WO2008078614A1

WO2008078614A1 - ラクト－ｎ－ビオースｉ及びガラクト－ｎ－ビオースの製造方法

Info

Publication number: WO2008078614A1
Application number: PCT/JP2007/074362
Authority: WO
Inventors: Motomitsu Kitaoka; Mamoru Nishimoto
Original assignee: Incorporated Administrative Agency National Agriculture And Food Research Organization
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2008-07-03
Also published as: JP2008154495A; JP4915917B2; EP2100967A1; KR101185788B1; KR20090087935A; EP2100967B1; US8173399B2; EP2100967A4; US20100120096A1

Abstract

　安価でかつ簡便にラクト−Ｎ−ビオースＩ及びガラクト−Ｎ−ビオースを製造する方法を提供する。　Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン、リン酸、ラクト−Ｎ−ビオースホスホリラーゼ（ＥＣ　２．４．１．２１１）及びＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ（ＥＣ　５．１．３．２）の存在下で、（ｉ）糖質原料と、該糖質原料を加リン酸分解しα−グルコース−１−リン酸を生じる酵素との組合せ；並びに（ｉｉ）α−グルコース−１−リン酸をＵＤＰ−グルコースに変換する酵素及びＵＤＰガラクトースをガラクトース−１−リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及び／又はα−グルコース−１−リン酸及びＵＤＰ−ガラクトースをそれぞれＵＤＰ−グルコース及びα−ガラクトース−１−リン酸に変換する酵素（ＵＤＰ−Ｇｌｙ生成酵素）とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ラクト−Ｎ−ビオースＩ又はガラクト−Ｎ−ビオースの製造方法。

Description

ラクト一 N—ビオース I及ぴガラクト一N—ビオースの製造方法

技術分野

本発明は、酵素法を用いてラタト _N—ビオース I及びガラクト一 N—ビオースを製造する方法に関する。明

背景技術

β 1 , 3—ガラクトシドであるラクト一Ν—ビオース I (G a l ]3 1— 3G 1 c NA c ) 及びガラクト一 N—ビオース（G書a l j3 1— 3 G a l NAc) は生理活性糖鎖の中によく見られる構造であり、機能性糖などとしての食品産業上の利用のほか、酵素、レクチンの基質や阻害剤、生体構成糖など、医薬品、試薬として利用することもできる。

これらの化合物の従来の製造法としては、例えばラタトースと N—ァセチルダルコサミンとを含有する基質を出発原料として、ブタ睾丸起源の J3—ガラクトシダーゼとノくチノレス · サーキュランス (B a c i l l u s c i r c u l a n s) の生産する i3—ガラクトシダーゼとを順次的に反応させることを特徴とするラクトー N—ビオース Iの製造法（特許文献 1)、並びに糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有する微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞を利用した複合糖質の生産方法（特許文献 2) が知られている。しかしながら、前者は反応効率が低く、後者は発酵法によりこれらの糖を製造する方法であることから、製造される化合物はどうしてもコスト高になり、いずれも実用性を欠いていた。

特許文献 3には、ラタト一N—ビオースホスホリラ一ゼの逆反応触媒活性を利用し、ガラクトース一 1一リン酸を原料として、ラクトー N—ビオース誘導体を合成可能であることが示唆されている。しかし、ガラクトース _ 1一リン酸が高価であるため実用的価値は無かった。

特許文献 1 特開平 6— 2538 78 特許文献 2 特開 2003— 1 8989 1

特許文献 3 特開 2005— 34 1 883 発明の開示

したがって、安価でかつ簡便にラクトー N—ビオース I及びガラクト一 N—ビオースを製造する方法に関するニーズが存在する。

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、酵素法によりラクトー N—ビオース I 及びガラクトー N—ビオースを製造する方法を完成した。

すなわち、本発明は以下を包含する。

(1) N—ァセチルダルコサミン、リン酸、ラクト一N—ビオースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 2 1 1 ; 1, 3 —ガラクトシル一 N—ァセチルへキソサミンホスホリラーゼ）及び U DP—グルコース一 4—ェピメラーゼ（EC 5.

1. 3. 2) の存在下で、

( i ) 糖質原料と、該糖質原料を加リン酸分解して α—グルコース一 1ーリン酸を生じる酵素（G 1 P生成酵素）との組合せ；並びに

( i i ) α—グルコース一 1—リン酸を UD Ρ_グルコースに変換する酵素及ぴ U DP—ガラクトースをひ一ガラクトース一 1—リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及び/又は α—グルコース一 1—リン酸及ぴ UD Ρ— ガラクトースをそれぞれ UD Ρ—グルコース及び α _ガラクトース一 1—リン酸に変換する酵素（UDP— G 1 y生成酵素）とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ラクト一N—ビオース Iの製造方法。

(2) ( i )の組合せが、スクロースとスクロースホスホリラーゼ（EC 2. 4.

1. 7) との組合せ、デンプン又はデキストリンとスホリラーゼ（EC 2.

4. 1. 1 )との糸且合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼ（E C 2.

4. 1. 20) との組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 49) 及びセロビオースホスホリラーゼ（E C 2. 4.

1. 20) との組合せ、ラミナリオリゴ糖とラミナリビオースホスホリラーゼ（E

C 2. 4. 1. 3 1 ) 及び又は ]3— 1 , 3オリゴグルカンホスホリラーゼ（E

C 2. 4. 1. 30) との組合せ、並びにトレハロースとトレハロースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 23 1) との組み合わせ、よりなる群から選択される 1つ以上の組合せである、上記（1) に記載の方法。

(3) ( i i ) の組合せが、 UD P—グルコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 2) と、 UDP—グルコース、 UDP—ガラクトース又はその混合物との組合せ；グルコース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) 及びガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 UTPとの組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7.

