CN104928302A - 一株通过基因修饰以优化表达后的狂犬病病毒糖蛋白及其单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了经修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该G蛋白基因G3表达得到的经修饰的狂犬病病毒的G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述狂犬病病毒为狂犬病病毒（rabies virus，RV）HEP-Flury株。利用上述修饰的狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白基因G3构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，该单克隆抗体能特异性识别狂犬病病毒糖蛋白和狂犬病病毒，可以应用于间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验，用于检测狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特异性。

Description

一株通过基因修饰以优化表达后的狂犬病病毒糖蛋白及其单克隆抗体和应用

技术领域

本发明属于免疫学和生物技术领域。更具体地，涉及一株通过基因修饰以优化表达后的狂犬病病毒糖蛋白及其单克隆抗体和应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RV)引起的人兽共患的烈性传染病，一旦发病难以医治。准确、及时、快速的诊断是临床治疗的前提，也是免疫监测、流行病学调查的主要手段，还是有效控制狂犬病的关键。狂犬病病毒的糖蛋白(glycoprotein,GP)，即G蛋白，是狂犬病病毒主要的结构蛋白之一，与病毒的感染和免疫有密切关系，是诱导产生中和抗体的主要蛋白，其免疫作用与全病毒疫苗基本相当。GP由524个氨基酸组成，前19个氨基酸构成疏水性信号肽，其膜外区的保守性高，且抗原表位主要集中在膜外区，是制备检测抗体的首选抗原。

G蛋白的表达纯化是抗体制备的前提，合理的基因修饰可以实现蛋白的高效表达。但是对于不同的基因、不同物种来源的同源基因(基因的序列和性质等具有差别)，如何修饰基因，确定修饰位点及修饰数量，致使其与表达菌的偏嗜性匹配，以提高蛋白的表达量；表达过程中怎样进行培养、怎样保证获得蛋白表达需要的溶解氧、怎么样避免污染、加甲醇诱导的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验的方法、蛋白含量以及活性的测定等均有较大的差异，需要形成一个稳定的、完整的技术方案，才能从根本上解决G蛋白的高效表达和成本问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有狂犬病病毒G蛋白表达技术的不足，提供一种经修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3，利用该修饰的狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白基因G3构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，该单克隆抗体能特异性识别狂犬病病毒糖蛋白和狂犬病病毒，可以应用于间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验，用于检测狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特异性。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种通过基因片段进行密码子修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(修饰前的狂犬病病毒的G蛋白基因G3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。

一种经修饰的狂犬病病毒的G蛋白，由上述修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种表达载体，该载体含有上述经修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3片段。

由上述表达载体表达达到的狂犬病病毒G蛋白在制备抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体中的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种抗狂犬病病毒G蛋白的抗体，采用的免疫原是以上述表达载体表达达到的狂犬病病毒G蛋白，即修饰后的狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白中一段经分析挑选得到的抗原表位富集区。

具体地，所述狂犬病病毒为狂犬病病毒HEP-Flury株。另外优选地，所述抗体为单克隆抗体。

一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接ELISA方法，所用抗体是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。

一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的Western-blotting检测方法，所用抗体是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。

一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接免疫荧光检测方法，所用抗体是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。

本发明首先对狂犬病病毒Hep-flury株G蛋白基因进行了合理的修饰改造，然后构建了含有经修饰优化的狂犬病病毒Hep-flury株G蛋白基因的原核表达质粒pET32-G3，在大肠杆菌中表达G3重组蛋白，并以此为基础制备G3单克隆抗体，为G3单克隆抗体在间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验检测狂犬病病毒的应用创造条件。

本发明利用大肠杆菌表达系统，表达出了G3重组蛋白，表达产物的相对分子质量为39kDa，与理论计算值一致；重组蛋白的最佳诱导表达条件：在28℃的条件下，以1.0mmol/L的IPTG终浓度，诱导4h。

本发明G3基因的获得是运用生物学信息软件对狂犬病病毒HEP-Flury株糖蛋白膜外区序列进行分析，选择抗原表位优势区段100～307为氨基酸，依照大肠杆菌密码子偏嗜性，对其氨基酸密码子进行修饰，于5′端和3′端分别引入BamHI及HindⅢ酶切位点，继而PCR扩增，构建克隆载体pMD18T-Simple-G3，再与pET-32a(+)表达载体的BamHI、HindⅢ双酶切反应，回收产物并且连接成功构建pET32-G3重组表达载体，重组质粒DNA序列测定结果证实了含有目的基因。将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，筛选得到的阳性重组子鉴定正确后提取质粒转化BL21感受态细胞进行IPTG诱导表达，诱导表达后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。当基因进行表达后，表达产物为融合有His标签的G融合蛋白，融合蛋白的相对分子质量39kDa。

本发明用纯化的His标签-G3融合蛋白作为抗原，既增加了抗原的免疫原性，又方便筛选。发明中采用纯化His标签-G3融合蛋白作为包被抗原进行筛选，同时设立阴阳性对照，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以正常小鼠的血清为阴性对照，间接ELISA反应条件的确立是经过多次试验优化的结果。此外，在单抗的筛选过程中，始终选用空载体pET32a(+)菌体蛋白与pET32a-M蛋白作为对照抗原，避免了用同种免疫原检测时假阳性的出现，充分保证能够得到目的杂交瘤细胞；而且在筛选方法上，也应用了不同的选择系统，以间接ELISA为主，用Western-blotting与IFA确认，从而确保了单克隆抗体的反应特异性。由于筛选出的上清液为阳性的生长孔内常会有两个以上的杂交瘤细胞集落，有的集落可能不分泌抗体，或分泌的不是所需抗体，所以，要利用克隆培养方法及时将其分开。本发明中，采用了有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆培养。

本发明以纯化的His标签-G3融合蛋白为抗原，免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗狂犬病病毒糖蛋白的单克隆抗体，获得3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株：2-D2、4-H1与9-G4，并成功制得腹水，测定腹水效价均在1:105以上。抗体亚型鉴定结果显示，单抗亚型为IgG1，且轻链为κ链。杂交瘤细胞株连续培养30代以及冻存3个月后复苏，细胞生长良好，杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。经ELISA、Western-blotting与IFA检测，3株单抗具有很好的特异性。

