CN104693305A - 一种抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体、其制备方法及应用。所述抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体特异性结合肝癌患者肿瘤组织中的鞘糖脂Globo-H。本发明的单克隆抗体与人鞘糖脂Globo-H的特异性结合能力强，能够很好地用于制备诊断肝癌等的诊断试剂中。

Description

一种抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体、其制备方法及应用。

背景技术

肿瘤特异性糖链是目前肿瘤领域的研究热点之一，肿瘤相关的蛋白有80%是糖蛋白，多种糖脂亦与肿瘤密切相关。目前，国内外存在的针对肿瘤特异性鞘糖脂的抗体较少，各大相关研究机构均在努力开发肿瘤特异性鞘糖脂抗体，已成为一个潜在热点。抗原抗体反应的特异性决定了针对肿瘤特异性靶标抗原的单克隆抗体会优先与相应的肿瘤组织结合，而不会识别正常组织。针对人体内岩藻糖苷酶（AFU）的测定受假阴性和假阳性影响较大，利用鞘糖脂Globo-H单克隆抗体可以在底物水平上准确地鉴定所测组织是否病变，减少假阳性和假阴性结果。单克隆抗体正是凭其特异性和敏感性成为肿瘤诊断的新的高灵敏性的方法。

人鞘糖脂Globo-H是多种肿瘤细胞均会表达的一种鞘糖脂，它是作为多种肿瘤的特异性抗原存在于肿瘤细胞表面，其生物合成通路是由前体鞘糖脂SSEA3经岩藻糖基转移酶FUT1和/或FUT2作用在其末端半乳糖残基上以α1-2键位连接了一个岩藻糖基团而合成。自从Hakomori报道了糖基化在肿瘤中重要的作用以来，肿瘤细胞中鞘糖脂的表现受到人们越来越多的关注，之后翁启惠等发现肿瘤中存在高表达的鞘糖脂Globo-H，可以作为诊断治疗的一个潜在有效靶点，对Globo-H的研究也成为一个热点，鉴于Globo-H大都在肿瘤细胞表面表达，因而，鞘糖脂Globo-H可以作为肿瘤生物诊断的一种理想的标靶抗原。

目前，尚无针对人鞘糖脂Globo-H的单克隆抗体，因此制备抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体对于肿瘤诊断具有重要价值。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体、其制备方法及应用。所述单克隆抗体特异性结合人鞘糖脂Globo-H，因此能够用于与人鞘糖脂Globo-H相关的肿瘤的诊断。

本发明包括以下内容：

在第一方面，本发明提供一种抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体，特异性结合肝癌患者肿瘤组织中的鞘糖脂Globo-H。

在第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的单克隆抗体的方法，包括：

（1）从肝癌患者肿瘤组织中分离获得鞘糖脂Globo-H；

（2）纯化并富集获得的鞘糖脂Globo-H；

（3）用鞘糖脂Globo-H免疫小鼠，获得分泌抗人鞘糖脂Globo-H抗体的小鼠脾细胞；

（4）将所述小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；

（5）利用得到的杂交瘤细胞分泌抗人鞘糖脂Globo-H的单克隆抗体。

作为本发明的优选，所用小鼠为BALB/c小鼠。

在第三方面，本发明提供一种杂交瘤细胞，其分泌如第一方面所述的抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体。

在第四方面，本发明提供一种获得分泌抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，包括：

（1）从肝癌患者肿瘤组织中分离获得鞘糖脂Globo-H；

（2）纯化并富集获得的鞘糖脂Globo-H；

（3）用鞘糖脂Globo-H免疫小鼠，获得分泌抗人鞘糖脂Globo-H抗体的小鼠脾细胞；

（4）将所述小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到分泌抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体的杂交瘤细胞。

作为本发明的优选，所用小鼠为BALB/c小鼠。

在第五方面，本发明提供一种肝癌诊断试剂，包括如第一方面所述的抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体。

在第六方面，本发明提供如第一方面所述的抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体在制备肝癌诊断试剂中的应用。

本发明的有益效果为：本发明通过从肝癌患者肿瘤组织中分离获得鞘糖脂Globo-H，并免疫小鼠产生分泌抗人鞘糖脂Globo-H抗体的小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞产生抗人鞘糖脂Globo-H的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体与人鞘糖脂Globo-H的特异性结合能力强，能够很好地用于制备诊断肝癌等的诊断试剂中。

附图说明

图1显示分离得到的鞘糖脂Globo-H（肝癌组中标准品条带下出现的迁移率最慢的条带），其中薄层层析板购自德国默克公司，溶剂系统的试剂来自德国默克公司，泳道1和5是中性鞘糖脂的标准品，泳道3和4是来自肝癌病人肿瘤组织的中性鞘糖脂，泳道2是来自病人肝瘤癌旁组织的中性鞘糖脂，显示鞘糖脂Globo-H在肝癌病人肿瘤组织中有特异性高表达。

图2显示抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体的纯化SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