7.9)及びガラクトースー 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 UDP—グルコース及び又は UDP—ガラクトース及びピ口リン酸との組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフヱラーゼ（E C 2. 7. 7. 9) 及びガラクトース一 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 UT P及び UD P—グルコース及び/又は U DP—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；グルコース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラタトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフエラーゼの両活性を持つ酵素と、 UT Pとの組合せ；グルコース一 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース _ 1—リン酸ゥリジリルトランスフエラーゼの両活性を持つ酵素と、 UD P—グルコース及び又は UD P—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；並びにグルコース一 1―リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼとガラクトース一 1—リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UTP及び UDP—グルコース及び又は UDP—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ、よりなる群から選択される 1以上の組合せである、上記（1) に記載の方法。

(4) 酵素が担体に固定化されている、上記（1) 〜 (3) のいずれかに記載の方法。、

(5) N—ァセチルガラクトサミン、リン酸、ラクトー N—ビオースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 2 1 1) 及び UDP—グルコースー4—ェピメラーゼ

(EC 5. 1. 3. 2) の存在下で、

( i ) 糖質原料と、該糖質原料を加リン酸分解して α—グルコース一 1ーリン酸を生じる酵素（G I P生成酵素）との組合せ；並びに

( i i ) α—グルコース一 1—リン酸を UD P_グルコースに変換する酵素及び U DP—ガラクトースを α—ガラクトースー 1—リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及び又は α—グルコース一 1ーリン酸及び UD Ρ— ガラクトースをそれぞれ UD Ρ—グルコース及び α _ガラクトース一 1ーリン酸に変換する酵素（UDP— G 1 y生成酵素）とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ガラクト一N—ビオースの製造方法。

(6) ( i )の組合せが、スクロースとスクロースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 7) との組合せ、デンプン又はデキストリンとホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 1)との組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 20) との組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 49) 及びセロビオースホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 20) との組合せ、ラミナリオリゴ糖とラミナリビオースホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 3 1 ) 及び又は /3— 1， 3オリゴグルカンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 30) との糸且合せ、並びにトレハロースとトレハロースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 23 1) との組み合わせ、よりなる群から選択される 1つ以上の組合せである、上記（5) に記載の方法。

(7) ( i i ) の組合せが、 UD P—グルコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 2) と、 UDP—グルコース、

UDP—ガラクトース又はその混合物との組合せ；グルコース一 1ーリン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) 及びガラクト一ス一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 UTPとの組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（E C 2. 7.

7.9)及びガラクトース一 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2.

7. 7. 1 0) と、 UDP—グルコース及び又は UDP—ガラクトース及ぴピ口リン酸との組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（E

C 2. 7. 7. 9) 及びガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 UTP及び UDP—グルコース及ぴ又は

UD P—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；グルコース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトースー 1—リン酸ゥリジリルトランスフエラ一ゼの両活性を持つ酵素と、 UT Pとの組合せ；グルコース一 1―リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトースー 1ーリン酸ゥリジリルトランスフエラーゼの両活性を持つ酵素と、 UD P_グルコース及び又は UDP—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；並びにグルコース一 1—リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼとガラタトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UTP及び UDP—グルコース及び/又は UDP—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ、よりなる群から選択される 1以上の組合せである、上記（5) に記載の方法。

(8) 酵素が担体に固定化されている、上記（5) 〜（7) のいずれかに記載の方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-346470号の明細書及びノ又は図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、示された糖質原料及びこれを加リン酸分解する酵素から、本発明の方法により、ラクト一 N—ピオス Iが製造できることを示す薄層クロマトグラフィ一の結果である。

図 2は、スクロースを糖質原料とする本発明のラクト一N—ビオース Iの製造方法における、スクロースとラタトー N—ビオース Iの濃度の継時変化を示す。図 3は、本発明の酵素法の反応経路の概略図を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明は、酵素法による、ラグト _N—ビオース I又はガラクト _N—ビオースの製造方法に関する。

図 3に本発明の酵素法の反応経路の概略図を示す。図 3に示される通り、本発明の酵素法は、主に以下の 3つの酵素反応からなる：（1) 糖質原料の加リン酸分解反応；（2)グルコース一 1一リン酸のガラクトースー 1 _リン酸への変換反応、 (3) N—ァセチルダルコサミン又は N—ァセチルガラクトサミンからのラタト — N—ビオース I又はガラクトー N—ビオースの合成反応。

(1) の反応は、上記要素（ i ) として含まれる糖質原料と該糖質原料を加リン酸分解して α—グルコース一 1—リン酸を生じる酵素（G 1 P生成酵素）との組合せが、リン酸の存在下で反応して、グルコース— 1ーリン酸及び還元未糖が生じる反応である。上記要素（ i ) として用いられる糖質原料と係る酵素の組合せは、これに限定されるものではないが、スクロースとスクロースホスホリラーゼとの組合せ、デンプン又はデキストリンとホスホリラーゼとの組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼとの組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼとの組合せ、ラミナリオリゴ糖とラミナリビオースホスホリラーゼとの組合せ、トレハロースとトレハロースホスホリラーゼとの組合せのいずれか一つ、あるいはそれらの組合せを含む。より好ましい組合せは、スクロースとスクロースホスホリラーゼとの組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼとの組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼとの組合せ、デンプン又はデキストリンとホスホリラーゼとの組合せのいずれか一つ、あるいはそれらの組合せであり、最も好ましい組合せは、スクロースとスクロースホスホリラーゼとの組合せである。糖質原料の使用濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約 1〜約 l O O O gZLであり、より好ましくは約 1 0〜約 1 0 00 g/Lである。 G 1 P生成酵素の使用形態は特に限定されるものではなく、菌体抽出液、精製酵素、固定化酵素など種々のものを利用することができ、その使用量も特に限定されないが、例えば糖質原料 1 gあたり約 0. 1ュ-ット〜約 1 00ュニットで使用し得る。

またこの反応に関わるリン酸はいかなる起源のものであっても良い。反応系に加えるリン酸濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約 0. l mM〜約 1000 mM、より好ましくは約 1 mM〜約 1 00 mM程度である。

