CN102443598A

CN102443598A - 利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法

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Publication number: CN102443598A
Application number: CN2010105077425A
Authority: CN
Inventors: 王鹏; 李磊; 原静
Original assignee: TIANJIN SAIKE RUIDE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: TIANJIN SAIKE RUIDE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2012-05-09

Abstract

本发明涉及一种利用糖基转移酶大量制备Globo-H六糖的方法，即利用分子生物学技术构建糖基转移酶和糖核苷酸差向异构酶表达载体，转化入大肠杆菌进行过量表达，目的蛋白进行粗略纯化后在体外催化寡糖的合成。Globo-H是目前广泛应用于乳腺癌、前列腺癌疫苗的试剂，使用本发明的方法合成Globo-H可以大大降低其生产成本。

Description

利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，具体地说，涉及一种生物酶法大量制备寡糖Globo系列抗原的方法。

背景技术

糖结构的表达异常是肿瘤表型的标志之一，这些异常包括自然糖链的上调和下调表达，胚胎组织专属糖结构的异常表达。这些肿瘤相关糖链结构可以作为细胞癌变的诊断标记。由于肿瘤细胞携带的糖链与正常细胞相异，基于肿瘤异常糖链结构的靶向免疫激活具有理论可行性。这一理论已经付诸抗肿瘤糖疫苗的开发实践，并且在早期临床实验中得到了令人可喜的成果。人们在肿瘤细胞上发现了几种常见的糖链结构，包括Tn抗原、T抗原、唾液酸化Lex抗原、Ley抗原、神经节苷脂(gangliosides)、Globo-H和聚唾液酸(polysialic acid，PSA)，其中Globo-H通常与晚期乳癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌相关。

这些异常糖链结构已经作为用于癌症免疫治疗的抗肿瘤糖疫苗的开发目标，其中几种疫苗目前正进行临床评估并表现出一定的作用。例如sTn-KLH缀合物(KLH是一种常用的疫苗缀合蛋白)和激素联合给药比激素单独给药有效延长了癌症病人的生存时间；对前列腺癌症病人进行的Globo-H缀合物与免疫补体QS-21联合给药治疗已经进入I期临床，研究证明是安全的，并可以有效诱导高滴度的抗Globo-H特异IgM型抗体。由Danishefsky及合作者开发的包含Globo-H，Ley和Tn的三抗原疫苗在临床前试验中可以激发抗此三种抗原的IgG 合物(KLH是一种常用的疫苗缀合蛋白)和激素联合给药比激素单独给药有效延长了癌症病人的生存时间；对前列腺癌症病人进行的Globo-H缀合物与免疫补体QS-21联合给药治疗已经进入I期临床，研究证明是安全的，并可以有效诱导高滴度的抗Globo-H特异IgM型抗体。由Danishefsky及合作者开发的包含Globo-H，Ley和Tn的三抗原疫苗在临床前试验中可以激发抗此三种抗原的IgG型抗体。

Globo系列抗原结构如下，由于该糖很难在自然界中提取，只能通过合成手段获得。Danishefsky等最先报道了化学方法合成Globo-H，随后也出现了不同的化学合成方法，然而都无法避免化学合成固有的繁琐、总效率低的缺陷。

实践检验，酶法合成被证明是化学合成的有效替代途

。与化学方法相此，酶法合成在更为有效进行高度空间和立体化学特异性的糖基化反应方面具有明显的优势。用于糖合成的酶主要是糖基转移酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一个可以用于大量制备包括Globo-H在内的Globo系列抗原的方法，该方法利用特定的糖基转移酶进行。使用本发明的方法，能够大量制备Globo系列抗原及其衍生物。

本发明所涉及的利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，由下述步骤组成：

(1).克隆表达载体的构建：

克隆出α1，3半乳糖基转移酶(LgtC)使用酶切位点NdeI和BamHI构建入载体pET15b，命名为v-LgtC；克隆出β1，3氮乙酰半乳糖胺转移酶(LgtD)使用LIC的方法构建入载体pMCSG7，命名为v-LgtD；克隆α1，2岩藻糖基转移酶(WbsJ)使用酶切位点BamHI和XhoI构建入载体pGEX-4T-1，命名为v-WbsJ、克隆UDP-GlcNAc/Glc 4位差向异构酶(Gne2)使用酶切位点NdeI和BamHI构建入载体pET15b，命名为v-Gen2；