本发明具有以下有益效果：

本发明以RV HEP-Flury株的全长质粒为模板，采用PCR方法扩增获得GP去除信号肽基因的部分(G1)与膜外区基因(G2)。选取膜外区基因中抗原表位富集区基因，对其氨基酸密码子进行修饰并合成其序列(G3)。分别将G1、G2及G3基因片段亚克隆到表达载体pET32a(+)，构建融合表达质粒pET32-G1、pET32-G2及pET32-G3，转化表达宿主菌BL21，并利用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blotting和薄层扫描分析结果显示，表达的蛋白均具有良好的反应原性和特异性，且通过密码子优化后，G3基因片段的表达量比G1、G2基因片段表达量明显提高。对G3重组蛋白大量诱导表达，利用HisTrap FF亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化，使用超滤离心管对纯化的G3重组蛋白进行浓缩和脱盐，获得高纯度的糖蛋白。

本发明以纯化的G3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，建立间接ELISA方法测定血清抗体效价。取血清效价最高的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG 4000的作用下进行细胞融合。用HAT选择培养基对杂交瘤细胞进行培养，利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，重复4次，获得了3株能稳定分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(分别命名为2-D2、4-H1、9-G4)。将阳性杂交瘤细胞注射BALB/c小鼠制备腹水，测定腹水效价在1:105以上。抗体亚型鉴定结果显示，单抗亚型为IgG1，轻链为κ链。杂交瘤细胞株连续培养30代以及冻存3个月后复苏，细胞生长良好，杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blotting检测结果显示，3株单抗的腹水均能特异性识别G3重组蛋白与RV病毒，与犬六联苗(包括犬细小病毒、犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬腺病毒I/II型和犬钩端螺旋体)无交叉反应。

本发明在成功表达GP的去信号肽基因和膜外区基因的基础上，对G基因一段抗原表位富集区基因的稀有密码子序列进行了分析和优化，提高G基因在原核细胞中的表达水平；获得了稳定、特异、高效的单克隆抗体，为狂犬病及狂犬病病毒的相关研究和应用奠定了良好的基础。

附图说明

图1为pET32-G3重组质粒中G3的核苷酸和氨基酸序列。

图2为G3PCR产物凝胶电泳；M：DNA Marker DL2000；1：G1基因片段的PCR扩增产物；2：G2基因片段的PCR扩增产物；3：G3基因片段的双酶切纯化产物；4：PCR阴性对照。

图3为pET32-G3重组质粒构建示意图。

图4为重组质粒pET32-G3的菌液PCR(A)和双酶切鉴定(B)；A中，M：DNA marker DL2000；1-3：pET32-G3的菌液PCR产物；B中，M：DNA markerDL2000；1-3：分别为重组质粒pET32-G3、pET32-G1及pET32-G2双酶切产物。

图5为pET32-G3表达产物的SDS-PAGE分析；M：蛋白质相对分子质量标准；1：含pET32a(+)空载体的BL21表达菌；2-3分别为：经IPTG诱导的pET32-G2、pET32-G1、pET32-G3重组子。

图6为pET32-G3表达产物的Western-blotting分析；A为G1、G2及G3基因片段表达的蛋白被6×His单克隆抗体识别，M：蛋白质相对分子质量标准；1-3分别为：G1、G2及G3基因的蛋白表达；4：含pET32a(+)空载体的BL21表达菌；B为G1、G2及G3基因片段表达的蛋白被狂犬病病毒阳性血清识别，M：蛋白质相对分子质量标准；1：含pET32a(+)空载体的BL21表达菌；2-4分别为：G3、G2及G1基因的蛋白表达。

图7为不同诱导温度对G3基因片段表达产物的表达量的影响；M：蛋白质相对分子质量标准；1-3：pET32-G1重组子在16℃、28℃和37℃下1.0mmo/L IPTG诱导4h表达量；4-6：pET32-G2重组子在16℃、28℃和37℃下1.0mmo/L IPTG诱导4h表达量；7-9：pET32-G3重组子在16℃、28℃和37℃下1.0mmo/L IPTG诱导4h表达量。

图8为G3基因片段表达蛋白的薄层扫描；红色：蛋白质相对分子质量标准；绿色：含pET32a(+)的表达蛋白；黄色、深蓝、淡蓝分别为：G1、G2、G3基因的表达蛋白。

图9为纯化的G3重组蛋白SDS-PAGE；M：蛋白质相对分子质量标准；1-3、4-6、7-9分别为：咪唑浓度为100、200、500mmol/L的G3重组蛋白洗脱液。

图10为G3重组蛋白质谱鉴定。

图11为细胞融合与杂交瘤细胞的观察结果。

图12为单克隆抗体效价的测定及亚型的鉴定。

图13为Western-blotting检测抗G蛋白单抗与纯化G3重组蛋白(A)和RV(B)的反应原性；M：蛋白质相对分子质量标准；1：2D2；2：4H1；3：9G4。

图14为抗G蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光分析。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1 修饰G蛋白基因G3cDNA的获得

1、运用生物信息学软件对狂犬病病毒HEP-Flury株糖蛋白膜外区序列进行分析，选择抗原表位优势区段100～307位氨基酸(RV GP的抗原表位分析如附图1-A所示)，依照大肠杆菌密码子偏嗜性，对其氨基酸密码子进行修饰，序列见附图1-B所示，于5′端和3′端分别引入BamHI及HindIII酶切位点，理论长度为648bp，并由上海英骏生物技术有限公司合成序列，命名为G3。

2、图2为G3PCR产物凝胶电泳结果，所扩增的目的基因片段G3的双酶切纯化产物(泳道3)与预期的一致，为648bp(含双酶切位点与保护性碱基)。

实施例2 pET32-G3重组质粒的构建

1、G3基因的PCR扩增产物经BamH I及HindⅢ双酶切，回收后插入pET-32a(+)载体的BamHI及HindⅢ双酶切窗口，得到融合有His标签的G3融合蛋白基因的重组质粒，构建过程如图3所示；图3中G3基因的扩增产物经BamH I和HindⅢ双酶切后，插入pET-32a(+)的BamH I和HindⅢ双酶切窗口，得到含XXX-G3融合蛋白基因的重组质粒。

