CN108752422A

CN108752422A - 一种微小隐孢子虫检测用tsp4多肽序列及用途

Info

Publication number: CN108752422A
Application number: CN201810513813.9A
Authority: CN
Inventors: 尹继刚; 张天宇; 王东强; 焦新; 邵青延
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: CN108752422B

Abstract

本发明公开了一种微小隐孢子虫检测用TSP4多肽序列及用途，利用微小隐孢子虫多肽TSP4与KLH偶联后作为抗原，免疫Balb/c小鼠，制备单克隆抗体，收集样品（卵囊），脱囊液脱囊，室温孵育成子孢子，透化液透化，分别加入单克隆抗体、二抗、PBS缓冲液、荧光染料、抗荧光猝灭剂，利用荧光显微镜观察样本。经反复多次实验表明，偶联KLH的六种隐孢子虫特异性多肽具有良好的免疫源性，免疫小鼠可以均可得到理想效价的杂交瘤细胞；每次筛选的都能筛选出效价均达到1:16000以上的单克隆抗体，都可用作荧光检测。利用TSP4合成多肽制备的单克隆抗体可以很灵敏的标记在微小隐孢子虫子孢子的表面，没有发生交叉反应。

Description

一种微小隐孢子虫检测用TSP4多肽序列及用途

技术领域

本发明属生物检测技术领域，具体涉及一种微小隐孢子虫检测用TSP4多肽序列及用途。

背景技术

微小隐孢子虫是导致全球范围内人和其他哺乳动物隐孢子虫病的一个主要病原。微小隐孢子虫主要通过粪-口途径摄取被隐孢子虫污染的水或食物进行传播。其主要寄生于胃肠道上皮细胞的微绒毛边缘，感染宿主后症状表现轻重不一。在免疫功能正常的人群中，通过在肠上皮细胞中增殖导致的腹泻一般为自限性，但这是免疫力低下者主要的致死原因。微小隐孢子虫卵囊可以在环境中长期存活，并可以抵抗常规的次氯酸钠消毒，这成为控制饮用水中微小隐孢子虫污染的一大难题。迄今为止尚无针对隐孢子虫的特效药物和有效疫苗

目前国内外的微小隐孢子虫的临床检测方法主要美国EPA1623法。虽然这种方法检出率与特异性很好，便于操作，但是，其抗体只是针对于卵囊壁，因此无法鉴定卵囊的活力。本文通过设计合成微小隐孢子虫多种蛋白质的多肽，免疫小鼠制备单克隆抗体，通过对比不同抗体的检测效果，选择最优抗体作为微小隐孢子虫子孢子检测用抗体，用于微小隐孢子虫的临床检查。

发明内容

本发明目的是为了解决现有检测粪便或环境样本中微小隐孢子虫卵囊的方法不能区分卵囊活力的问题，而提供一种微小隐孢子虫子孢子检测用抗多肽单克隆抗体。

微小隐孢子虫合成多肽TSP4，其氨基酸序列如序列表 SEQ ID No.1所示。

微小隐孢子虫卵囊检测试剂盒，它包括：微小隐孢子虫多肽TSP4与KLH偶联后作为抗原制备的单克隆抗体；

它还包括二抗、PBS缓冲液、荧光染料、抗荧光猝灭剂；

所述的荧光染料为4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI；

还包括脱囊液、多聚甲醛、透化液；

所述的脱囊液为0.75%牛胆酸钠盐和0.25%胰酶；

所述的透化液为甲醛：丙酮体积比为1：1；

微小隐孢子虫卵囊检测试剂盒在检测微小隐孢子虫子孢子方面的应用。

一种微小隐孢子虫检测方法，包括以下步骤：

1）将样本加入次氯酸钠，除去大部分细菌及杂质，收集浓缩物；

2）将收集到的浓缩物加入脱囊液，于36~38℃作用1h；

3）4500~5500g离心8~12分钟除去脱囊液；

4）将离心后的混合物加入4%多聚甲醛溶液，室温作用30min；

5）4500~5500g离心8~12分钟除去多聚甲醛；

6）加入PBS缓冲液悬起并涂到多聚赖氨酸处理的盖玻片上，静置1~2h；

7）吸去多余的PBS缓冲液；

8）加入透化液，于-20℃透化3~7min；

9）用含有1%胎牛血清FBS的PBS缓冲液稀释单克隆抗体，体积比为1：40~60，室温孵育0.5~1.5h；

10）FBS-PBS洗3次，每次3~7min；

11）用FBS-PBS稀释Alexa fluor^TM488 goat anti-mouse IgG二抗，体积比为1：1800~2200，室温孵育0.5~1.5h；