上記（2) の反応は、 UDP—グルコース一 4—ェピメラーゼの存在下、上記要素（ i i ) として含まれる酵素及びその補因子の組合せによって、上記（1) の反応で生じたグルコース一 1—リン酸を UD P— G 1 cに変換しかつ UD P -

G a 1をガラクト一ス一 1—リン酸へ変換する反応である。要素（ i i ) として使用する酵素は、 α—グルコース一 1—リン酸を UDP— グルコースに変換する酵素及び UD Ρガラクトースをガラクトース一 1一リン酸に変換する酵素の組合せ、又は α—グルコース一 1—リン酸及び UDP—ガラクトースをそれぞれ UD Ρ _グルコース及び α—ガラクトース一 1—リン酸に変換する酵素（UDP— G 1 y生成酵素）、のいずれか、あるいはその組合せを包含する。すなわち、要素（ i i ) として含まれる酵素又は酵素の組合せは、該酵素又は酵素の組合せによる反応を進行させるための補因子、及び UD P—グルコース一 4—ェピメラーゼの存在下で、 α—グルコース一 1—リン酸を α _ガラクトースー 1一リン酸へ変換する上記（2) の変換反応を進行させる。

したがって、本発明で意図する上記要素（ i i ) の組合せは、以下の組合せ：

UD P -グルコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフエラーゼ

(EC 2. 7. 7. 1 2) と、 UDP—グルコース、 UDP—ガラクトース又はその混合物との組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) 及びガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 UT Pとの組合せ；グルコース一 1

—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) 及びガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、

UDP—グルコース及び /又は UD P—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；グルコース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7.

9) 及びガラクトース一 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2.

7. 7. 1 0) と、 UT P及び UD P _グルコース及び/又は UD P—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；グノレコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフエラ一ゼとガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素（EC 2. 7. 7. 9及び EC 2. 7. 7. 1 0の各酵素には、グルコース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース _ 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を有するものも存在する）と、 UTP との組合せ；グルコース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース一 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UDP 一グルコース及び/ 又は UDP—ガラグトース及びピロリン酸との組合せ；並びにグ^/コース一 1一リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼとガラクトースー 1— リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UTP及び UDP 一グルコース及び Z又は UDP—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ、を包含する。上記要素（ i i ) の組合せが、 UD P—グルコース一へキソース— 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 2) と UDP—グルコース若しくは UD P—ガラクトース又はその両者との組合せ；グルコース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UT Pとの組合せ；グルコース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース _ 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UD P _グルコース及び又は U DP—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；あるいはグルコース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース一 1 _リン酸ゥリジリルトランスフエラーゼの両活性を持つ酵素と、 UT P及び UD P_グルコース及び Z又は UD P—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ、であることが好ましい。係る要素（ i i ) の組合せは、各組合せを単独で使用してもよいし、組合せて使用してもよい。

これらの酵素は特に限定されるものではなくいかなる起源の酵素を用いることも可能である。この酵素の使用形態は特に限定されるものではなく、菌体抽出液、精製酵素、固定化酵素など種々のものを利用することができ、その酵素の使用量も特に限定されないが、例えば糖質原料 1 gあたり約 1ュニット〜約 1 000ュニットで使用し得る。補因子の使用濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約 0. 0 1111^4〜約 1 001111^、より好ましくは約 0. 02 mM〜約 1 0 mMである。

UD P—グルコース一 4—ェピメラーゼは特に限定されるものではなくいかなる起源の酵素を用いることも可能である。 UD P—グルコース一 4—ェピメラーゼの使用形態は特に限定ざれるものではなく、菌体抽出液、精製酵素、固定化酵素など種々のものを利用することができ、その使用量も特に限定されないが、例えば糖質原料 1 gあたり約 0. 1ユニット〜約 1 00ユニットで使用し得る。上記（3) の反応は、ラタトー N—ビオースホスホリラーゼの存在下、 N—ァセチルダルコサミン又は N—ァセチルガラクトサミンを出発原料として、上記反応（2) によって生じたガラクトース一 1—リン酸からラクトー N—ビオース I 又はガラクトー N—ビオースを合成する反応である。出発原料として用いる N— ァセチルダルコサミン又は N_ァセチルガラタトサミンの濃度は特に限定されないが、好ましくは約 1 0 mM〜約 2 M、より好ましくは約 1 00 mM〜約 1 Mである。ラタトー N—ビオースホスホリラーゼの起源はいかなるものを用いても差し支えないが、好ましくは B i f i d o b a c t e r i um属細菌由来の酵素（例えば特開 2005— 34 1 883) を用いる。ラクト一 N—ビオースホスホリラーゼの使用形態は特に限定されるものではなく、菌体抽出液、精製酵素、固定化酵素など種々のものを利用することができる。ラクト一 N—ビオースホスホリラーゼの使用量も特に限定されないが、例えば糖質原料 1 gあたり約 0. 1ュニット〜約 1 00ユニットで使用し得る。，

本発明で使用される上記酵素の量は以下のように定義される：ラクト一 N—ビオースホスホリラーゼは、 0. 1 M MOP S緩衝液（pH7. 5)、 1 OmM ガラクトース一 1—リン酸、 1M N—ァセチルダルコサミンからなる反応液において 1分間に 1マイクロモルのリン酸を遊離する酵素量を 1ュニットとする； U

D P—グルコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼは、

0. 1M MOP S緩衝液（pH7. 5)、 1 OmM ガラクトース一 1一リン酸、

1 0 mM UDP—グルコース、 1 0mM 塩化マグネシウムからなる反応液において 1分間に 1マイク口モルのグルコース一 1—リン酸を生成する酵素量を 1 ユニットとする； UD P _グルコース一 4ーェピメラーゼは、 0. 1M MOP