2、用重组质粒转化大肠杆菌BL21，然后将大肠杆菌BL21铺于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜，次日挑取质粒转化菌进行扩增后，抽提质粒DNA进行酶切鉴定，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳，可见经BamHI和HindⅢ双酶切后，成为两个片段，分别为大小分别约为5900bp和630bp，与预期结果相符。经DNA序列测定结果正确。

3、重组质粒pET32-G3的菌液PCR和双酶切鉴定结果如图4所示。图4中(A)pET32a(+)表达载体与G3基因片段连接后获得的重组子，经过PCR扩增，重组子的菌液可扩增出大小约为630bp的目的条带；(B)用重组质粒转化大肠杆菌BL21，然后将大肠杆菌BL21铺于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜，次日挑取质粒转化菌进行扩增后，抽提质粒DNA进行酶切鉴定，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳，可见经BamH I和HindⅢ双酶切后，成为两个片段，分别为大小分别约为5900bp和630bp，与预期结果相符。

实施例3 融合有His标签的G3融合蛋白的诱导表达

1、挑取经鉴定含有重组表达质粒pET32-G3的单菌落于含Amp⁺(100μg/mL)LB液体培养基中，37℃过夜培养。取上述培养菌按1:100比例接种于新鲜的含Amp⁺(100μg/mL)2×YT培养液，37℃培养至OD600值为0.5，再加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，以诱导GP的表达，于37℃继续培养4h，将诱导的产物12000r/min离心1min后，分别收集上清和菌体，上清中加入相同体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，菌体中加入200μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，反复冻融三次，煮沸10min后，12000r/min离心10min，除去大的蛋白质碎片，取上清立即进行SDS-PAGE蛋白质电泳。选择阳性菌株大量诱导和纯化融合有His标签G融合蛋白。

2、表达产物的SDS-PAGE：

(1)按如下体系配制12％分离胶：30％丙烯酰胺贮存液6.0mL；4×分离胶缓冲液3.8mL；10％过硫酸铵150.0μL；TEMED 15.0μL；双蒸水5.1mL；总体积15.065mL。

将各分离胶组分混匀，在安装好的玻璃平板中，立即加入分离胶溶液至距离玻璃板顶端约1.5cm，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层约1.0cm的水层，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。室温静置约30min，待凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的水层，用水冲洗凝胶上部几次后用滤纸尽可能吸干凝胶顶端的水。

(2)按如下体系灌制4％浓缩胶：30％丙烯酰胺1.0mL；4×浓缩胶缓冲液820μL；10％过硫酸铵60μL；TEMED 10μL；双蒸水4.2mL；总体积6.09mL。

将各浓缩胶组分混匀，立即加入浓缩胶溶液至玻璃板顶端，尽快小心插入梳子，尽可能避免产生气泡。约30min浓缩胶聚合后，小心拔出梳子。

(3)加入适量1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，上样前用电泳缓冲液冲洗梳子孔，小心加入处理后的样品至样品孔中。接通电源，浓缩胶阶段电压为80V，待溴酚蓝进入分离胶时升电压至100V，直至溴酚蓝前沿迁移至凝胶底部。

(4)电泳完毕后，小心剥离电泳胶，加适量考马斯亮蓝R-250染色液缓慢振摇染色3h，取出凝胶用水漂洗数次，再考马斯亮蓝脱色液脱色1h，其间更换脱色液3次。蛋白条带清晰后，观察结果，并将凝胶转入湿塑料袋内，4℃保存。

(5)结果如图5所示，图5中重组表达质粒pET32-G3转化BL21表达株，经IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE分析，在相对分子质量为39kDa处有明显的蛋白质表达条带(泳道4)，与理论值相符，而(空载体)空质粒pET32-G3经IPTG诱导后，在39kDa处无蛋白表达条带。说明pET32-G3在宿主菌BL21中表达了融合有His标签的G融合蛋白。

3、表达产物的Western-blotting分析：

(1)SDS-PAGE结束后，取出凝胶，按下列顺序制备聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”：海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫。用干净的玻棒轻轻滚过凝胶-膜“三明治”，以消除各层之间的气泡。海绵垫和滤纸、PVDF膜预先在转移缓冲液中平衡30min。将固定好的凝胶-膜“三明治”转移至电转仪中，凝胶侧朝向负极，PVDF膜侧朝向正极，并接好冷却装置，200mA恒流转移1.5h。转移后的凝胶放入考马斯亮蓝R-250染色液中染色，以检查转移效果。

(2)转移完毕后取下PVDF膜，进行如下操作：

封闭：将PVDF膜放入大小适当的玻璃平皿中，用5％脱脂奶粉-TBS 12℃封闭过夜；洗膜Ⅰ：弃去封闭液，用TBS缓慢振摇洗膜三次，每次10min；加一抗：将鼠抗狂犬病病毒阳性血清(1：100倍稀释)和抗6×His单克隆抗体(1mg/ml，1：200倍稀释)分别加入1％脱脂奶粉-TBS中，缓慢振摇8h；洗膜Ⅱ：弃去一抗，用TBS缓慢振摇洗膜三次，每次10min；加二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(1：500稀释)加入1％脱脂奶粉-TBS中，缓慢振摇过夜；洗膜Ⅲ：弃去二抗，用TBS缓慢振摇洗膜三次，每次10min；显色：称取10mgDAB溶于20mL TBS中，过滤后加入20μL浓度为30％的H₂O₂，将PVDF膜置于显色液中显色，待出现特异性反应条带后，立即浸入双蒸水中洗膜终止反应。用吸水纸吸干膜上水分，避光干燥保存。

(3)Western-blotting分析结果如图6所示，G3重组蛋白能被抗6×His单克隆抗体识别(A)和狂犬病病毒阳性血清识别(B)，证明G3基因片段在PET原核表达系统中获得表达。

泳道1中G1基因的表达蛋白和泳道2中G2基因的表达蛋白明显比泳道3中的G3基因的表达蛋白要少，条带要细；(B)泳道2中的G3基因的表达蛋白也明显比泳道3中的G2基因的表达蛋白和泳道4中的G1基因的表达蛋白要多。