12）PBS洗三次，每次3~7min；

13）用PBS按1：20000稀释DAPI，室温2~5min；

14）PBS洗三次，每次3~7min；

15）吸去多余的PBS,加入抗荧光猝灭剂，盖上盖玻片，利用荧光显微镜观察样本；

所述的单克隆抗体为微小隐孢子虫多肽TSP4与KLH偶联后作为抗原制备的单克隆抗体；

所述的脱囊液为0.75%牛胆酸钠盐和0.25%胰酶；

所述的透化液中，甲醛：丙酮体积比为1：1。

本发明提供了一种微小隐孢子虫检测方法，它是利用微小隐孢子虫多肽TSP4（其氨基酸序列如序列表 SEQ ID No.1所示）与KLH偶联后作为抗原，免疫Balb/c小鼠，制备单克隆抗体，收集样品（卵囊），脱囊液脱囊，室温孵育成子孢子，透化液透化，分别加入单克隆抗体、二抗、PBS缓冲液、荧光染料、抗荧光猝灭剂，利用荧光显微镜观察样本。经反复多次实验表明，偶联KLH的六种隐孢子虫特异性多肽具有良好的免疫源性，免疫小鼠可以均可得到理想效价的杂交瘤细胞；每次筛选的都能筛选出效价均达到1:16000以上的单克隆抗体，都可用作荧光检测。利用TSP4合成多肽制备的抗体可以很灵敏的标记在微小隐孢子虫子孢子的表面，没有发生交叉反应。

附图说明

图1 部分多肽与BSA偶联结果图；

图2 六种单克隆抗体效价检测图；

图3 六种间接免疫荧光检测效果图。

具体实施方式

实施例1 微小隐孢子虫特异性多肽的筛选与合成

1、微小隐孢子虫特异性多肽的筛选

1）在隐孢子虫的专业网站（http://cryptodb.org/cryptodb/）查找多种目标基因，作为备选抗原；

2）将查找到的目的基因的氨基酸序列通过swissmodel.expasy.org进行三维结构的预测，寻找免疫原性相对较强的无规则卷曲区域，再利用iedb.org预测B细胞表位的预测，最后将设计的多肽与隐孢子虫的其他蛋白进行对比，取免疫原性强，特异性好的肽段进行合成；

3）为了增强多肽与KLH和BSA的偶联效率，在设计多肽的时，有选择的避开含有半胱氨酸的多肽，并再C端没有半胱氨酸的多肽后面人工加上一个半胱氨酸。

2、微小隐孢子虫特异性多肽的合成

将设计好六种隐孢子虫特异性的多肽送往强耀生物公司进行合成；六种隐孢子虫特异性的多肽分别为TSP4、TRAP-C2、TSP3、TSP6、TSP10和GP900，氨基酸序列如序列表 SEQ IDNo.1~6所示；由于设计合成的多肽片段为小分子的半抗原，其只有反应原性而没有免疫原性，所以在免疫动物时需要与一个大分子物质偶联，以此刺激动物机体产生抗体。最终，多肽与血蓝蛋白（KLH）偶联作为免疫动物用抗原，与牛血清白蛋白（BSA）偶联作为ELISA检测包被用抗原。多肽与KLH偶联由生物公司完成，与BSA偶联的步骤如下：

1）将1mgBSA溶解于200µL的去离子水中，0.2mg的MBS（m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺）溶于40µL的DMF中后加到BSA溶液中，室温旋转混合2h；

2）大体积的PBS透析过夜；

3）将1mg多肽溶解于200µL的PBS中，随后将透析过夜的MBS-BSA混合物加到多肽溶液中，室温孵育4h；

4）大体积的PBS透析过夜，50 µL分装后-20℃保存。

3、检测多肽与BSA的偶联效果

采取以下步骤进行检测：

1）样品制备：取40µL的peptide-BSA与10µL的5×SDS-PAGE Loading Buffer混合，沸水浴5min即可；

2）SDS-PAGE变性胶的配制：按照配方配制10%的下层分离胶，待完全凝好后再配制5%的上层浓缩胶；

3）电泳：加15 μL样品至加样孔中，上层的浓缩胶使用75 V恒压电泳，待进入分离胶后将电压调至145V继续进行电泳，直至移动至凝胶底部；

4）染色：将凝胶放入新鲜配制的考马斯亮蓝染色液中，水平摇床晃动染色过夜；

5）脱色：将染好色的凝胶放入脱色液中，水平摇床上晃动脱色至凝胶无背景色。

图1为多肽与BSA偶联的SDS-PAGE经过考马斯亮蓝染色后的电泳图；其中泳道1和泳道2 分别是BSA以及BSA与MBS偶联之后的电泳结果，泳道3~7分别是多肽与MBS-BSA偶联之后的电泳结果；从图中可以看出，多肽与BSA偶联之后要比BSA的分子量稍大一些，表明多肽与BSA偶联成功。