S緩衝液（pH7. 5)、 5 mM UD P _ガラクトースからなる反応液において

1分間に 1マイクロモルの UD P—グルコースを生成する酵素量を 1ュニットとする；スクロースホスホリラーゼ等のホスホリラーゼ酵素は 0. 1M MOP S 緩衝液（pH7. 5)、 1 0 mM スクロース等の基質（糖質原料）、 1 0 mM リン酸水素ナトリゥムからなる反応液において 1分間に 1マイクロモルのダルコ一ス一 1—リン酸を生成する酵素量を 1ュニットとする；グルコース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトースー 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素は、 0. 1M MOP S緩衝液（pH7. 5)、 1 OmM . ピロリン酸、 l OmM UDP_グルコース、 1 0 mM 塩化マグネシゥムからなる反応液において 1分間に 1マイクロモルのグルコース一 1ーリン酸を生成する酵素量を 1ュニットとする。

上述した本発明の酵素は、任意の起源のものでよく、例えば細菌等の原核生物、酵母、菌類、動物等の真核生物由来のいずれの酵素であってもよく、また組換え酵素であってもよい。そのような酵素は市販のものを使用し得るか、または当業者に周知の方法、例えば天然から精製してもよいし、あるいは遺伝子組換え法によって取得し得る。例えば、遺伝子組換えによる方法では、本発明の酵素は、文献に記載されている若しくは公知の核酸又はタンパク質配列データベースに登録されている該酵素遺伝子の塩基配列を基に作製したプライマーを用いた P C Rによって適当なライブラリ一中の該酵素遺伝子に対応する mRNAから作製した c

DNAを増幅した後に、該 c DN Aを市販の遺伝子発現ベクターに組込み、該発現ベクターで大腸菌等の菌体を形質転換することによって、菌体中で生成される。生成された酵素は、硫安分画等の粗分画又は各種のカラムクロマトグラフィ一など、当業者に周知のタンパク質精製法によって精製できる。また、酵素を GST や H i s— t a gとの融合タンパク質として発現させることにより、その後の精製を容易にすることができる。

核酸又はタンパク質配列データベースは、例ぇば06 11 8 & ₁1 ¾:、 Un i G e n e、 EMB Lなどに掲載の配列を利用することができる。配列検索プログラムとして使用可能なものは、 B LAST、 F A S T Aなどのプログラムである。プライマーは、通常 1 7〜30塩基、好ましくは 1 9〜25塩基の長さを有する。目的の酵素遺伝子又は対応 c DN Aを铸型にし、その 5 '末端及び 3 '末端を含む上記長さのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを自動 DN A合成装置にて合成し、これを用いて P CRを実施することができる。 PCRは、目的の铸型 DN A及びプライマー並びに 4種の塩基（dNTP) 及び耐熱性 DNA ポリメラーゼの存在下、変性、アニーリング及び伸長を 1サイクルとして、通常

20〜40サイクルを実施することを含む。変性は、二本鎖 DNAを一本鎖に解離するための処理であり、通常 94°C、 1 5秒〜 5分間の処理を行う。ァニーリングは、一本鎖の铸型 DNAに、それに相補的なプライマーをアニーリングする処理であり、通常 55〜60°C、 30秒〜 2分間の処理を行う。伸長反応は、铸型 DNAに沿ってプライマーを伸長する反応であり、通常 72°Cで 30秒〜 1 0 分間の処理を行う。

开質転換は、例えば、 S amb r o o kら、 Mo l e c u l a r C l o n i n g , A L a b o r a t o r y Ma n u a l (1 989), C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s sに言己載されるような技術を使用して実施できる。

本発明の酵素はまた、上記の原核生物細胞又は真核生物細胞から直接精製してもよい。細胞破壊液を調製し、遠心分離、硫安分画、透析、各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ二ティクロマトグラフィーなど）、電気泳動、限外ろ過、結晶化などの酵素精製のための一般的な技術を適宜組合せて、目的の酵素を精製することができる。本発明に使用可能な酵素の形態は、精製酵素の他に、粗製酵素（例えば菌体抽出液、凍結乾燥体など）でもよい。粗製酵素を使用する場合には、本発明の上記反応を妨害する因子を含むべきではない。また本発明において、上記酵素は担体に固定化して使用することができる。本発明に使用し得る固定化酵素の調製方法には、担体結合法（物理的吸着法、ィォン結合法、共有結合法、生化学的特異結合法など）、架橋法及び包括法等の当業者に周知の方法が含まれる。担体結合法は、酵素を水不溶性の担体に結合させる方法であり、この場合、セルロース、デキストラン、ァガロースなどの多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、イオン交換樹脂などの合成高分子、多孔性ガラス、金属酸化物などの無機物質などを担体として使用できる。架橋法は官能基を 2個以上もつた試薬と酵素とを反応させて、酵素間で架橋化を行うことで固定化する方法であり、架橋試薬として、ダルタルアルデヒド、イソシアン酸誘導体、 N, N—エチレンビスマレイミド、ビスジァゾベンジシン、 N,

N_ポリメチレンビスョードアセトアミドなどが使用できる。包括法は天然高分子や合成高分子のゲルマトリックスの中に酵素を閉じ込める格子型等を含み、その際に用いる高分子化合物として、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂、デンプン、コンニヤク粉、ゼラチン、アルギン酸、カラギ一ナンなどが含まれる。

本発明の好適な実施形態によれば、上記反応に関わる全ての酵素を固定化したバイオリアクターカラムを用いて、固定化酵素リアクターとして反応を行うことも可能である。この場合、原料や補因子を含む水溶液を、例えば滞留時間 0 . 0 1時間〜 3 0 0時間の流速でカラムを連続的に通過させることによってラクト一 N—ビオース I及びガラクト一 N—ビオースの製造を実^ ¾し得る。

反応形態は特に限定されるものではないが、通常は水溶液又は緩衝液中で行われる。反応液の p Hは好ましくは 5〜9である。反応温度は特に限定されるものではないが、好ましくは 5 °C〜 8 0 °C、より好ましくは 2 0 °C〜6 0 °Cである。また反応時間は特に限定されるものではないが、 0 . 1〜3 0 0 0時間であることが好ましい。