4、诱导表达条件的优化

(1)采用不同的温度、IPTG浓度及时间进行诱导表达，优化重组质粒pET32-G3诱导表达条件，比较不同条件下的表达量，确定最佳诱导条件。在确定最佳表达条件后，通过薄层扫描分析重组蛋白表达产物量。

(2)图7中以诱导表达温度、IPTG浓度和诱导时间为分析因素，进行单、双和三元素组合测试，结果发现，诱导表达温度是影响表达量的最主要因素，其余两个因素对表达量几乎没有影响；三个重组蛋白均在28℃获得最高表达量；最佳诱导表达条件：在28℃下，以1.0mmol/L的IPTG终浓度，诱导4h。

(3)采取上述最佳诱导表达条件，对pET32-G1/BL21、pET32-G2/BL21及pET32-G3/BL21进行诱导表达，对重组蛋白进行薄层扫描，比较其表达量。结果如图8显示：G1、G2及G3重组蛋白分别占菌体总蛋白的24％、17％及45％，表明G3重组蛋白的表达量最高。

(4)对表达量最高的G3重组蛋白进行大量的诱导表达，表达产物经HisTrapFF柱层析纯化并浓缩后，根据公式：蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.55×A280-0.76×A260)×稀释倍数，经测定纯化后的G3重组蛋白的蛋白质浓度为10mg/mL(图9)。同时，确定了G3重组蛋白纯化的结合和淋洗缓冲液中最佳咪唑浓度为20mmol/L，而洗脱缓冲液中最佳咪唑浓度为200mmol/L。

5、目的蛋白的纯化

采用优化的表达条件对表达量最高的重组蛋白进行大量表达，收获菌体，弃上清液，包涵体沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，超声波破碎20min。于4℃，5000r/min离心20min，弃上清。用含8mol/L尿素溶解缓冲液溶解沉淀，置冰上2h。于4℃，12000r/min离心20min，收集上清，用0.22μm滤膜过滤上清。依照HisTrap FF(1mL)亲和柱的操作手册，进行蛋白纯化，具体步骤如下：

用蒸馏水注满注射器。移去塞子，用注射器(使用提供的接头)一滴接一滴的注入蒸馏水，以免将空气引入系统中；将在柱出口的速变弹簧夹移去；用5个柱床体积的灭菌双蒸水洗去柱内的乙醇；用10个柱床体积的结合缓冲液平衡柱(咪唑浓度为20mmol/L)，流速为1mL/min；用注射器将溶解的包涵体上清上到柱上；用15个柱床体积的结合缓冲液冲洗(咪唑浓度为20mmol/L)；用3个柱床体积的洗脱缓冲液分部洗脱(咪唑浓度分别为100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L)，收集洗脱液；用10个柱床体积结合缓冲液淋洗；用10个柱床体积灭菌双蒸水淋洗；用20％的乙醇注满柱床，于4℃保存。

6、纯化蛋白的浓缩和脱盐：对收集洗脱的目的蛋白进行SDS-PAGE鉴定后，使用Millipore超滤离心管对鉴定的纯化蛋白进行浓缩和脱盐，具体步骤如下：

于超滤管中加入2mL灭菌的双蒸水，室温下5000r/min离心2～3min，重复3次，淋洗超滤柱；将1.2.2.6收集的洗脱液加入超滤管中，5000r/min离心20min，收集超滤管里的浓缩样品；用2mL 1N NaOH淋洗，5000r/min离心2～3min；用2mL灭菌的双蒸水淋洗，5000r/min离心3min，重复2次；用2mL 20％的乙醇淋洗，5000r/min离心3min，重复2次；用20％的乙醇注满超滤管，于室温保存。

7、纯化蛋白浓度测定：用全自动紫外分光光度计测定纯化后蛋白含量。用溶解缓冲液溶液进行调零，测定样品A₂₆₀和A₂₈₀的值，根据公式：

蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.55×A₂₈₀－0.76×A₂₆₀)×稀释倍数，计算出蛋白质的浓度。

对表达量最高的G3重组蛋白进行大量的诱导表达，表达产物经HisTrap FF柱层析纯化并浓缩后，根据公式：蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.55×A₂₈₀-0.76×A_{26 0})×稀释倍数，经测定纯化后的G3重组蛋白的蛋白质浓度为10mg/mL(图7)。同时，确定了G3重组蛋白纯化的结合和淋洗缓冲液中最佳咪唑浓度为20mmol/L，而洗脱缓冲液中最佳咪唑浓度为200mmol/L。

8、重组蛋白的质谱鉴定

切割下SDS-PAGE电泳图谱中的表达量最高的重组蛋白条带，送至暨南大学生命与健康工程研究院进行质谱鉴定。

纯化后G3重组蛋白经胰蛋白酶酶解成肽段混合物之后，采用MS/MS法对蛋白进行质谱鉴定，经肽指纹图谱(图10B)鉴定和部分强信号肽段测序，结果表明KHFRPTPDACR、YEESLHNPYPDYHWLR、LGTSCDIFTHSR、TCGFVDER、LKLCGVLGLR、WCPPGQLVNLHDFR、REECLDALE这7段肽段为狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白的片段(图10A)，进一步表明表达的蛋白为狂犬病病毒糖蛋白。

实施例4 抗G蛋白单克隆抗体的制备

1、免疫原的制备

将纯化的重组RV GP抗原表位富集区蛋白(G3重组蛋白)用0.15mol/LpH7.4的PBS稀释到适当浓度，加入等体积的完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，在高速电动匀浆机上乳化，直至乳化良好为止，分别制成完全佐剂抗原和不完全佐剂抗原，作为免疫小鼠的佐剂抗原。观察乳化是否良好，可用小烧杯取少量清水，取0.5μL乳化液，滴入清水中，如果形成油滴，不能立即散开溶解(一般以5min为限)，即为乳化良好(张昶，2007)。

