WO2005045052A1 - ペントース−５−リン酸エステルの製造方法 - Google Patents

ペントース−５−リン酸エステルの製造方法 Download PDF

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pentose
phosphate
deoxyribose
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acid phosphatase
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Keiichirou Kai
Hitoki Miyake
Toshihiro Oikawa
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Mitsui Chemicals, Inc.
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing pentose-5-phosphate. More specifically, the present invention relates to a method for producing pentose-5-phosphate, which is useful as a starting material for synthesizing nucleosides, which are one of raw materials for producing pharmaceutical and functional chemicals.
  • Pentose-5-phosphate is a useful compound as a starting material for synthesizing nucleosides.
  • 2-deoxyribose-5-phosphate ester is converted to 2-deoxyribose-1-phosphate ester by a phosphopentase, and then glycosylated with various nucleobases by a nucleoside phosphorylase in the next step.
  • Patent Document 1 A method for producing oxyribonucleosides has been reported (Patent Document 1).
  • the 2-deoxyribose-5-phosphate ester used in this production method is prepared by enzymatic hydrolysis of DNA. However, this preparation method requires expensive DNA as a raw material and requires isolation. It is a method with many purification steps.
  • Non-Patent Document 1 a method has been reported in which deoxyribokinase is allowed to act on 2-deoxyribose and adenosine triphosphate (ATP), which is a phosphate donor, to produce 2-deoxyribose-5-phosphate.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Phosphatase is different from acid phosphatase and alkaline phosphatase depending on the pH of the reaction. It is classified as a TASE.
  • a phosphoridation reaction of nucleoside and glucose has been reported as a phosphoridation reaction using acid phosphatase (Non-Patent Documents 2 and 3). Nevertheless, there has been no example showing the phosphorylation reaction of pentose by acid phosphatase.
  • Patent Document 1 WO01 / 14566
  • Patent Document 2 JP-A-01-27484
  • Non-Patent Document 1 Arch.Biochem.Biophys., 164, 1974
  • Non-Patent Document 2 Biosci. Bioeng., 92, 2001
  • Non-Patent Document 3 Org. Biomol. Chem., 1, 2003
  • An object of the present invention is to provide a method for easily producing pentose-5-phosphate.
  • the present invention relates to a method for producing pentose-5-phosphate, in which pentose and a phosphate donor are reacted in the presence of acid phosphatase.
  • a pentose-5-phosphate such as 2-deoxyribose-5-phosphate is selectively and easily produced from a pentose such as 2-deoxyribose and a phosphate donor such as pyrophosphate.
  • FIG. 1 The results obtained by reacting deoxyribose (hereinafter abbreviated as “dR”) with the concentration of a mixed solution of pyrophosphate and potassium pyrophosphate changed to 100 mM-700 mM are shown. Show FIG.
  • dR deoxyribose
  • FIG. 2 is a graph showing the results obtained by changing the activity value in the reaction solution to 0.73 U / mL—7.3 U / mL (0.5—5. Omg wet cell Zml). is there.
  • pentose refers to "ribose, xylose, arabinose, lyxose, ribose in which the hydroxyl group at position 13 is substituted with a hydrogen atom, and hydroxyl group at position 13 with a hydrogen atom.
  • arabinose in which hydroxyl group at position 13 is substituted with an alkoxyl group having carbon number 115 or It is defined as a lyxose in which the hydroxyl group at position 11 is substituted with an alkoxy group having carbon number 115.
  • Pentose-5-phosphate can be produced by reacting pentose with a phosphate donor in the presence of acid phosphatase.
  • the pentose used in the present invention includes, for example, ribose, xylose, arabinose, lyxose, 2-deoxyxylose, 2-dexoxylose, 2-doxyarabinose, 2-de 1-methoxyribose, 1-methoxyxylose, 1-methoxyxylose, 1-methoxyl-xylose, 1-methoxy-12-deoxyribose, 1-methoxy-12-dexoxylose, 1-methoxy-2 —Doxyarabinose and 1-methoxy-2-dexoxylyxose. These may be D-forms or L-forms.
  • Pentose has an asymmetric carbon atom.
  • a pentose in which the configuration at the 3-position and the 4-position is (3S, 4R) or (3R, 4S) is preferable.
  • ribose arabinose, 2-deoxyxylose and 1-methoxy-2-deoxyribose are more preferred! /.