(2).酶的过量表达与纯化：

上述表达载体分别转化入大肠杆菌形成表达特异酶的工程菌株。

阳性克隆工程菌株接种于LB培养基中，37℃培养10-12小时后转接入新的LB培养基中，37℃继续培养2-4小时，摇床转速为200-250转/分钟；当方发酵液浓度达到OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入IPTG诱导蛋白表达20小时，温度为25℃，摇床转速为200-250转/分钟；菌体通过离心收集，经过细胞破碎后使用亲和层析纯化目的蛋白；

其中LB培养基的配方为：10g/L蛋白胨；5g/L酵母粉；10g/L氯化钠；

其中LgtC，LgtD，Gne2使用镍离子亲和树脂纯化；纯化使用平衡缓冲液为20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，5mM咪唑；清洗缓冲液为20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，25mM咪唑；洗脱缓冲液为20mMTris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，250mM咪唑；

其中WbsJ使用GST树脂纯化；纯化使用平衡缓冲液为20mM磷酸缓冲液，pH7.4；洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，pH8，15mM的还原型谷胱甘肽；

(3).Globo系列抗原的大量合成与纯化

以乳糖为底物，以等物质的量的糖核苷酸UDP-Glc为糖基供体，反应液中加入终浓度为5mM的MnCl₂，在差向异构酶Gne2和糖基转移酶LgtC的作用下合成Gb3三糖，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后，反应液通过阴离子交换树脂去除反应生成的UDP，与活性炭混合；混合后用10体积的水洗去无机盐等分子，然后用20体积3％的乙醇洗去没有反应的乳糖，最后用20％的乙醇洗脱Gb3即可得到纯度＞98％的Gb3三糖；

Gb4、Gb5和Globo-H的制备同上，每个糖的制备均以前一个糖为底物，纯化同样使用活性炭，但洗脱寡糖所使用的乙醇浓度不同；

优选的，步骤(3)中所述的反应pH值是7.5；

优选的，步骤(3)中所述的反应温度是37℃；

优选的，步骤(3)中所述的反应时间是是10-15小时；

使用步骤(3)中所述的反应合成Globo-H可达到65％以上的产率；

本发明所涉及的利用糖基转移酶大量制备包括Globo-H在内的Globo系列抗原的方法，充分利用酶催化反应的的高度化学结构和立体结构选择性，避开了化学方法繁琐的合成过程，大大降低了Globo系列抗原大量合成的成本。使用该方法可大量制备Globo系列抗原及衍生物，这些衍生物能够

接连接到特定蛋白上作为乳腺癌、前列腺癌等的疫苗。

附图说明

图1是构建载体图谱

图2是Globo系列抗原体外合成方法

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不意于限制本发明的保护范围。

实施例1：Gb3-OBn的制备

Lac-OBn(432mg，1mmole)，UDP-Glc(565mg，1mmole)加入到250mL三角瓶中，加入20mM Tris-HCl缓冲液150mL，加入终浓度为10mM氯化锰，最后加入20单位的Gne2和50单位的LgtC，37℃反应10小时后过离子交换除去UDP等，最后使用活性炭纯化，得白色固体554mg，收率：93％制备得到Gb3-OBn的数据：

分子式：C₂₅H₂₈O₁₆

分子量：594

形状：白色粉末

图谱数据：¹H NMR(400MHz，D₂O)：δ7.43-7.36(m，5H)，4.89(d，J＝4.1Hz，1H；d，J＝11.4Hz，1H)，4.71(d，J＝11.4Hz，1H)，4.51(d，J＝8.1Hz，1H)，4.46(d，J＝8.1Hz，1H)，4.31(t，J＝6.5Hz，1H)，3.98-3.48(m，16H)，3.29(t，J＝8.9Hz，1H)；¹³C NMR(100MHz，D₂O)：δ136.7，129.02，128.96，128.7，103.5，101.2，100.5，78.8，77.6，75.7，75.1，74.7，73.2，72.4，72.3，71.7，71.1，71.0，69.4，69.1，68.8，62.7，60.7，60.6，60.3.