本発明の一つの利点は、上記全ての酵素反応を、一容器中で又はバイオリアクターを用いて簡便かつ容易に実施できる点にある。さらに、上記（1 ) 〜（3 ) の反応は、該反応に関る酵素の性質に基づいて可逆的であり得るため、全体として単純な平衡反応とすることができ、上記反応（3 ) で生じるリン酸、及び上記反応（2 ) で生じる U D P—グルコース及ぴ Z又は U D P—ガラクトースをリサイタルすることできる。したがって、これらの物質は触媒量で存在させるだけでよく、費用効果も高い。

本発明により得られるラタト一N—ビオース I及びガラクトー N—ビオースは任意の方法で精製することができる。例えば、本発明により得られるラクトー N —ビオース I及びガラクト一N—ビオースは、カラムクロマトグラフィーゃ結晶化により単離することが可能である。カラムクロマトグラフィーとして、これに限定されるものではないが、サイズ排除クロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラブィー、限外濾過膜分離、逆浸透膜分離が含まれる。結晶化方法としては、これに限定されるものではないが、濃縮、温度低下、溶媒添加（エタノール、メタノール、アセトンなど）が含まれる。以下の実施例で本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。

実施例 1 . 酵素の調製本発明者らはスクロースを糖質原料としたときのラクト一N—ビオース I合成について、ラクトー N_ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、 UD P—グノレコース一 4—ェピメラーゼ、 UD P—グノレコース一へキソース一 1 一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ、及びグルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラタトースー 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラ一ゼの両活性を持つ酵素を取得するため、 B i f i d o b a c t e r i um 1 o n g um J CM 1 2 1 7株ゲノム DNAより該酵素遺伝子の単離を行った。ラクト一 N—ビオースホスホリラーゼ遺伝子は特開 2005 - 34 1 883に記載の方法で取得した。スクロースホスホリラーゼ（B L 0536 ；配列番号 1 )、 U D P—グルコース一 4—ェピメラーゼ（B L 1 644 ；配列番号 2 )、 UD P—グルコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼ（B L 1 2 1 1 ；配列番号 3)、及びグルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素 (B L 0739 ；配列番号 4) の各遺伝子は、 B i f i d o b a c t e r i um l o n g um NC C 2705株ゲノムデータベースに登録されている該酵素遺伝子の塩基配列を基にしてプライマーを作製した（配列番号 5〜 20；表 1参照）。表 1

これらを用レヽて、 B i f i d o b a c t e r i um l o n g um J CM 1

2 1 7株より抽出したゲノム DNAを铸型として行ったポリメラーゼ連鎖反応法

(PCR) により、 DN A塩基配列を有する 1 346、 1 238、 1 820、 2

053 b pの明瞭なバンドを得た。得られたバンド（PCR産物）を DNAシークェンサ一で分析して D N A塩基配列を解読した（配列表の配列番号 1〜 4参照）。この DN A塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、それぞれ B i f i d o b a c t e r i urn l o n g um N C C 2705株由来遺伝子と相同性の高い 1 2

5 1、 1 023、 1 6 27、 1 530 b pのオープンリーディングフレーム（O

RF) が認められた。これらの OR Fが該酵素遺伝子であることを実証するために、 ORFの 5，末端及び 3，末端で作製したプライマー（表 1参照）を用いて

OR F全長を PC Rにより増幅し、導入した制限酵素部位を利用して市販の遺伝子発現用 p ET 30プラスミドに連結した。このプラスミドを用いて、常法により大腸菌を形質転換し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を 30°Cで培養し、該遺伝子発現誘導後の菌体より組換え酵素の精製を行った。精製は各酵素の

C末端に付加したヒスチジンタグ配列を利用し、ニッケルカラムを用いて行った。

1 Lの培養液より精製される酵素量はそれぞれ表 1に示された通りである。生産された組換え酵素が各酵素活性を有していたことからクローニングした各遺伝子が該酵素遺伝子であることが確認された。各酵素の活性は以下のように定義した。なお、反応温度は全て 30°Cとした。ラクト一N—ビオースホスホリラーゼは 0.

1 M 1^0? 3緩衝液（ ^^ 7. 5)、 1 0 mM ガラクトース一 1 _リン酸、 1

M N—ァセチルダルコサミンからなる反応液において 1分間に 1マイク口モルのリン酸を遊離する酵素量を 1ュニットとした。 UD P—グルコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼは 0. 1M 1^0? 3緩衝液（

H 7. 5)、 1 0 mM ガラクトース一 1—リン酸、 1 0 mM U DP—ダルコ一ス、 1 0mM 塩化マグネシウムからなる反応液において 1分間に 1マイクロモルのグルコース 1 リン酸を生成する酵素量を 1ュニットとした。 UD P—ダルコース一4—ェピメラーゼは 0. 1M 1^0? 3緩衝液（ 117. 5)、 5 mM U

D P—ガラクトースからなる反応液において 1分間に 1マイク口モルの UD P— グルコースを生成する酵素量を 1ユニットとした。スクロースホスホリラーゼは 0. 1 M MOP S緩衝液（pH 7. 5)、 1 0 mM スクロース、 1 0 mM リン酸水素ナトリゥムからなる反応液において 1分間に 1マイクロモルのダルコ一ス一 1—リン酸を生成する酵素量を 1ユニットとした。グルコース一丄 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラタトース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素は、 0. 1M MOP S緩衝液（pH7. 5)、 1 0 mM ピロリン酸、 1 0mM UDP—グルコース、 1 0 mM 塩化マグネシゥムからなる反応液において 1分間に 1マイクロモルのグルコース一 1一リン酸を生成する酵素量を 1ユニットとした。 ·

セロビオースホスホリラーゼ（A c t a C r y s t . , D 60 , 1 8 7 7 - 1 8 78 (2004))、ラミナリビオースホスホリラーゼ（A r c h. B i o c h em. B i o p h y s ., 304 (2)， 508— 5 14 (1 993)) はそれぞれかっこ内の文献に記載された方法で調製した。ホスホリラーゼは S i gma -A l d o r i c h社よりゥサギ筋肉由来の酵素を購入した。実施例 2. スクロースのラクトー N—ビオース Iへの変換