  • the phosphate donor used in the present invention is not limited as long as it is capable of producing a pentose-5-phosphate ester by giving a phosphate group to bentose in the presence of acid phosphatase.
  • polyphosphoric acid or a salt thereof can be mentioned.
  • polyphosphoric acid or a salt thereof examples include pyrophosphoric acid, tripolyphosphoric acid, tetrapolyphosphoric acid, and alkali metal salts such as sodium salt or potassium salt thereof.
  • phosphate donors may be used alone or in combination of two or more.
  • phosphate donors pyrophosphate or potassium salts of pyrophosphate are preferable.
  • acid phosphatases derived from various organisms are not particularly limited as long as they catalyze a reaction for introducing a phosphate group into the carbon atom at the 5-position of pentose. it can.
  • control region necessary for the expression of the bacterium indicates a promoter sequence (including an operator sequence for controlling transcription), a 'ribosome binding sequence (SD sequence)', and a transcription termination sequence.
  • specific examples of the promoter sequence include the trp operator of the tryptophan operon derived from E. coli, the lac operator of the ratatosupoperon, the PL promoter and PR promoter derived from lambda phage, and the Dalcon derived from Bacillus subtilis. Acid synthase promoter, anorecali protease promoter, neutral protease promoter ⁇ ⁇ At ⁇
  • the ribosome binding sequence includes a sequence derived from Escherichia coli or Bacillus subtilis, but is not particularly limited as long as it is a sequence that functions in a desired host such as Escherichia coli or Bacillus subtilis.
  • a consensus sequence in which a sequence complementary to the 3 ′ terminal region of 163 ribosome 1 ⁇ ⁇ is continuous for 4 bases or more may be created by DNA synthesis and used. If an SD sequence located upstream of acid phosphatase is available, it is preferable to use the SD sequence.
  • telomere sequence a transcription termination sequence
  • p-factor independent ones such as a lipoprotein terminator and a trp operon terminator can be used.
  • the sequence of these regulatory regions on the recombinant plasmid should be such that the 5'-terminal upstream force is also arranged in the order of promoter sequence, ribosome binding sequence, gene encoding acid phosphatase, and transcription termination sequence.
  • Specific examples of the plasmid herein include pBR322, pUC18, pBluescript II SK (+;), pKK223-3, and pSClOl, which have a region capable of autonomous replication in E. coli, and autonomous replication in Bacillus subtilis.
  • PUB110, pTZ4, pC194, 11, ⁇ 1, ⁇ 105 and the like having a replicable region can be used as a vector.
  • plasmids capable of autonomous replication in two or more types of hosts pHV14, TRp7, YEp7, pBS7 and the like can be used as vectors.
  • Escherichia coli as described in Examples described later is mentioned as a typical example, but Bacillus subtilis is not limited to Escherichia coli.
  • Other microbial strains such as Bacillus, yeast and actinomycetes are also included.
  • yeast When yeast is used as a host, specific examples of the promoter sequence include an eno-1 promoter, a galactosidase promoter, an alcoholoxidase promoter and the like.
  • Specific examples of plasmids include pESC, pPIC, pAO, pMET, pYES, pTEF, and pNMT, which are capable of autonomous replication in yeast. These are also capable of autonomous replication in Escherichia coli.
  • Specific f columns of fed include Saccharomycess, Scnizosaccharomyces, Pichia, and the like.
  • cells derived from microorganisms and higher organisms capable of producing acid phosphatase cells themselves transformed with a gene encoding acid phosphatase, and crushed products of these cells are used.
  • the molar ratio of the pentose and the phosphate donor used in the above reaction is not particularly limited. However, usually, the reaction is carried out under the condition that one of them is present in an amount of 1 mole or more with respect to the other. You. For example, the reaction is performed under the condition that the phosphate donor is present in an amount of more than 1 mole and not more than 20 moles relative to pentose. The amount of pentose-5-phosphate produced increases when the reaction is carried out under conditions where a large amount of the phosphate donor is present in the pentose. If it is present too much, phosphoric acid is produced and produced in large quantities, which is not desirable in the process. Therefore, the reaction is preferably performed under the condition that the phosphate donor is present in an amount of 3 to 7 moles to pentose.
  • the concentration of pentose in the reaction solution is not particularly limited, but is usually in the range of 0.05 to 2M, preferably in the range of 0.1 to 1.0M.