实施例2：Gb4-OBn的制备

Gb3-OBn(594mg，1mmole)，UDP-GlcNAc(610mg，1mmole)加入到250mL三角瓶中，加入20mM Tris-HCl缓冲液150mL，加入终浓度为10mM氯化锰，最后加入20单位的Gne2和50单位的LgtD，37℃反应10小时后过离子交换除去UDP等，最后使用活性炭纯化，得白色固体729mg，收率：91％制备得到Gb4-OBn的数据：

分子式：C₃₅H₅₁NO₂₁

分子量：797

形状：白色粉末

图谱数据：¹H NMR(500MHz，D₂O)：δ7.50-7.40(m，5H)，5.01(d，J＝11.6Hz，1H)，4.85(d，J＝4.1Hz，1H)，4.71(d，J＝11.6Hz，1H)，4.56(d，J＝8.6Hz，1H)，4.49(m，1H)，4.35(m，1H)，4.10-3.64(m，22H)，3.29(dd，J＝8.1Hz，9.1Hz，1H)，2.13(s，3H)；¹³C NMR(125MHz，D₂O)：δ136.86，128.90，128.89，128.63，103.47，103.29，101.27，100.63，79.14，78.93，77.57，75.58，75.14，75.01，74.74，73.14，72.44，71.68，71.18，71.08，70.61，69.15，68.03，67.82，61.22，60.74，60.53，60.42，52.86，22.50；

实施例3：Gb5-OBn的制备

Gb4-OBn(797mg，1mmole)，UDP-Glc(565mg，1mmole)加入到250mL三角瓶中，加入20mM Tris-HCl缓冲液150mL，加入终浓度为10mM氯化锰，最后加入20单位的Gne2和50单位的LgtD，37℃反应10小时后过离子交换除去UDP等，最后使用活性炭纯化，得白色固体846mg，收率：88％制备得到Gb5-OBn的数据：

分子式：C₃₉H₆₁NO₂₆

分子量：959

形状：白色粉末

图谱数据：¹H NMR(500MHz，D₂O)：δ7.47-7.38(m，5H，Ph)，4.91(d，J＝11.7Hz，1H，PhCH₂)，4.88(d，J＝3.8Hz，H-1″′)，4.74(d，J＝11.8Hz，1H，PhCH₂)，4.66(d，J＝8.6Hz，1H，H-1)，4.52(d，J＝8.1Hz，1H，H-1)，4.48(d，J＝7.8Hz，1H，H-1)，4.42(d，J＝7.7Hz，1H，H-1)，4.35(t，J＝6.3Hz，1H)，4.22(d，J＝1.7Hz，1H)，4.15(d，J＝2.7Hz，1H)，4.03(m，1H)，4.01(m，1H)，3.97(dd，J＝12.5，1.6Hz，1H)，3.94(dd，J＝10.1，2.9Hz，1H)，3.91-3.85(m，4H)，3.82(d，J＝4.4Hz，1H)，3.79(d，J＝4.4Hz，1H)，3.78-3.69(m，6H)，3.68-3.65(m，3H)，3.64-3.61(m，2H)，3.60-3.53(m，4H)，3.50(dd，J＝9.9，7.9Hz，1H)，3.32(t，J＝8.6Hz，1H)，1.99(s，3H，CH₃CONH)；¹³C NMR(125MHz，D₂O)：δ175.2，136.6，128.8，128.76，128.5，104.8，103.3，103.0，101.0，100.4，79.6，78.8，78.7，77.3，75.5，75.0，74.9，74.6， 73.0，72.5，72.2，71.5，70.9，70.6，70.3，69.0，68.6，68.0，67.6，61.4，61.0，60.98，60.4，60.3，60.1，59.4，51.5，22.3；

实施例4：Globo-H-OBn的制备

Gb5-OBn(959mg，1mmole)，UDP-Glc(587mg，1mmole)加入到250mL三角瓶中，加入20mM Tris-HCl缓冲液150mL，加入终浓度为10mM氯化锰，最后加入50单位的WbsJ，37℃反应10小时后过离子交换除去GDP等，最后使用活性炭纯化，得白色固体1003mg，收率：90％