实施例2动物免疫及单克隆抗体的制备

一、实验动物免疫程序

将偶联KLH的六种隐孢子虫特异性多肽与等体积弗氏佐剂混合，免疫Balb/c小鼠；第一次免疫与完全佐剂混合，免疫量为100μg，后4次免疫与不完全佐剂混合，免疫量为50μg；两次免疫的间隔时间为15天；在细胞融合的前三天对免疫Balb/c小鼠尾静脉注射20μg多肽进行加强免疫。

二、单克隆抗体制备

1、饲养层细胞的制备

融合细胞的前一天制作词养层细胞；取一只普通BALB/c小鼠，拉颈处死，放入75%酒精浸泡5min。转入超净工作台，剪开腹部皮肤，向两侧拉开，暴露腹膜，取灭菌后的5mL注射器，抽取6~8mLHAT培养液，注入小鼠腹腔，反复揉捏腹部10余次后抽出，加HAT至12mL，混匀后每孔1滴加入到2块96孔培养板中，放置37°C，5%C0₂细胞培养箱内培养备用。

2、细胞融合

1)无菌取脾

将免疫的小鼠用镊子摘除眼球，轻轻挤压小鼠采血，将采血后的小鼠放入75%酒精溶液中浸泡5min。转入超净工作台，垫上纱布，用高温消毒过的剪刀剪开皮肤，依次剪破腹膜、剥离脂肪，取脾放入含10mL洗液的培养皿中，用注射器针头在脾脏上扎眼，然后从脾的一侧用1mL注射器注入洗液，反复注入2~3次，然后用5mL注射器针蕊轻轻研磨脾脏，直至脾脏仅留外膜为止。将悬液反复用铜网滤过几次，将杂质过滤。吸入10mL脾脏研磨液至离心管中，1500r/m离心6min；.

2)处理SP2/0细胞

将含SP2/0细胞的培养瓶上清倒掉，用洗液反复吹打瓶壁，将SP2/0细胞吸至50mL融合用玻璃离心瓶中，1500r/m离心6min；

3)用洗液将脾细胞和SP2/0细胞吹起后混合，1500r/m离心6min；

4)用手轻轻叩打瓶底，使细胞成为单层，放入37°C水浴中，将1mL50%PEG慢慢滴加到离心瓶中1min内滴加完，滴加过程中保持瓶内容物不断转动；

5)静置90s；

6)3min内缓慢加洗液4mL，分四步完成分别是：

60s内加入洗液1ml

30s内加入洗液1ml

7)加入大量洗液，1500r/m离心6min，洗去PEG；

8)弃上清，沉淀加入35mL HAT；

9)加入已于前一天加入饲养层细胞的96孔培养板中，每孔3滴，放置37°C5%C02细胞培养箱内培养；

10)融合24小时后，每孔补加-滴I1AT培基，融合后笫4d、第6d、第8d和第10d换液，融合后10~12d可检测效价。

3、杂交瘤细胞的筛选

在100倍镜下观察，当细胞培养板上细胞生长至一个视野的1/3时即可将细胞液上清进行间接ELISA检测。将效价高的细胞扩大培养，冻存。

4、腹水制备与抗体纯化

1）在接种杂交瘤细胞的前7天，需要给balb/c小鼠腹腔注射用等体积生理盐水稀释的不完全佐剂，每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞。注射杂交瘤细胞5-7天之后收集腹水；

2）收集到的腹水用“辛酸-硫酸铵沉淀”方法进行纯化，步骤如下：

：用4倍体积的醋酸缓冲液（60mM，pH=4.0）稀释腹水，再用0.1M NaOH调pH至4.5；

：缓慢加入辛酸（25μl/ml of diluted water），并使其充分溶解，室温震荡30min，10000g离心30min，吸取上清；

加入1/10体积的10×PBS缓冲液，用1M NaOH调pH至7.4；

将上清冷却至4℃，加入硫酸铵（0.277g/ml，45%饱和度）搅拌30min，5000g离心15分钟，收集沉淀IgG；

弃上清，用原腹水体积的1/10的PBS悬浮IgG；

用50倍体积的PBS透析过夜；

将透析后的样本加热到55℃，加热20min，5000g离心20min，收集上清于-80℃保存；

⑧SDS-PAGE检测抗体纯度。

5、按不同的稀释倍数通过间接ELISA方法检测抗体效价，步骤如下：

1）抗原包被：用Coating Buffer将偶联得到的peptide-BSA稀释成5 μg/mL，每孔50 μL，37℃放置1h，4℃过夜；

2）洗板：配制Washing Buffer，利用洗板机洗板3次，每次间隔4 min；

3）封闭：每孔加入100μL含3% BSA的封闭液，37℃封闭1 h；

4）洗板：同步骤（2）；

5）一抗：使用Tween Buffer按1：200，1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1：32000稀释倍数稀释一抗，每孔50 μL，37℃孵育1 h；