实施例中生化试剂购自默克公司，薄层层析板购自默克公司，所采用鞘糖脂Globo-H得自于肝癌患者肿瘤组织，6-8周雌性BALB/c（H-2^d）小鼠购自上海斯莱克公司，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。

实施例1鞘糖脂Globo-H的分离纯化和富集

（1）肝癌患者肿瘤组织中鞘糖脂Globo-H的提取：

取肝癌组织样本研磨破碎，加溶剂氯仿：甲醇（1：1，v/v）并超声震荡一小时后离心取上清液，反复四次，再加入异丙醇：己烷：一级水（55:25:20，v/v/v）超声震荡一小时后离心取上清，反复四次，离心干燥器干燥。

（2）肝癌患者肿瘤组织中中性脂质的分离：

先将SephadexA25凝胶液装柱，后用氯仿：甲醇：水（30:60:8，v/v/v）溶液平衡，之后将（1）步中干燥的脂质样品加入层析柱，用氯仿：甲醇：水（30:60:8，v/v/v）洗脱获得中性糖脂并收集获得中性糖脂，后离心干燥器干燥。

（3）肝癌患者肿瘤组织中中性鞘糖脂分离：

先用氯仿：甲醇（98：2，v/v）溶液平衡60号的硅胶柱层析，将（2）步中干燥的中性脂质上样，后用100mL氯仿：甲醇：水（10：10：2.5，v/v/v）洗脱并收集获得中性鞘糖脂，氮气干燥。

（4）肝癌患者肿瘤组织中Globo-H的纯化富集：

用0.1mL的甲醇：氯仿（1:1，v/v）溶解（3）步中干燥的中性鞘糖脂，后在薄层层析板上点样，后放入氯仿：甲醇：水（60:35:8，v/v/v）的缓冲体系内，静置至层析结束，肝癌组将含六糖条带的硅胶刮下，并反复操作富集。对分离得到的鞘糖脂Globo-H进行考马斯亮蓝染色检测如图1所示。

实施例2鞘糖脂Globo-H免疫小鼠

腹腔50μg鞘糖脂Globo-H联合0.5mL弗氏完全佐剂注射小鼠，2周后50μg鞘糖脂Globo-H联合0.5ml弗氏不完全佐剂再次免疫小鼠，4周后400μg鞘糖脂Globo-H经腹腔免疫小鼠。眼眶后眦静脉取血，-20℃冻存血清，4天后处死小鼠取脾脏用于细胞融合。

实施例3鞘糖脂Globo-H免疫诱导特异性血清抗体：

三次鞘糖脂Globo-H免疫小鼠后，在其血清诱导的抗鞘糖脂Globo-H的抗体采用常规ELISA方法检测：以15μg/mL鞘糖脂Globo-H溶解于包被液中（0.1NaCO3、PH9.6、0.1%BSA）4℃包被96孔酶标板中，以5%牛奶-PBS封闭；依次加1：100稀释血清，HRP标记的羊抗鼠IgG、OPD、显色终止，测OD490nm，显示成功诱导特异性血清抗体。

实施例4抗鞘糖脂Globo-H单克隆抗体的制备

1、细胞融合

（1）制备饲养细胞：取未免疫的同一品系的BALB/c小鼠摘眼球放血，置于EP管中，其血清做阴性对照，脱颈椎处死小鼠，在超净工作台内剪开小鼠腹腔，吸取少许无血清RPMI-1640培养基注入小鼠腹腔，反复吹打4-5次，吸出腹腔内细胞悬液，其主要含巨噬细胞，1500rpm离心5分钟，弃去上清加入HAT培养基，制成饲养细胞悬液置于CO₂培养箱中培养，留做细胞融合使用。

（2）小鼠P2-X63-Ag8.653（简称653）淋巴瘤细胞的准备：融合前两周用8-氮鸟嘌呤（8-AG）对653细胞（由苏州大学生物医学研究院提供）作选择培养。融合当天收集处于对数生长期的细胞，活率大于95%的653细胞，用无血清培养基RPMI-1640洗涤细胞一次，取3×10⁷的653细胞备用。

（3）小鼠脾细胞制备：选择血清抗体效价最高小鼠，脱颈椎处死，超净工作台无菌取脾，研磨并制成单细胞悬液，用无血清RPMI-1640培养基悬浮，收集2×10⁸细胞备用。

（4）细胞融合：使用常规方法融合细胞，将653细胞和小鼠脾细胞以1:5～1:10的比例融合，无血清RPMI-1640洗涤2-3次，离心弃去上清，轻轻弹击离心管底部，是细胞沉淀疏松，将37℃预热的1mL50%PEG于1分钟内缓缓滴加入细胞沉淀中，边加边缓缓均匀摇动离心管，沿管壁滴加液滴，静置融合90秒钟，之后在2分钟内加上1mL无血清RPMI-1640，1分钟内加上1mL无血清RPMI-1640，再在30秒内加无血清培养基RPMI-1640 1mL，再缓缓加入无血清培养基RPMI-1640 30-40mL，低速离心6分钟，弃上清，20%的小牛血清HAT培养液轻轻重悬沉淀细胞，再滴加入铺有饲养细胞的96孔培养版中，每孔100μL。放于37℃，5%CO₂培养箱培养。待融合之后，将融合的细胞在HAT培养基中培养14天，人后换用HAT培养基培养，等两周后逐步换成20%胎牛血清的RPMI-1640培养基。

