镜观察细胞，所呈现的状态为：细胞生长良好，浑圆透亮，呈葡萄串状，并且能稳定的分泌针对p54的单克隆抗体。

对杂交瘤细胞4-4C最高限制代次(F25代)的细胞进行传代稳定性检测，结果每代细胞均能稳定分泌特异性的单克隆抗体，抗体阳性率为100％，说明该杂交瘤细胞具有稳定分泌抗体的能力。

一种抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体的应用，所述的单抗可用于建立非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法，鉴定待测动物样本是否感染非洲猪瘟病毒或者待检血清中是否含有非洲猪瘟病毒抗体。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明所用的免疫原为截短非洲猪瘟重组蛋白p54(SEQ ID NO.1所示)，该免疫原具有良好的免疫原性，同时，可以建立间接ELISA方法检测非洲猪瘟病毒抗体。

2.本发明从得到的7株分泌抗ASFV单克隆抗体的杂交瘤细胞进行三次亚克隆，最终筛选出一株稳定分泌抗体且生物特性好的杂交瘤细胞，用其制备的腹水纯化后进行Elisa检测，结果显示Elisa效价高达1.6×10⁶。

3.本发明得到的4-4C单抗，通过Elisa检测以及western blot方法验证后发现，所获单抗具有与非洲猪瘟病毒反应的能力。

4.本发明得到的4-4C单抗，可用于制备非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒可检测血清样本中的非洲猪瘟抗体，为养猪行业对非洲猪瘟病毒抗体的检测提供检测方法。用该方法检测了大量猪血清，并用公式(1-样品OD值/阴性对照OD值)来计算血清阻断率，最终确定：猪血清的阻断率大于或等于0.5判为阳性，小于0.5判为阴性。本方法与OIE推荐使用的西班牙检测试剂盒有99％以上的符合率，但相比而言，本发明建立的方法检测时间为70分钟，而西班牙检测试剂盒检测时间为105分钟，相比而言，缩短了试验时间，操作步骤更简单。

附图说明

图1为单抗4-4C纯化后SDS-PAGE图

图2为单抗4-4C与ASFV反应western blot图

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

制备抗非洲猪瘟病毒p54单克隆抗体以及获得分泌的杂交瘤细胞株：

本发明的抗原为非洲猪瘟病毒截短蛋白p54(SEQ ID NO.1所示)，利用该蛋白作为抗原包被，制备的间接ELISA检测试剂盒，能够准确检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体，同时与OIE推荐的西班牙检测试剂盒相比，该抗原建立的间接ELISA试剂盒的特异性与其相当，敏感性优于西班牙检测试剂盒。

1、动物免疫

取非洲猪瘟病毒截短蛋白p54(SEQ ID NO.1所示)200μg与同等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器乳化后用注射器于6-8周龄BALB/c小鼠背部进行多点注射，14天后进行二免。二免：用弗氏不完全佐剂佐剂与重组蛋白进行乳化，用注射器于小鼠背部进行多点注射；14天后进行三免。三免：步骤同二免。在进行细胞融合前3天，直接取200μg重组蛋白注射于小鼠腹腔中，即免疫完成。

2、细胞融合

2.1SP2/0细胞的制备：从液氮罐中取出骨髓瘤细胞，37℃下复苏，将融化后的细胞液体转至EP管中，1000r/min，离心10分钟后弃去上清，用完全培养基重悬培养基后，转至T75细胞瓶中培养，待细胞长满后备用。

2.2饲养层细胞的制备：取一只成熟健康的SPF小鼠，摘眼球采血作为阴性血清，颈椎脱臼处死；置75％酒精中10min，固定四肢，剪开皮肤使腹膜暴露，用酒精棉球擦拭腹膜；用l0 mL注射器，12#针头，吸取10mL HAT培养基小心注射到腹腔，持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入己准备好的容器中，计数并稀释后加入96孔细胞培养板中。