2、动物免疫

选择6周龄的体重为18～22g雌性SPF BALB/c小鼠12只，分成3组，每组4只。用弗氏完全佐剂乳化与等体积的抗原进行一免，皮下注射；然后分别在第15d和29d，用弗氏不完全佐剂乳化与等体积的抗原分别进行二免及三免。一般在三免后第10d检测小鼠抗体效价，当抗体效价达到1：10⁵后，于融合前3d用非乳化抗原加强免疫一次。3d后，无菌取脾进行融合。免疫方案见表1。

表1BALB/c鼠免疫方案

表1中选择6周龄的体重为18～22g雌性SPF BALB/c小鼠12只，分成3组，每组4只。用弗氏完全佐剂乳化与等体积的抗原进行一免，皮下注射；然后分别在第15d和29d，用弗氏不完全佐剂乳化与等体积的抗原分别进行二免及三免。一般在三免后第10d检测小鼠抗体效价，当抗体效价达到1：105后，于融合前3d用非乳化抗原加强免疫一次。3d后，无菌取脾进行融合。

小鼠在三免后第10d断尾采血，分离血清，检测血清效价，结果如表2。

表2三免后免疫鼠抗体水平检测结果

表2中小鼠在三免后第10d断尾采血，分离血清，检测血清效价，结果见表2。高剂量组所免疫的蛋白量太多，以致小鼠出现不适，甚至死亡的现象。中剂量组的血清效价最高，其中1号和3号小鼠三免后，抗体效价经104倍稀释，OD450nm+OD630nm值分别达到了1.893和1.892；血清经105倍稀释，OD450nm+OD630nm值均大于0.1，已符合制备单克隆抗体的要求，故选择中剂量组小鼠脾细胞进行融合。

高剂量组所免疫的蛋白量太多，以致小鼠出现不适，甚至死亡的现象。中剂量组的血清效价最高，其中1号和3号小鼠三免后，抗体效价经10⁴倍稀释，OD_450nm+OD_630nm值分别达到了1.893和1.892；血清经10⁵倍稀释，OD_450nm+OD_630nm值均大于0.1(如表3)，已符合制备单克隆抗体的要求，故选择中剂量组小鼠脾细胞进行融合。

表3筛选试验中包被抗原最佳使用浓度的结果

表3中不同量的纯化的G3重组蛋白包被ELISA板后，与不同稀释倍数的免疫小鼠血清感作，进行ELISA检测，结果如表3，确定最佳包被量在8μg/mL。

3、筛选方法的建立

(1)间接ELISA反应程序

包被：用包被液稀释纯化的G3重组蛋白抗原，100μL/孔，4℃过夜；洗涤：甩干包被液，洗涤液振荡洗涤4次，2min/次；封闭：加入封闭液，100μL/孔，37℃湿盒封闭3h。甩干，同上洗涤；加样：用抗体稀释液适当稀释血清，100μL/孔，37℃反应70min。甩干，同上洗涤；加二抗：用PBS按1:10000倍浓度稀释酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃作用40min。甩干，同上洗涤；加底物：每孔加入底物溶液100μL，室温反应10min；加终止液：每孔加50μL H₂SO4终止反应；测值：用双波长(OD_450nm+OD_630nm)测定各孔吸光度值，同时设阴性血清和空白对照。

(2)抗原最适包被浓度的确定

将重组抗原用包被液分别作1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、24μg/mL、32μg/mL8个稀释度，免疫小鼠血清作l：10000、1：20000、1：40000、1：80000、1：100000稀释，每孔重复2次，间接ELISA法测定各孔OD_450nm+OD_630nm值，确定抗原最佳工作浓度。

不同量的纯化的G3重组蛋白包被ELISA板后，与不同稀释倍数的免疫小鼠血清感作，进行ELISA检测，确定最佳包被量在8μg/mL(表3)。

(3)待检血清中抗E.Cloi成分的去除

用LB培养BL21(DE3)表达菌，37℃培养7h后离心收集细菌，用pH8.0TE洗1遍，沉淀用1/10体积的pH7.4的PBS悬浮，以超声波破碎细菌后，12000r/min离心10min，取上清(简称E.coli上清)备用。待检血清用10％E.coli上清液稀释，室温感作30min，以吸附待检血清中的抗E.coli抗体成分，再进行间接ELISA。同时用7份未经E.coli上清吸附的待检血清做平行对照实验并比较吸附前后的OD_450nm+OD_630nm值，以确定吸附效果。

间接ELISA检测结果表明，被检免疫小鼠血清经E.coli裂解物上清吸附后的OD_450nm+OD_630nm值明显低于吸附前的OD_450nm+OD_630nm值，因此，E.coli裂解物上清能明显降低被检血清的非特异性反应，使假阳性明显降低(表4)。

表4经E.coli上清吸附前后血清检测结果

(4)间接ELISA方法阴阳性临界值的确定

随机取SPF级雌性BALB/c鼠阴性血清15份，按已建立的程序进行间接ELISA测定，读出OD_450nm+OD_630nm值，计算出15份血清的值的平均值(X)和标准方差(SD)，阴阳性临界值(Cut off)＝X+3SD。

随机取SPF级雌性BALB/c鼠阴性血清15份(1：100和1：5000倍稀释)，按已建立的程序进行间接ELISA测定，结果如表5所示。

表5阴性小鼠血清鉴定结果(OD_450nm+OD_630nm)

根据统计学原理，样本的OD_450nm+OD_630nm值大于阴性样本OD_450nm+OD_630nm均值时，可以在99.9％的水平上判为阳性。确定样本稀释度为1：100时，OD_450nm+OD_630nm≥0.12，判为阳性；样本稀释度为1：5000时，OD_450nm+OD_630nm≥0.03，判为阳性(表6)。

表6阴阳性临界值OD_450nm+OD_630nm

4、杂交瘤细胞株的建立

(1)SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备

融合前48h，将SP2/0骨髓瘤细胞扩大培养于直径为9cm的细胞培养皿中，每块加10mL含10％血清DMEM培养液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；融合当天，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50mL离心管内，1000r/min离心5min，弃上清；用不完全DMEM培养液混匀细胞后计数，取所需细胞数，用不完全DMEM培养液洗2次，以10mL不完全DMEM培养液重新悬浮备用。