制备得到Globo-H-OBn的数据：

分子式：C₄₅H₇₁NO₃₀

分子量：1106

形状：白色粉末

图谱数据：¹H NMR(500MHz，D₂O)：δ7.46-7.38(m，5H，Ph)，5.20(d，J＝4.1Hz，1H，H-1″″″)，4.91(d，J＝11.7Hz，1H，PhCH₂)，4.86(d，J＝3.9Hz，1H，H-1″′)，4.74(d，J＝11.6Hz，1H，PhCH₂)，4.59(d，J＝7.7Hz，1H，H-1)，4.53(d，J＝7.4Hz，1H，H-1)，4.51(d，J＝6.7Hz，1H，H-1)，4.48(d，J＝7.7Hz，1H，H-1)，4.35(t，J＝6.4Hz，1H)，4.22-4.18(m，2H)，4.07(d，J＝2.1Hz，1H)，4.00(d，J＝3.0Hz，1H)，3.98-3.94(m，3H)，3.91(dd，J＝10.6，2.8Hz，1H)，3.88-3.84(m，3H)，3.83-3.79(m，3H)，3.77-3.72(m，6H)， 3.70-3.65(m，4H)，3.64-3.60(m，4H)，3.58-3.53(m，3H)，3.33(t，J＝8.6Hz，1H)，2.01(s，3H，CH₃CONH)，1.19(d，J＝6.6Hz，3H，CH₃ of fucose)；¹³CNMR-DEPT(125MHz，D₂O)：δ128.8，128.77，128.5，104.0，103.3，102.1，101.0，100.5，99.3，78.9，78.4，77.2，76.4，76.2，75.5，75.1，74.9，74.7，74.6，73.6，73.0，72.7，71.9，71.5，70.9，70.7，70.2，69.6，69.2，69.17，68.5，68.1，67.9，66.8，61.0，61.00，60.4，60.37，60.1，51.7，22.3，15.4。

Claims

1.一种利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，由下述步骤组成：

(1).酶表达载体的构建：

克隆出α1，3半乳糖基转移酶(LgtC)、β1，3氮乙酰半乳糖胺转移酶(LgtD)、α1，2岩藻糖基转移酶(WbsJ)、UDP-GlcNAc/Glc 4位差向异构酶(Gne2)，经酶切后插入大肠杆菌载体，分别命名为v-LgtC、v-LgtD、v-WbsJ、v-Gne2；

(2).酶的过量表达与纯化；

(3).Globo系列抗原的大量合成

以乳糖为底物，以等物质的量的糖核苷酸UDP-Glc为糖基供体，反应液中加入终浓度为5mM的MnCl₂，在差向异构酶Gne2和糖基转移酶LgtC的作用下合成Gb3三糖，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后，

反应液通过阴离子交换树脂去除反应生成的UDP；在反应液中加入等物质的量的UDP-GlcNAc作为下一步反应的糖基供体，同时加入终浓度为5mM的MnCl₂，在差向异构酶Gne2和糖基转移酶LgtD的作用下合成Gb4四糖，反应使用与第一步反应相同的方法检测并处理；在反应液中加入等物质的量的糖核苷酸UDP-Glc为糖基供体，并加入终浓度为5mM的MnCl₂，在差向异构酶Gne2和糖基转移酶LgtD的作用下合成Gb5五糖，反应使用与第一步反应相同的方法检测并处理；在反应液中加入等物质的量的糖核苷酸GDP-Fuc为糖基供体，并加入终浓度为5mM的MnCl₂，在糖基转移酶WbsJ的作用下合成Gb5五糖，反应以薄板层析监测

至反应完全；

(4).Globo系列抗原的纯化

上述反应液通过阴离子交换树脂，去除带有电荷的化合物，然后以活性炭纯化得到最终产品。

2.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，其特征是，步骤(1)中所述的α1，3半乳糖基转移酶是来源于革兰氏阴性细菌Neisseria meningitidis的LgtC。

3.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，其特征是，步骤(1)中所述的β1，3氮乙酰半乳糖胺转移酶是来源于Haemophilusinfluenza Rd的LgtD。

4.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，其特征是，步骤(1)中所述的α1，2岩藻糖基转移酶是来源于大肠杆菌O128的WbsJ。

5.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，其特征是，步骤(1)中所述的UDP-GlcNAc/Glc 4位差向异构酶(Gne2)是来源于大肠杆菌O86的Gne2。

6.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，其特征是，步骤(1)中所述的载体为pET15b、pMCSG7、pGEX-4T-1等大肠杆菌表达载体及在此基础上改造的载体。

7.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，其特征是，步骤(1)中所述的β1，3氮乙酰半乳糖胺转移酶(LgtD)为双功能酶。

8.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，其特征是，步骤(2)中所述的大肠杆菌表达菌株为BL21(DE3)或其他含有DE3特性的大肠杆菌菌株。

9.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，其特征是，步骤(2)中所述的IPTG浓度：对载体pET15b或者pMCSG7及在其基础上改造的载体为0.4mM；对载体pGEX-4T-1及在其基础上改造的载体为1mM。

10.如权利要求1中所述利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法，其特征是，步骤(3)中所述的反应pH值均为7.5，使用Tris-HCl缓冲液调节。