2.3免疫脾脏细胞的制备：取加强免疫后的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清，颈椎脱臼致死小鼠，置75％酒精中10min，腹部朝上固定在超净台内的解剖板；无菌打开腹腔取出脾脏，用匀浆器将慢慢研碎，用基础培养基重悬，经细胞筛过滤后去除多余脂肪组织，1000r/min，离心10分钟后弃去上清，用HAT培养基重悬后备用。

2.4细胞融合：将上述制备好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1:10比例在50mL离心管中混匀，1500r/min离心10min，之后倒空上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的融合用PEG 0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌。继续搅拌30sec后静置1min，然后慢慢加入37℃预温的1640基本培养基10mL，具体方法为：第一分钟逐滴滴入1mL。第二分钟加1mL，第3min～4min加3mL，5min后加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后缓慢加入30mL1640基本培养基，1000r/min离心5min，去上清于37℃放置5min～8min。用HAT培养基悬浮后，均匀滴加入5块96孔细胞培养板中，置于37℃,5％CO2培养箱中培养。融合后于5d后补加1滴HAT培养基，8-10d时吸去96孔板100μl培养基换HT培养基100μl。待融合细胞集落长至培养孔1/4时，即可进行抗体检测。

3、筛选阳性克隆细胞

利用间接ELISA检测方法进行筛选：包被重组蛋白p54，置于4℃过夜，用PBST洗涤3次，用封闭液进行封闭，将包被板置于37℃温箱，封闭2h，用PBST洗涤3次，随后将杂交瘤细胞上清置于包被板中，同时，设置阴、阳性对照，37℃温箱孵育30min，用PBST洗涤5次，加上工作浓度1:5000的羊抗鼠HRP-lgG，置于37℃温箱，孵育30min，再用PBST洗涤5次，加入TMB避光显色10min，再加入氢氟酸终止反应，最后读取OD_630nm。并分析结果。

4、有限稀释法获得单一阳性孔

将上述步骤中OD值大于2.0的7个阳性孔进行亚克隆，步骤为：首先在96孔板中加入饲养层细胞，使杂交瘤细胞有良好的生长环境，其次，待亚克隆孔用含20％血清的HT培养基重悬，将悬液倍比稀释，在显微镜下计数，选择视野下约有100个细胞的孔，将该孔的细胞重悬至10mLHT培养基中，再将该培养基按每孔100μl加到96孔板中，最后将细胞板置于37℃含5％CO2温箱中培养7-10天。7-10天后再次用Elisa方法检测，选择阳性孔再次进行亚克隆。步骤同上，经过三次亚克隆后，得到1株持续检测为阳性的杂交瘤细胞，而另外6株杂交瘤细胞株在三次亚克隆中，染色体丢失，导致抗体分泌不稳定，以及在扩大培养后，抗体分泌减少，Elisa检测结果为阴性，故而舍弃。最终，经3次亚克隆共得到1株阳性的杂交瘤细胞系，该细胞系能够持续分泌特异性的单克隆抗体且能够稳定传代，将其命名为4-4C。该杂交瘤细胞第3代已于2020年7月16日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：C2020122，分类命名：杂交瘤细胞株4-4C，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：腹水的制备及单抗特性鉴定

1、腹水制备

取8周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.5mL/只；7-10d后腹腔注射用基础培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞4-4C，1.2×10⁶个/只；观察小鼠状态。7-14d后，小鼠腹部呈明显隆起，用16#针头从腹腔采集腹水，1500r/min，离心10min，去除脂肪组织，吸取上清，-20℃保存备用。

2、单抗特性鉴定

2.1效价测定

包被重组蛋白p54，置于4℃过夜，用PBST洗涤3次，用封闭液进行封闭，将包被板置于37℃温箱，孵育2h，用PBST洗涤3次，随后将收集的腹水按1:100比例按2倍稀释至1:12800，置于37℃温箱，孵育30min，用PBST洗涤5次，加上工作浓度1:5000的羊抗鼠HRP-lgG，置于37℃，孵育30min，再用PBST洗涤5次，加入TMB避光显色10min，再加入氢氟酸终止反应，最后读取OD_630nm。结果显示，所收集的腹水ELISA鉴定效价为1：1638400。