融合后观察每个96孔培养板，了解和掌握细胞生长、死亡情况，以便及时进行抗体检测和细胞株克隆。融合当天(1d)可见瘤细胞透亮，形态多样，相互之间有粘连、重叠。融合后4d，可见形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮，成葡萄串状分布的融合细胞小集落克隆，周围聚集着许多大小不等的细胞碎片(图11A)。融合后7d，细胞克隆继续长大，对有克隆生长的孔作上标记，以便检测(图11B)。

(2)饲养细胞的制备

在融合前2d，取1只健康未免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，拉颈脱臼处死，将小鼠尸体于75％酒精中浸泡消毒5min，随即移入无菌操作台内，腹部朝上固定在解剖板上；在小鼠左侧腹壁剪一小口，撕开皮肤，用灭菌镊子提起腹膜，剪开左侧腹膜及肋骨，暴露脾脏，换用另一套灭菌器械，用镊子提起脾脏，取出脾脏置于灭菌的平皿中，用不完全DMEM培养液轻轻洗3次，并剥去周围的结缔组织；将脾脏移入另一灭菌平皿中，置于200目铜网上，用灭菌的西林瓶底部挤压研磨脾脏，并用不完全DMEM培养液轻轻冲洗铜网，使脾细胞全部通过铜网压挤到溶液中；将脾细胞溶液转至50mL离心管中，加不完全培养液至20mL，混匀；1000r/min离心5min，弃上清；沉淀细胞再用不完全DMEM培养液同法离心洗涤一次；先用5mL HAT培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，作细胞计数，然后根据细胞计数结果，补加HAT培养液至30mL，使细胞浓度为2×10⁵个/mL；将细胞悬液滴于6块96孔细胞培养板中，每孔50μL(相当于1滴)，然后将培养板置37℃、含5％CO₂培养箱内培养24h后观察细胞生长状态，细胞呈多形性，贴壁，折光性好时即可使用。

(3)免疫淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合

取加强免疫3d后的BABL/c小鼠，摘除眼球采血；制备脾细胞悬液；将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的比例混合在一起，转入50mL离心管内，1000r/min离心10min，弃上清，用滴管吸净残留液体；用滴管轻轻搅动沉淀，使其松散均匀成糊状；在37℃水浴中融合：一手均匀地转动离心管，另一手用吸管吸取PEG4000溶液1mL，并沿转动的管壁(尽量接近细胞处)加入，从加入到加完的时间控制在1min左右，边加边搅动，用吸管在1min内加入1mL预热至37℃不完全DMEM培养液，重复3次，往后每分钟加入3mL，直至加满到25mL为止(注意此时操作应轻柔，边转动边加，尽量不搅散细胞)；37℃培养箱静置10min，800r/min离心10min，弃上清；加入10mL HAT培养液，轻轻吹吸混匀；根据所用96孔培养板的数量，按一块96孔培养板用液15mL计算补加HAT培养液至所需的量；将融合好的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，每孔150μL(相当于3滴)，37℃、5％CO₂培养箱内培养。

(4)杂交瘤细胞的选择性培养及观察

将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中，于37℃、5％CO₂的培养箱内培养。根据情况，每5d半换液1次，第11d改换同量的HT培养液，维持2周。仔细观察融合细胞的生长情况，凡有污染的孔立即滴加1％的NaOH，以免污染扩散，如果细胞生长太慢可补加1次饲养细胞。细胞融合后3d内不提倡在CO₂培养箱外长时间的观察，因为培养箱外温度和CO₂浓度的不适会影响融合细胞的生长。

(5)阳性杂交瘤细胞的筛选

待融合后的细胞克隆生长到覆盖细胞孔底部l/10时，用建立好的间接ELISA方法对所有有克隆生长的培养上清进行检测，检测为阳性的细胞进行克隆并扩大培养，选出阳性和特异性最强的孔进行克隆，并注意随时冻存保种。筛选时，一般先用糖蛋白包被的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清，对于阳性的细胞上清，再用基质蛋白和pET32a(+)蛋白包被的间接ELISA方法进行第二次的筛选，同时设阴性对照(SP2/0细胞上清)和阳性对照(融合用免疫鼠血清)。

(6)阳性杂交瘤细胞的克隆：对筛选所获得的阳性杂交瘤细胞孔以有限稀释法进行克隆，以获取能稳定分泌抗体的单克隆孔。具体步骤如下：

克隆前2d，按照(2)的方法制备小鼠饲养细胞；将96孔细胞培养板中抗体分泌阳性的杂交瘤细胞集落(强阳性孔)吹起，混匀，取适量细胞悬液至一无菌EP管中，做适当稀释，将上述EP管中细胞计数，计算细胞密度；取上述细胞悬液的130个细胞加入到6.5mL含20％胎牛血清的HT培养液(初次克隆)或完全培养液，即20个细胞/mL，100μL/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞，余下2.9mL细胞悬液补加2.9mL含20％胎牛血清的HT培养液或完全培养液，细胞数为10个细胞/mL，100μL/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞，余下2.2mL细胞悬液补加2.2mL含20％胎牛血清的HT培养液或完全培养液，细胞数为5个细胞/mL，100μL/孔加G、H两排，为每孔0.5个细胞；培养4d，在倒置显微镜上可见小的细胞克隆，补加含20％胎牛血清的HT培养液或完全培养液每孔100μL；适时观察细胞的生长状况，待细胞集落生长到孔底1/10面积时半换液，并用所换出的培养液上清进行抗体检测；选择OD值高、细胞活力好、只有一个细胞集落的孔再次克隆和亚克隆，同时每次将克隆剩余细胞转入24孔细胞培养板培养(并在原孔中补加另一批培养基，以防二者同时污染或细胞死亡)，继而转入6孔板和普通细胞培养皿中进行扩大培养，并及时冻存；经过多次克隆操作，直至所有克隆的细胞孔检测阳性率为100％时，即确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，及时进行扩大培养并冻存。