スクロースを糖質原料としてラクト一 N—ビオース Iへの変換反応を行った。反応液量は 1 ミリリットルとし、終濃度 0. 24 Mスクロース、 0. 24M N ーァセチルダノレコサミン、 1 0mM 塩化マグネシウム、 30mM リン酸ーナトリウム緩衝液（pH 7. 0)、 1 mM U D P—グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト一N—ビオースホスホリラーゼ、 U DP—グルコース一 4 —ェピメラーゼ、 UD P—グノレコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼ、スクロースホスホリラーゼをそれぞれ 1 ミリリツトル当たり 2 U、 20U、 2. 6U、 2U加え、 30°Cで 90時間反応を行った。反応を 1 0 分間煮沸停止後反応液の pHを 4. 5に調整し、インベルターゼ処理を行うことにより残存スクロースを分解した。反応液を TLC (溶媒ァセトニトリル一水 7 5 : 25、担体シリカゲル 60) で分析した結果、ラクト—N—ビオース I濃度は 200 mMであった。（図 1、レーン 2， 3)

実施例 3. セロビオースのラクト一N—ビオース Iへの変換

セロビオースを糖質原料としてラクトー N—ビオース Iへの変換反応を行った。反応液量は 1ミリリットルとし、終濃度 0. 24Mセロビオース、 0. 24M N ーァセチルダルコサミン、 1 0mM 塩化マグネシウム、 30mM リン酸ーナトリウム緩衝液（pH7. 0)、 ImM U D P—グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラタト一 N—ビオースホスホリラーゼ、 UD P—グルコース一 4 —ェピメラーゼ、 UD P _グルコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ、セロビオースホスホリラーゼをそれぞれ 1 ミリリツトル当たり 2U、 20U、 2. 6U、 1 0U加え、 30 °Cで 90時間反応を行った。反応を 1 0分間煮沸停止後、反応液の p Hを 5に調整し、 ]3ダルコシダーゼ処理を行うことにより残存スクロースを分解した。反応液を TLC (溶媒ァセトニトリル一水 75 ： 25、担体シリカゲル 60) で分析した結果、ラクト—N—ビオース I 濃度は 80mMであった。（図 1、レーン 4， 5)

実施例 4. ラミナリビオースのラタト一 N—ビオース Iへの変換

ラミナリビオースを糖質原料としてラクト _N—ビオース Iへの変換反応を行つた。反応液量は 1 ミリリツトルとし、終濃度 0. 24Mラミナリビオース、 0. 24M N—ァセチルダルコサミン、 1 0 mM 塩化マグネシウム、 30 mM リン酸一ナトリウム緩衝液（p H 7. 0)、 I mM UDP—グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト一N—ビオースホスホリラーゼ、 UDP—ダルコース一 4—ェピメラーゼ、 UD P—グノレコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼをそれぞれ 1 ミリリットル当たり 2 U、 20U、 2. 6U、 5U加え、 30 °Cで 90時間反応を行つた。反応を 1 0分間煮沸停止後、反応液の pHを 5に調整し、 ]3ダルコシダーゼ処理を行うことにより残存スクロースを分解した。反応液を TLC (溶媒ァセト二トリル一水 75 : 25、担体シリ力ゲル 60) で分析した結果、ラクト一 N— ビオース I濃度は 8 OmMであった。（図 1、レーン 6， 7)

実施例 5. マルトへプタオースのラクトー N—ビオース Iへの変換

マルトヘプタオースを糖質原料としてラクトー N—ビオース Iへの変換反応を行った。反応液量は 1 ミリリットルとし、終濃度 0. 24Mマルトヘプタオース、

0. 24M N—ァセチルダルコサミン、 1 0mM 塩化マグネシウム、 30m

M リン酸—ナトリウム緩衝液（p H 7. 0)、 ImM UDP—グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクトー N—ビオースホスホリラーゼ、 UDP— グノレコース一 4 _ェピメラーゼ、 UD P—グノレコース一へキソース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼをそれぞれ 1 ミリリツトル当たり 2U、 20U、 2. 6U、 7U加え、 30 °Cで 90時間反応を行った。反応液を TLC (溶媒ァセトニトリノレー水 75 : 25、担体シリカゲル 60) で分析した結果、ラクト一 N—ビオース I濃度は 1 0 OmMであった。（図 1、レーン 8, 9)

実施例 6. スクロースからラクト一N—ビオース Iの調製

ラクトー N—ビオース Iの合成は以下の通りに行った。反応液量は 1 0ミリリットルとし、終濃度 0. 66M スクロース、 0. 6 OM N—ァセチノレダルコサミン、 1 OmM 塩化マグネシウム、 3 OmM リン酸一ナトリウム緩衝液（ p H 7. 0)、 1 mM UDP—グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト一 N—ビ才ースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、 U DP—グノレコース _ 4一ェピメラーゼ、 UD P—グノレコース一へキソース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼをそれぞれ 1 ミリリットル当たり 0. 25U、 0. 08 U、 2. 50U、 0. 33U加え、 30°Cで 500時間反応を行った。反応液中のラクト _ N—ビオース I濃度はおよそ 0. 52 Mであり、糖質原料の約 80 % がラクトー N—ビオース Iに変換していた。反 jfe液中の未反応のスクロースを分解するため、反応液の pHを塩酸で 4. 5に調整し、 S i gma社より購入したインベルターゼ 3 m gを加え、 3 7°Cで 1 5時間処理した。処理後の反応液を T OYOPEARL HW40 Fカラムに供し、ゲルろ過によりラクト一 N—ピオース I画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりラクト一N—ビオース I標品 0. 95 g (単離収率 4 1%) を得た。実施例 7. スクロースからガラクトー N—ビオースの調製

ガラクト _N—ビオースの合成は以下の通りに行った。反応液量は 1 0ミリリットルとし、終濃度 0. 66M スクロース、 0. 60M N—ァセチルガラクトサミン、 1 0mM 塩化マグネシウム、 3 OmM リン酸一ナトリウム緩衝液

( p H 7. 0)、 1 mM U D P—グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクトー N—ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、 UDP—グノレコース一 4一ェピメラーゼ、 UD P _グノレコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼをそれぞれ 1 ミリリットル当たり 0. 25U、 0.