2.2亚类鉴定

根据北京博奥龙公司的抗体亚类鉴定试剂盒进行单抗亚类鉴定，根据其说明书进行操作，结果显示，单克隆抗体4-4C的亚类为lgG1。

2.3特异性鉴定

分别用非洲猪瘟病毒蛋白p30、p72、p54包被过夜，取4-4C杂交瘤细胞上清作为一抗，HRP标记羊抗鼠的lgG作为二抗，TMB进行显色，氢氟酸终止，读取OD_630nm，并分析结果。结果显示，除p54蛋白包被板判定结果为阳性外，其余蛋白包被板结果皆为阴性，表明，所获得的4-4C杂交瘤细胞上清与蛋白p30、p72均无交叉，是为针对非洲猪瘟病毒蛋白p54特异性的单抗。

2.4稳定性鉴定

冻存：将生长旺盛、形态良好的杂交瘤细胞4-4C转移到1.5mL离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，用细胞冻存液(90％血清+10％DMSO)将细胞个数调整到5×10⁶个/ml左右，加入到2.0ml细胞冻存管中，做好标记，然后将冻存管放入装有异丙醇的冻存盒中，于-80℃低温冰箱中过夜。从冻存盒中取出放入液氮中保存，并做好记录。

复苏：一个月后从液氮罐中取出杂交瘤细胞，迅速放入37℃水浴锅中，不停摇动使其迅速融化，移至超净工作台，无菌开启冻存管，将细胞悬液转移到盛有1.5mLEP管中，1000r/min离心10min，弃上清，再用完全培养基重悬细胞沉淀，移入24孔细胞培养板，置37℃含5％CO2培养箱中培养，待细胞状态稳定后，再次用Elisa法检测细胞上清。待证实检测结果为阳性后，将杂交瘤细胞进行传代，直至最高限制代次(F25代)，每次传代前均用Elisa法检测细胞上清，结果显示，每代细胞均能稳定分泌特异性的单克隆抗体，抗体阳性率为100％，说明该杂交瘤细胞具有稳定分泌抗体的能力。

实施例3：鉴定单克隆抗体与全病毒抗原的反应性

3.1ELISA法检测ASFV与所获腹水的反应原性

将纯化后(纯化后病毒浓度为0.8mg/mL)的非洲猪瘟全病毒按1：800进行稀释，置于4℃包被过夜，用PBST洗涤3次，用封闭液封闭包被板，置于37℃温箱，孵育2h。将实施例2获得的腹水按1:100开始进行2倍稀释直至1:12800，同时设置阴、阳性对照，每孔100μl，置于37℃温箱，孵育30min，用PBST洗涤5次，加入工作浓度为1:5000的羊抗鼠HRP-lgG，置于37℃温箱，孵育30min，用PBST洗涤5次，加入TMB避光显色10min，氢氟酸终止反应，读取OD_630nm。该方法成立的条件为：试验成立的条件是：阴性对照孔OD_630nm值应<0.2，阳性对照孔OD_630nm值应>0.3，待测孔的OD_630nm值应>0.3时为阳性。结果显示，将实施例2获得的腹水稀释至1:6400时，仍是阳性，表明腹水中含有的单克隆抗体具有良好的与全病毒抗原反应原性。(注：下表中，P:阳性对照/阳性；N:阴性对照/阴性)

3.2WESTERN BLOT法检测ASFV与所获单克隆抗体的反应原性

取10μl灭活后的非洲猪瘟全病毒抗原，向其中加入2μl的5×loading，于沸水中煮沸10min，进行SDS-PAGE，电泳完成后取下蛋白胶进行转膜，随后将膜置于封闭液中封闭1h，再用纯化后的单克隆抗体作为一抗进行孵育，室温下震荡孵育2h，之后用TBST洗涤5次，用工作浓度为1:5000的羊抗鼠HRP-lgG进行孵育，室温下震荡孵育1h，再用TBST洗涤5次，最后在化学发光仪中进行显膜。结果显示，NC膜上单一条带的表明单克隆抗体能与全病毒抗原反应并且特异性较好。