将纯化的G3重组蛋白免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓廇细胞用PEG方法进行细胞融合，每次培养6块96孔培养板，其中3号鼠融合成功，接种576孔，其中456孔有杂交瘤细胞生长，融合率为79.2％。先采用间接ELISA法对所有有克隆生长孔的抗体进行初筛，得到9孔阳性细胞，阳性率为2％；再对阳性孔抗体用双筛选ELISA法(包被基质蛋白和pET32a蛋白)进行第二次的筛选，选出阳性和特异性最强的孔用有限稀释法进行4次亚克隆，经检测和筛选最终获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞3株，分别命名为2-D2、4-H1与9-G4，分泌的单克隆抗体分别为2D2、4H1与9G4。

(7)腹水的制备：采用体内诱生腹水法制备。具体操作如下：

小鼠预处理：在接种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞前2周，先给10周龄以上雌性SPF级BALB/c鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，每只0.5mL；接种杂交瘤细胞：将培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000r/min离心5min，弃上清，用生理盐水将杂交瘤细胞离心3次后将其悬浮混匀，并调细胞浓度至1×10⁶个/mL，每只小鼠经腹腔注射0.5rnL；采集腹水：接种后观察小鼠状态，当小鼠腹部明显膨大，行动不便时，用碘酒棉球消毒下腹部皮肤后，用5mL注射器针头刺入腹腔，抽取腹水，可视小鼠腹腔膨胀情况重复抽取，直到小鼠死亡。将腹水3000r/min离心10min，弃掉细胞，除去脂肪组织。上清分装，-80℃保存或进一步进行鉴定。

5、单抗生物学特性鉴定

(1)单抗效价的测定：采用间接ELISA方法测定。用纯化的G3重组蛋白包被酶标板，将腹水从1:100倍开始做倍比稀释，同时以阴性腹水做同等稀释度作为对照，以平行稀释的单抗OD_450nm+OD_630nm/对照OD_450nm+OD_630nm比值大于2的最高稀释倍数为单抗的效价。

用纯化的G3重组蛋白包被酶标板进行间接ELISA试验，测定3株单抗腹水的抗体效价，以平行稀释的单抗OD_450nm+OD_630nm/对照OD_450nm+OD_630nm比值大于2的最高稀释倍数为单抗的效价，结果见图12A，三株单抗的腹水效价均超过10⁵。

(2)单抗亚型的鉴定：按Hycult biotechnology公司的Mouse mab IsotypingTest Kit(10assay kit)的说明书进行：将细胞上清用pH 7.4PBS适当稀释至抗体浓度50μg/mL备用；加500μL buffer至含一条κ型试纸条的检测管中；再加500μL稀释好的样品至检测管中；将试纸条完全浸入并轻轻搅动；轻摇瓶子混匀兔抗鼠κ链胶粒，加入1mL至检测管中，并使打印面朝下；在25℃环境中振荡30min左右可见2个斑点出现(一个在亚类区，另一个在κ区)，试纸条在振荡过程中始终保持浸在溶液中。用Hycult biotechnology公司的Mouse mab Isotyping TestKit对单抗的亚型进行鉴定，结果表明单抗亚型为IgG1，轻链为κ链(图12B)。

(3)杂交瘤细胞株分泌单抗的稳定性测定：分别收集体外连续传代30代以上的杂交瘤细胞株上清，用间接ELISA方法测定3株杂交瘤细胞株的效价，然后再检测冻存3个月后经复苏、传代的细胞株，检测培养上清液中的抗体效价，与冻存前的效价比较，以评价其分泌抗体的稳定性。结果表明获得的杂交瘤细胞株在体外连续传代培养和冻存后仍保持稳定的抗体分泌能力(表7)。

表7杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性分析。

6、单抗特异性鉴定

(1)单抗的特异性与交叉性ELISA检测

采用间接ELISA方法测定单克隆抗体的特异性，用纯化的G3重组蛋白和狂犬病病毒HEP-Flury(1：1000倍稀释)分别包被酶标板，将单抗腹水作一定倍数稀释，同时设立阴性和空白对照；采用间接ELISA方法测定单克隆抗体与六联苗(包括犬细小病毒、犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬腺病毒I/II型和犬钩端螺旋体)的交叉反应。用六联苗作为包被抗原，分别与单抗腹水作用，设立犬细小病毒阳性对照和阴性腹水对照。

检测结果如表8所示，表明3株单抗均能与糖蛋白和狂犬病病毒反应，而不与基质蛋白、pET32a(+)蛋白和犬六联苗(包括犬细小病毒、犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬腺病毒I/II型和犬钩端螺旋体)反应，具有很好的特异性，并且无交叉性反应。

表8抗G蛋白单克隆抗体特异性与交叉性ELISA检测分析。

(2)Western-blotting鉴定单抗

按照实施例3的方法进行SDS-PAGE，然后将狂犬病病毒蛋白质与纯化的G3重组蛋白按实施例3的方法从凝胶转移至PVDF膜，然后进行以下操作：

封闭：电转完毕后，将PVDF膜作好标记，放入大小适当的玻璃平皿中，用5％脱脂奶粉-TBS 12℃封闭过夜；以TBS洗涤3次，每次10min；加一抗：将一定倍数稀释的单抗腹水加入1％脱脂奶粉-TBS中，加入量以完全覆盖膜为准并尽量排出气泡，37℃摇床孵育8h；同上洗涤；加二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(1：500稀释)加入1％脱脂奶粉-TBS中，缓慢振摇过夜；同上洗涤；显色：称取10mg DAB溶于20mL TBS中，过滤后加入20μL浓度为30％的H₂O₂，将PVDF膜置于显色液中显色，待出现特异的反应条带后，立即浸入双蒸水中洗膜终止反应。用吸水纸吸干膜上水分，避光干燥保存。

应用Western-blotting试验测定了单抗腹水2D2、4H1与9G4的特异性反应分别以3株单抗为一抗，结果均在39KDa处产生了一条特异性反应带(图13A)，表明3株单抗均能与纯化的G3重组蛋白结合，是针对G3重组蛋白的单抗；分别以3株单抗为一抗，结果均在67KDa处产生了一条特异性反应带(图13B)，表明3株单抗均能与RV结合，是针对RV糖蛋白的单抗。