2、阳性杂交瘤细胞筛选

等杂交瘤细胞铺满培养版孔底1/4的部分时，去培养上清液，ELISA方法检测阳性克隆。连续检测OD值逐渐升高或维持同一水平，并且其值大于阴性对照2倍或判定为阳性。保留好阳性孔，并及时克隆化。

3、杂交瘤细胞克隆化

克隆的前一天按前面所述方法制备1×10⁵/mL小鼠腹腔巨噬细胞，每孔加100μL。选择阳性孔的细胞技术并以有限稀释法克隆：取500个活细胞悬浮于10mL培养液中（50/mL），按每孔100μL接种于96孔中，放在37℃，5%CO₂培养箱中培养，于第五天补加一次培养液，之后每三天换液一次。待克隆长大后铺满培养孔底1/3-1/4再次抗体检测，连续进行克隆化直至所检测的克隆阳性率达100%，选择阳性反应最强的克隆株扩大培养并冻存。

4、阳性杂交瘤细胞株扩大培养及冻存

将阳性单克隆杂交瘤细胞一次转入24孔，6孔培养板，于RPMI-1640完全培养基中扩大培养，待细胞铺满培养孔底部时，收集后10分钟1500rpm离心，弃掉上清，含10%DMSO的完全培养液的冻存液稀释，分装入1mL的冻存管，4℃放置30分钟之后在于-20℃放置2小时，-70℃放置1个小时，最后转移至液氮中冻存。一代、二代、三代的细胞克隆均以此法冻存于液氮中。

实施例5抗鞘糖脂Globo-H单克隆抗体的制备和纯化

采用体内杂交瘤培养法在小鼠腹水中收集高效价高纯度的抗Globo-H的单克隆抗体，取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注入降植烷0.5mL，一周后腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁷个/只，之后8-10天开始收集腹水，ELISA法检测阳性率。离心取腹水上清并加入等体积的饱和(NH4)₂SO4溶液混匀并置于40℃水浴4-6小时，离心弃上清。0.01mol/L PBS(PH=7.4)溶解沉淀物，透析去除(NH4)₂SO4，遵照Pharmacia公司的Protein G亲和层析法进行单克隆抗体纯化，步骤例下：先用5CV甘氨酸-盐酸液（20mmol/L，PH=2.7）再生层析柱，在用5CV磷酸盐平衡缓冲液（PBS 20mmol/L，PH=7.0）平衡层析柱，流速1.0mL/min；后将预处理好的腹水以1.0mL/min的流速上样，以1.0mL/min的流速用平衡缓冲液冲洗层析柱；之后用甘氨酸-盐酸（20mmol/L，PH2.7）洗脱液以1.0mL/min洗脱，收集蛋白洗脱液并立即用1mol/L Tris-HCL(PH=9.0)调节至中性；然后PBS（PH=7.0）透析后用紫外分光光度计测定单克隆抗体的含量，浓度计算公式为：单克隆抗体含量（mg/mL）=OD280×1.55-OD260×0.76。同时用SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，使用浓度10%的分离胶，浓度5%的浓缩胶，分别于还原状态和非还原状态下处理样品，上样量10mL，恒压电泳其中浓缩胶150V，分离胶120V，电泳结束后考马斯亮蓝R250染色，在通过凝胶成像扫描系统鉴定纯度（如图2所示）。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体，特异性结合肝癌患者肿瘤组织中的鞘糖脂Globo-H。

2.一种制备如权利要求1所述的单克隆抗体的方法，包括：

（1）从肝癌患者肿瘤组织中分离获得鞘糖脂Globo-H；

（2）纯化并富集获得的鞘糖脂Globo-H；

（3）用鞘糖脂Globo-H免疫小鼠，获得分泌抗人鞘糖脂Globo-H抗体的小鼠脾细胞；

（4）将所述小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；

（5）利用得到的杂交瘤细胞分泌抗人鞘糖脂Globo-H的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所用小鼠为BALB/c小鼠。

4.一种杂交瘤细胞，其分泌如权利要求1所述的抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体。

5.一种获得分泌抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，包括：

（1）从肝癌患者肿瘤组织中分离获得鞘糖脂Globo-H；

（2）纯化并富集获得的鞘糖脂Globo-H；

（3）用鞘糖脂Globo-H免疫小鼠，获得分泌抗人鞘糖脂Globo-H抗体的小鼠脾细胞；

（4）将所述小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到分泌抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体的杂交瘤细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所用小鼠为BALB/c小鼠。

7.一种肝癌诊断试剂，包括如权利要求1所述的抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体。

8.如权利要求1所述的抗人鞘糖脂Globo-H单克隆抗体在制备肝癌诊断试剂中的应用。