实施例4：抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体的纯化

将实施例2制备的单抗腹水采用辛酸-硫酸铵法进行纯化，方法如下：取澄清腹水，向其中添加0.06mol/L醋酸缓冲液，用HCL调至PH4.5，随后加入正辛酸，室温下于搅拌器中孵育30分钟，而后在4℃静置2小时，取出后，于4℃下，12000r/min，离心30min。离心后取上清过滤，加入十分之一体积的PBS，用NaOH调至PH7.4。再加入饱和硫酸铵至45％饱和度，加完后于搅拌器中孵育30分钟，而后在4℃静置2小时，取出后，于4℃下，12000r/min，离心30min。离心后，弃去上清，沉淀用PBS重悬，之后置于透析袋中，用50-100倍PBS透析48h后，取出，于4℃下，12000r/min，离心30min，弃去沉淀，收集上清，所得上清即为纯化后的单克隆抗体。采用BCA法测定单抗浓度，所得结果为，纯化后的单抗4-4C浓度为3.4mg/mL(纯化后的每毫升单抗的含量是3.4mg)。之后将纯化后的单抗按1：100、1：200、1：400依次倍比稀释至1:3276800，再用ELISA试验方法检测，每孔加入稀释好的纯化后单抗4-4C，每孔100μl，洗涤后加入工作浓度为1:5000的羊抗鼠HRP-lgG，再次洗涤后加入显色液，避光反应10分钟后，加入终止液，读取OD_630nm。结果显示，当纯化后的4-4C抗体稀释到1：1600000倍时仍为阳性，表明该抗体具有效价高的特点。

实施例5：抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

称取10mg HRP溶解于2mL超纯水中，呈棕红色，加入0.2mL现配的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌30分钟，此时液体呈现棕黄色。而后加入实例4中纯化好的浓度为3.4mg/mL的4-4C单抗3mL。将液体置于透析袋中，用PH7.4的PBS于4℃中透析过夜。之后吸出透析袋中的液体，向其中加入新配的5mg/mL的NaBH4 0.1mL，混匀后放置4℃，2小时。之后加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃下作用30分钟，30分钟后于4℃，12000r/min，离心15分钟，弃去上清，沉淀用PBS重悬，重悬后将液体转入透析袋中，4℃透析过夜。吸出透析袋中的酶标物，4℃，12000r/min，离心10分钟，取上清，分装后保存于-20℃。按方阵法确定酶标抗体的稀释倍数，其稀释倍数为1：22000。

实施例6：一种抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体在建立的非洲猪瘟病毒阻断ELISA方法应用6.1酶标板的制备

通过方阵法确定抗原(非洲猪瘟病毒截短p54蛋白)的包被浓度为1:5000，在2-8℃包被14小时。弃去包被液，加入封闭液后置于37℃温箱，封闭2小时。弃去封闭液，自然风干后抽真空包装成成品试剂盒酶标板。

6.2试剂盒其他组分的配制

包被液：碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g，加注射用水至1000ml，调pH值至9.6，置2～8℃保存备用。

封闭液：牛血清白蛋白(BSA)5.0g、蔗糖10.0g、氯化钠(NaCl)8.5g、Tween-200.5ml、硫柳汞钠0.10g，加注射用水至1000ml，置2～8℃保存备用。

二抗保护剂：取氯化钾(KCl)0.2g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.27g、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO ₄·12H₂O)1.42g、牛血清白蛋白(BSA)5.0g、硫柳汞钠0.1g、吐温20(Tween-20)0.5ml、蔗糖2.0g，加注射用水至1000ml，置2～8℃保存备用。

样品稀释液：氯化钠(NaCl)8.0g、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g、氯化钾(KCl)0.2g、硫柳汞钠0.1g，加注射用水至1000ml。

20倍浓缩洗涤液：吐温20(Tween-20)10.0ml，氯化钠(NaCl)160.0g、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)58.0g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)4.0g、氯化钾(KCl)4.0g，加注射用水至1000ml。