(3)间接免疫荧光试验鉴定单抗

病毒吸附：将狂犬病病毒HEP-Flury(1：10倍稀释)接种于长满单层BHK-21细胞的24孔细胞培养板中的前三排，后一排不接毒，在37℃培养箱中吸附3d；丙酮固定：尽可能地倾去全部细胞培养液，每孔加500μL预冷的80％丙酮，1s后快速倾去80％丙酮，其后再次加500μL预冷的80％丙酮，铝箔纸包住培养板，室温固定1h，弃去80％丙酮，将24孔板细胞培养板晾干，数周内可置于4℃保存备用；洗涤：用PBS洗涤丙酮固定好的24孔细胞病毒板一遍，每孔1mL洗涤液，甩干；加入一抗：加入单抗腹水、阴性腹水和骨髓瘤细胞上清，200μL/孔，37℃湿盒中作用60min，同时设立细胞对照；洗涤：甩净抗体，用PBS洗涤3次，甩干；加入二抗：加入FITC标记羊抗鼠IgG二抗(1:50倍稀释)50μL，37℃闭光作用45min；洗涤：甩去二抗，用PBS洗涤4次，吸水纸吸干，避光干燥10min；镜检：荧光显微镜观察、拍照；结果判定：有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。

以抗RV GP的单克隆抗体腹水2D2、4H1与9G4，检测RV感染的BHK-21细胞显示强阳性荧光信号，而阴性和空白对照则荧光信号阴性(图14)。结果表明抗RV G蛋白单抗能识别BHK-21细胞中G蛋白抗原，应用于IFA检测具有良好的敏感性和特异性。

                         SEQUENCE LISTING

 <110>  华南农业大学

<120>  一株通过基因修饰以优化表达后的狂犬病病毒糖蛋白及其单克隆抗体和应用

<160>  3      

<170>  PatentIn version 3.3

 <210>  1

<211>  625

<212>  DNA

<213>  修饰后糖蛋白基因G3的核苷酸序列

 <400>  1

acattcaagc gcaagcattt ccgcccgacc ccagacgcat gtcgcgccgc gtataactgg     60 

aagatggccg gtgacccgcg ctatgaagag tctctgcaca atccgtaccc ggactaccat    120 

tggcttcgcc acactgtaaa aaccaccaaa gagtctctcg ttatctcccc aagtgtgaca    180 

gatttggacc catatgacaa atcccttcac tcacgcgtct tccctggcgg aaattgctca    240 

ggaatcacgg tgtcctcgac ctactgctca actaatcatg attacaccat ctggatgcct    300 

gagaatctgc gcctggggac atcttgtgac atttttaccc atagccgcgg gaagcgcgca    360 

tccaaaggag acaagacttg cggctttgtg gatgaacgcg gcctgtataa gtctttaaag    420 

ggagcatgca aactcaagtt atgtggagtt ctcggacttc gccttatgga tggaacatgg    480 

gtcgcgatgc aaacatcaga tgagaccaaa tggtgccctc caggtcagtt ggtgaatttg    540 

cacgactttc gctcagacga gattgagcat ctcgttgagg aagagttagt caagaaacgc    600 

gaggagtgtc tggatgcact ggagt                                          625 

 <210>  2

<211>  208

<212>  PRT

<213>  修饰后糖蛋白基因G3编码的蛋白氨基酸序列 

<400>  2 

Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala

1               5                   10                  15       

Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu

            20                  25                  30           

His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Lys Thr Thr

        35                  40                  45               

Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp Leu Asp Pro

    50                  55                  60                   

Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly Asn Cys Ser

65                  70                  75                  80   

Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr

                85                  90                  95       

Ile Trp Met Pro Glu Asn Leu Arg Leu Gly Thr Ser Cys Asp Ile Phe

            100                 105                 110          

Thr His Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Asp Lys Thr Cys Gly

        115                 120                 125              

Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Lys

    130                 135                 140                  

Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp

145                 150                 155                 160  

Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Gly Gln

                165                 170                 175      

Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val

            180                 185                 190          

Glu Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu

        195                 200                 205             

 <210>  3

<211>  625

<212>  DNA

<213>  修饰前糖蛋白基因G3的核苷酸序列

 <400>  3

acattcaaga gaaagcattt ccgccccacc ccagacgcat gtagagccgc gtataactgg     60 

aagatggccg gtgaccccag atatgaagag tctctacaca atccgtaccc cgactaccat    120 

tggcttcgaa ctgtaaaaac caccaaagag tctctcgtta tcatatcccc aagtgtgaca    180 

gatttggacc catatgacaa atcccttcac tcaagggtct tccctggcgg aaattgctca    240 

ggaataacgg tgtcctcgac ctactgctca actaatcatg attacaccat ctggatgcct    300 

gagaatctga gactagggac atcttgtgac atttttaccc atagcagagg gaagagagca    360 

tccaaaggag acaagacttg cggctttgtg gatgaaagag gcctgtataa gtctttaaag    420 

ggagcatgca aactcaagtt atgtggagtt ctcggactta gacttatgga tggaacatgg    480 

gtcgcgatgc aaacatcaga tgagaccaaa tggtgccctc caggtcagtt ggtgaatttg    540 

cacgactttc gctcagacga gattgagcat ctcgttgagg aagagttagt caagaaaaga    600 

gaggagtgtc tggatgcact agagt                                          625 

Claims (10)

1.一种通过基因片段进行密码子修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种经修饰的狂犬病病毒的G蛋白，其特征在于，由权利要求1所述修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3。

4.由权利要求3所述表达载体表达达到的狂犬病病毒G蛋白在制备抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体中的应用。

5.一种抗狂犬病病毒G蛋白的抗体，其特征在于，采用的免疫原是以权利要求3所述表达载体表达达到的狂犬病病毒G蛋白。

6.根据权利要求5所述抗体，其特征在于，所述狂犬病病毒为狂犬病病毒HEP-Flury株。

7.根据权利要求5或6所述抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。

8.一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接ELISA方法，其特征在于，所用抗体为权利要求5所述抗体。

9.一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的Western-blotting检测方法，其特征在于，所用抗体为权利要求5所述抗体。

10.一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接免疫荧光检测方法，其特征在于，所用抗体为权利要求5所述抗体。