6）洗板：同步骤（2）；

7）二抗：使用Tween Buffer按1:20000稀释倍数稀释二抗，每孔50 μL，37℃孵育1 h；

8）洗板：同步骤（2）；

9）显色：配制1 mg/mL的显色液，每孔50μL，37℃避光显色20 min，酶标仪检测OD405读数。

10）六种单克隆抗体效价检测图如图2所示，抗体效价均达到1:16000以上，都可用作荧光检测。

实施例3间接免疫荧光检测临床样本

上述实施例制备得到的六种单克隆抗体，分别作为荧光检测中的一抗使用，具体步骤如下：

1）、将收集到的临床样本加入一定量的次氯酸钠进行杀菌处理，随后利用蔗糖漂浮的方法，除去大部分细菌及杂质；

2）、将收集到的浓缩物加入脱囊液（包含0.75%牛胆酸钠盐、0.25%胰酶），于37℃作用1h，其目的是孵育微小隐孢子虫的卵囊，将卵囊里面的4个子孢子释放出来，以此来检测所制备的单克隆抗体是否可以作用于子孢子；

3）、5000g离心10分钟除去脱囊液；

4）、将离心后的混合物加入4%多聚甲醛（2g甲醛溶解于50ml PBS溶液中），室温作用30min，通过多聚甲醛来固定子孢子，使其在后续的实验中持完整的形态；

5）、5000g离心10分钟除去多聚甲醛；

6）、加入PBS缓冲液悬起并涂到多聚赖氨酸处理的盖玻片上，静置1h，使子孢子粘到盖玻片的表面；

7）、吸去多余的PBS，除去没有粘上的子孢子与卵囊；

8）、加入透化液（甲醛：丙酮=1：1）于-20℃透化5min；

9）、用含有1%FBS的PBS稀释所制备的六种单克隆抗体（1：50），室温孵育1h；

10）、FBS-PBS洗3次，每次5min；

11）、用FBS-PBS 1：2000稀释Alexa fluor^TM488 goat anti-mouse IgG二抗，室温孵育1h；

12）、PBS洗三次，每次5min；

13）、用PBS 20000倍稀释4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室温3min；

14）、PBS洗3次，每次5min；

15）、吸去多余的PBS,加入抗荧光猝灭剂，盖上盖玻片，利用荧光显微镜观察样本。

通过多种单克隆抗体的实验结果进行对比，选取特异性，敏感性最高的作为最终诊断用抗体，结果如图3所示，利用TSP4合成多肽做制备的单克隆抗体可以很灵敏的标记在微小隐孢子虫子孢子的表面，其他抗体标记不清楚或标记不上，并且有的抗体会与样本中的菌体发生交叉反应。因此选择敏感性和特异性高的抗TSP4多肽抗体作为微小隐孢子虫检测用抗体。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种微小隐孢子虫检测用TSP4多肽序列及用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 1

Lys Ile Lys Lys Ala Asp Ser Trp Gln Glu Cys

1 5 10

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 2

Glu Pro Lys Gly Ala Pro Leu Leu Tyr Val Asp Gly Asp Gly Cys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 3

Gln Ala Asn Pro Ser Ser Ile Leu Asn Leu Ala Asn Gln Cys

1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 4

Glu Leu Asp Ser Ser Arg Thr Pro Val Asn Glu Thr Ile Asn Cys

1 5 10 15

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 5

Ser Gly Ser Ala Thr Gln Gly Gly Pro Ser Thr Thr Glu Cys

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工()

<400> 6

Claims

1.一种微小隐孢子虫检测用TSP4多肽序列及用途，其氨基酸序列如序列表 SEQ IDNo.1所示。

2.微小隐孢子虫卵囊检测试剂盒，它包括：权利要求1所述的一种微小隐孢子虫检测用TSP4多肽与KLH偶联后作为抗原制备的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的微小隐孢子虫卵囊检测试剂盒，其特征在于：它还包括二抗、PBS缓冲液、荧光染料、抗荧光猝灭剂。

4.根据权利要求3所述的微小隐孢子虫卵囊检测试剂盒，其特征在于：所述的荧光染料为4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI。

5.根据权利要求2、3或4所述的微小隐孢子虫卵囊检测试剂盒，其特征在于：还包括脱囊液、多聚甲醛、透化液。

6.根据权利要求5所述的一种微小隐孢子虫卵囊检测试剂盒，其特征在于：所述的脱囊液为0.75%牛胆酸钠盐和0.25%胰酶。

7.根据权利要求6所述的一种微小隐孢子虫卵囊检测试剂盒，其特征在于：所述的透化液为甲醛：丙酮体积比为1：1。

8.权利要求2所述的微小隐孢子虫卵囊检测试剂盒在检测微小隐孢子虫子孢子方面的应用。