底物显色液：柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)配制0.1mol/L柠檬酸盐(C₆H₈O₇·H₂O)和0.2mol/L磷酸盐(Na₂HPO₄·12H₂O)按6.1ml:6.4ml混合配制而成。TMB贮存液配制TMB溶于二甲基亚砜(DMSO)，终浓度为32mmol/L。取TMB贮存液用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液作1:20倍稀释，再加入终浓度7.5mmol/L聚乙二醇(PEG)、100mmol/L葡萄糖和2.94mmol/L H₂O₂，完全溶解后，避光保存，置2～8℃保存备用。

终止液：2.5ml氢氟酸(HF)加到900ml去离子水中，定容至1000ml，分装，10ml/瓶，2～8℃保存备用。

阳性对照：选用7～8周龄健康阴性猪，将截短p54重组蛋白与佐剂1:1混合，颈部肌肉注射1ml/每头(蛋白含量1.0mg)，连续免疫2次，每次间隔14日。第2次免疫14天后开始采血，待血液凝固后4000r/min，离心10分钟，收集上清，即为阳性对照。

阴性对照：选用7～8周龄健康阴性猪，采集血液，待血液凝固后4000r/min，离心10分钟，收集上清，即为阴性对照。

6.3具体使用步骤如下：

样品处理：取猪全血，待血液凝固后4000r/min，离心10分钟，收集上清。也可采集血液，待凝固后自然析出血清，要求血清清亮，无溶血。

洗涤液配制：使用前，将浓缩的洗涤液从试剂盒中取出，平衡至室温(20～25℃)，并摇动，使沉淀溶解(最好在37℃水浴中加热5～10分钟)，然后用蒸馏水作20倍稀释(例如：每两块板用30ml的20倍浓缩洗涤液加上570ml蒸馏水)，混匀，稀释好的洗涤液在2～8℃可以存放7日。

酶标抗体的制备：将标记好的4-4C-HRP单抗用二抗保护剂按1：22000稀释倍数进行稀释，即获得酶标抗体，每孔100μl。

【操作步骤】

1.取抗原包被板(根据样品多少，可拆开分次使用)，用稀释好的洗涤液洗板1次(200μl/孔)后拍干。在抗原包被板中加入50μl样品稀释液，再在每孔加入50μl待检血清好的血清样品，对照血清按同样方法加入到抗原包被板孔中。对照血清各设2孔，待检样品设1孔，轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃下温育30分钟。

2.弃去孔中的液体，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，共计洗涤3次。

3.每孔加酶标抗体100μl，置37℃下温育30分钟。

4.弃去孔中的液体，洗涤5次，方法同步骤2。

5.每孔加入100μl底物显色液，置20～25℃避光显色10分钟。

6.每孔加终止液50μl，混匀后测定结果。

【结果判定】

在酶标仪上测各孔的OD630nm值。试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630nm值应＞0.5，阳性对照孔平均OD630nm值应＜0.5。

S为样品孔OD630nm值，N为阴性对照孔平均OD630nm值，计算样品样品阻断率(1-S/N)值。若阻断率＞50％时判为阳性；若阻断率≤50％时判为阴性。

实施例7：非洲猪瘟病毒单克隆抗体阻断ELISA检测试剂盒与西班牙检测试剂盒的对比

申请人用本发明建立的抗体阻断ELISA检测试剂盒和西班牙检测试剂盒同时检测已知背景猪血清49份，其中，阳性血清有33份，阴性血清为16份。对比两种试剂盒检测结果，计算符合率。结果显示，本发明建立的试剂盒与西班牙检测试剂盒符合率一致，适合在基层大规模检测中推广应用，用时更短，具体结果见下表。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ala Ile Glu Glu Glu Asp Ile Gln Phe Ile

1 5 10 15

Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly

20 25 30

Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ala Gly Lys Pro Val

35 40 45

Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr

50 55 60

Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met Ala Thr Gly Gly Pro Ala

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala His Pro Thr Glu Pro Tyr Thr Thr

85 90 95

Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn

100 105 110

Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu

115 120 125

Claims (3)

1.一种分离的杂交瘤细胞，其保藏编号为：CCTCC NO：C2020122。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞或权利要求2所述的单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒阻断ELISA检测试剂盒中的应用。

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