08U、 2. 50U、 0. 33U加え、 30 °Cで 500時間反応を行った。反応液中のガラクトー N—ビオース濃度はおよそ 0. 40Mであり、糖質原料の約 6

0%がガラクト一N—ビオースに変換していた。反応液中の未反応のスクロースを分解するため、反応液の pHを塩酸で 4. 5に調整し、 S i gma社より購入したインベルターゼ 3 m gを加え、 37°Cで 1 5時間処理した。処理後の反応液を TOYOPEARL HW40 Fカラムに供し、ゲルろ過によりガラクトー N 一ビオース画分を単離、回収した。回収した画分をエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥によりガラクトー N_ビオース標品 0. 78 g (単離収率 34%)を得た。実施例 8. ラクトー N—ビオース Iの大量調製

ラクト一N—ビオース Iの大量調製は以下の通りに行った。反応液量は 1 リツトルとし、終濃库 0. 66M スクロース、 0. & 0M N—ァセチルダルコサミン、 1 0mM 塩化マグネシウム、 30mM リン酸一ナトリウム緩衝液（ p

H 7. 0)、 1 mM UD P—グルコースからなる基質溶液を調製し、そこにラクト一N—ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、 UDP—グノレコース _4一ェピメラーゼ、 UD P—グルコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼをそれぞれ 1 ミリリットル当たり 2 U、 0. 3U、 20

U、 2. 6U加え、 30°Cで 1 35時間反応を行った。このときのスクロース濃度及びラクトー N—ビオース I濃度の経時変化を図 2に示す。反応収率は 87% であった。反応終了後の反応液に 25 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) で平衡化した D E AE— TO YO P E AR L 650 M 1 60 mL加え、 1時間撹拌することにより酵素を吸着させた後、ろ過により上清を分離した。この上清にドライイースト（日清力メリャ） 20グラムを加え、 30°Cで 1 8時間攪拌し、酵母処理を行った。処理後、遠心分離及びセラィトを用いたろ過により、酵母を取り除いた上清を得た。得られた上清をエバポレーターで濃縮した後、室温に静置しておくことで結晶が得られたため、この結晶をろ過により分離し、真空乾燥により標品を得た。また、結晶を分離した母液についても再度結晶化を行い、回収率の向上を行った。これにより純度 97%のラクト一 N—ビオース I 1 30ダラム（収率 55%)、純度 85%のラクト一 N—ビオース I 6 5グラム（収率 24%、合計収率 79%) が得られた。

実施例 9. ラタトー N—ビオース Iのバイオリアクターによる調製

実施例 8で調製した酵素の吸着された D E AE— TO YO P E AR L 650 M 1 60mL分を径 2. 6 c mのガラス製カラムにつめてバイオリアクター力ラム（Φ 2. 6 cmX 30 cm) を調製した。該カラムにはラクト一 N—ビオースホスホリラ一ゼ、スクロースホスホリラーゼ、 UD P—グノレコース一 4—ェピメラーゼ、 UD P—グルコース一へキソース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフエラーゼがそれぞれ約 2000 U、 300 U、 200000 U、 260ひ U吸着されていた。本カラムに 30°C、流速 0. 1m l毎分（滞留時間 27時間）の条件で 500m 1の基質溶液（終濃度 0. 66M スクロース、 0. 60 M N— ァセチノレダルコサミン、 1 0mM 塩化マグネシウム、 30mM リン酸ーナトリゥム緩衝液（ρ H 7. 0)、 1 mM UD P—グルコース）を供し、循環させた。 1回カラム循環後の基質溶液中のラクト一N—ビオース I濃度はおよそ 0.3M、 2回カラム循環後では 0. 4M、 3回カラム循環後のでは 0. 5 Mであった。実施例 1 0. グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（E C 2. 7. 7. 9) とガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) の両活性を持つ酵素を用いたラクト _N—ビオース Iの調製ラクト一N—ビオース Iの合成は以下の通りに行った。反応液量は 1 ミリリツトノレとし、終濃度 0. 66M スクロース、 0. 60M N—ァセチルダル—コサミン、 1 0mM 塩化マグネシウム、 30mM リン酸緩衝液（ p H 7. 0)、 1 mM UTPからなる基質溶液を調製し、そこにラクト一N—ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、 UDP—グゾレコース一 4—ェピメラーゼ、グルコース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（E C 2. 7. 7. 9) とガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（E C 2. 7. 7.

1 0) の両活性を持つ酵素をそれぞれ 1 ミリリットル当たり 0. 25U、 0. 0

8U、 2. 5U、 5. OU加え、 30°Cで 60時間反応を行った。 60時間後の反応液中のラク卜 _N—ビオース I濃度は 5 OmMであった。

実施例 1 1. グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフヱラーゼ（E C 2.

7. 7. 9) とガラクトース一 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) _の両活性を持つ酵素を用いたラクト— N—ビオース Iの調製ラクト _N—ビオース Iの合成は以下の通りに行った。反応液量は 1 ミリリツトルとし、終濃度 0. 66M スクロース、 0. 60M N—ァセチルダルコサミン、 1 0mM 塩化マグネシウム、 30mM リン酸緩衝液（ p H 7. 0)、 1 mM UDP—グルコース、 1 mM ピロリン酸ナトリウムからなる基質溶液を調製し、そこにラクト一N—ビオースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、 UD P—グルコース一 4—ェピメラーゼ、グルコース _ 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) とガラクトース _ 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) の両活性を持つ酵素をそれぞれ 1ミリリットル当たり 0. 25U、 0. 08U、 2. 5U、 5. 0 U加え、 30°Cで 60時間反応を行った。 60時間後の反応液中のラクト _N_ピオース I濃度はいずれも 50 mMであった。産業上の利用可能性

本発明によれば、安価でかつ簡便にラクトー N—ビオース I及びガラクトー N 一ビオースを製造する方法が提供される。

本発明により製造可能なラクト一N—ビオース I及びガラクト一N—ビオースは、食品添加物、機能性食品、医薬品のバルク又は原料成分としてその有効利用が期待される。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1. N—ァセチルダルコサミン、リン酸、ラタトー N—ビオースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 2 1 1 ； 1 , 3 ;3—ガラクトシル _N_ァセチルへキソサミンホスホリラーゼ）及び UD P—グルコース一 4一ェピメラーゼ（E C 5 · 1. 3. 2) の存在下で、

( i i ) α—グルコース一 1—リン酸を UD P—グルコースに変換する酵素及び U DP—ガラクトースを α—ガラクトース _ 1—リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及びノ又は α _グルコース一 1—リン酸及び UDP— ガラクトースをそれぞれ UDP—グルコース及び α—ガラクトース一 1—リン酸に変換する酵素（UDP— G 1 y生成酵素）とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ラクトー N—ビオース Iの製造方法。

2. ( i ) の組合せが、スクロースとスクロースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 7)との組合せ、デンプン又はデキストリンとホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 1 )との組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 20) との組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 49) 及びセロビオースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 20) との組合せ、ラミナリオリゴ糖とラミナリビオースホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 3 1 ) 及び又は ]3— 1 , 3オリゴグルカンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 30) との組合せ、並びにトレハロースとトレハロースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 23 1) との組み合わせ、よりなる群から選択される 1つ以上の組合せである、請求項 1に記載の方法。

3. ( i i ) の組合せが、 UD P—グルコース一へキソース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 2) と、 UDP—ダルコ一ス、 UDP—ガラクトース又はその混合物との組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) 及びガラクトース一 1 一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 U TP との組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) 及びガラクトース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（E C 2. 7. 7. 1 0) と、 UD P _グルコース及び/又は UD P _ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフエラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) 及びガラクトースー 1 _リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 UT P及び UD P—グルコース及ぴ又は UDP—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；グルコース一 1― リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトースー 1—リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UTPとの組合せ；グルコース一 1― リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラタトースー 1—リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UD P—グルコース及び Z又は UD P —ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；並びにグルコース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフエラーゼの両活性を持つ酵素と、 UT P及び UD P _グルコース及び Z又は UD P —ガラクトース及びピロリン酸との組合せ、よりなる群から選択される 1以上の組合せである、請求項 1に記載の方法。

4. 酵素が担体に固定化されている、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。

5. N—ァセチルガラタトサミン、リン酸、ラクト一N—ビオースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 2 1 1 ) 及び UD P—グルコース一 4—ェピメラーゼ

(EC 5. 1. 3. 2) の存在下で、

( i ) 糖質原料と、該糖質原料を加リン酸分解して α _グルコース一 1一リン酸を生じる酵素（G 1 P生成酵素）との組合せ；並びに

( i i ) α—グルコース一 1—リン酸を UD P—グルコースに変換する酵素及び UDP—ガラクトースを _α _ガラクトース一 1—リン酸に変換する酵素とそれらの補因子との組合せ、及び Ζ又は α—グルコース— 1ーリン酸及び UDP— ガラクトースをそれぞれ UD Ρ—グルコース及び α—-ガラクトースー 1ーリン酸に変換する酵素（UDP— G 1 y生成酵素）とその補因子との組合せを作用させることを特徴とする、ガラクトー N—ビオースの製造方法。

6. ( i ) の組合せが、スクロースとスクロースホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 7)との組合せ、デンプン又はデキストリンとホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 1 )との組合せ、セロビオースとセロビオースホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 20) との組合せ、セロデキストリンとセロデキストリンホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 49 ) 及びセロビオースホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 20) との組合せ、ラミナリオリゴ糖とラミナリビオースホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 3 1 ) 及び又は _ 1， 3オリゴグルカンホスホリラーゼ（E C 2. 4. 1. 30) との糸且合せ、並びにトレハロースとトレハロースホスホリラーゼ（EC 2. 4. 1. 23 1) との組み合わせ、よりなる群から選択される 1つ以上の組合せである、請求項 5に記載の方法。

7. ( i i ) の組合せが、 UD P—グルコース一へキソース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 2) と、 UDP—ダルコ一ス、 UD P—ガラクトース又はその混合物との組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) 及びガラクトース一 1 —リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 UTP との組合せ；グルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼ（EC 2.

7. 7. 9) 及びガラクトース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフヱラーゼ（E

C 2. 7. 7. 1 0) と、 UDP _グルコース及び/又は UD P _ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；グルコース一 1ーリン酸ゥリジリルトランスフエラーゼ（EC 2. 7. 7. 9) 及びガラクトース一 1 _リン酸ゥリジリノレトランスフェラーゼ（EC 2. 7. 7. 1 0) と、 UT P及び UD P—グルコース及び/又は UDP—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；グルコース一 1― リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UTPとの組合せ；グルコース一 1― リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトース一 1一リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼの両活性を持つ酵素と、 UD P—グルコース及びノ又は UD P

—ガラクトース及びピロリン酸との組合せ；並びにグルコース一 1—リン酸ゥリジリルトランスフェラーゼとガラクトースー 1—リン酸ゥリジリノ ^トランスフエラーゼの両活性を持つ酵素と、 U TP及び UD P—グルコース及び/又は UD P —ガラクトース及ぴピロリン酸との組合せ、よりなる群から選択される 1以上の組合せである、請求項 5に記載の方法。

8 . 酵素が担体に固定化されている、請求項 5〜 7のいずれか 1項に記載の方法。