  • the concentration of the phosphate donor in the reaction solution is not particularly limited as long as the enzyme activity of acid phosphatase is not inhibited, but it is usually in the range of 0.05 to 2M, preferably 0. . 1 1. It is done within the scope of OM.
  • the activity value of the acid phosphatase in the reaction solution is not particularly limited as long as the amount of pentose-5-phosphate formed is present, but it is usually in the range of 11 lOOOUZmL, preferably 1.5UZmL.
  • the above is performed within the existing range.
  • reducing the acid phosphatase activity in the reaction solution to 4 UZmL did not change the amount of pentose-5-phosphate ester produced, but decreasing it below 4 UZmL also reduced the amount of pentose-5-phosphate ester produced. I will do it. Therefore, the reaction is more preferably performed in a range where the activity value of the acid phosphatase in the reaction solution is not less than UZmL.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as it is a temperature range in which pentose-5-phosphate ester is formed, but is usually in the range of 20 to 40 ° C, preferably in the range of 30 to 37 ° C. Is done.
  • the pH of the reaction solution is not particularly limited as long as the pentose-5-phosphate ester is generated, but the pH is usually in the range of 3.0 to 6.0, preferably 3.5 to 6.0. It is performed in the range of 4.0.
  • pentose-5-phosphate ester corresponding to the pentose used in the reaction is obtained.
  • D-form pentose gives D-form pentose-5-phosphate
  • L-form pentose gives L-form pentose-5-phosphate.
  • the present inventors have found that by using a pentose in which the configuration at the 3- and 4-positions is (3S, 4R) or (3R, 4S), the corresponding configuration at the 3- and 4-positions is It has been found that pentose-5-phosphate ester (3S, 4R) or (3R, 4S) can be selectively obtained. That is, the production method of the present invention is useful as a method for selectively producing pentose-5-phosphate.
  • ribose, arabinose, 2-deoxyribose or 1-methoxy-2-deoxyribose and pyrophosphate or a potassium salt of pyrophosphate are mixed with Shigella flexneri (Shigel la), schwanniomyces occidentalis (schwanniomyces ⁇ 3: 7).
  • Shigella flexneri Shigel la
  • schwanniomyces occidentalis schwanniomyces ⁇ 3: 7
  • Aspergill By reacting in the presence of acid phosphatase derived from us ficuum (genus Aspergillus), ribose-5-phosphate, arabinose-5-phosphate, 2-deoxyribose-5-phosphate or 1-methoxy-2- Deoxyribose-5-phosphate ester is obtained.
  • One embodiment of the production method of the present invention is, for example, a method in which pentose and a phosphate donor are present in a buffer adjusted to a desired pH, and an acid phosphatase is added thereto for reaction. No.
  • the pentose-5-phosphate ester obtained by the above reaction can be separated by a known separation method such as a method of precipitating a metal salt from a reaction solution or a column chromatography.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the measurement conditions for the phosphatase activity are as follows.
  • Example 2 The culture cells prepared in Example 1 were added to a solution containing lOOmM acetate buffer (pH 6.0) and 10mM p-ditrophosphate phosphate, and reacted at 37 ° C for 15 minutes. Was. The reaction was stopped by adding 1N NaOH, and the increase in absorbance at 410 nm was measured. One unit (U) was defined as the amount of enzyme capable of releasing 1 ⁇ mol of ⁇ -nitrophenol per minute.
  • Acid phosphatase sequence derived from known Shigella flexneri 2a YSH6000 Based on the above, two types of primers shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were prepared, and PCR was carried out using a plasmid containing a gene encoding acid phosphatase derived from Shigella lexneri 2a YSH6000 as type III. Consists of 10 mM KOD-plus buffer, 1.5 M forward and reverse primers, ImM magnesium sulfate, 0.2 mM dNTPs, 2 U KOD-plus polymerase (TOYOBO), 50 ng / ⁇ L type I DNA A reaction solution was prepared.
  • LB broth (Difco) was prepared in a baffled flask, sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, inoculated with the phosphatase activity-expressing strain, and cultured with shaking at 37 ° C. and 120 rpm. When the cells were collected by centrifugation, 3.37 g of cells were obtained with a wet weight of 1 L of culture solution. The activity value of this cell was 4930U.
  • the culture bacterium prepared in Reference Example 1 was added to a solution containing lOOmM acetate buffer (pH 3.5), a mixed solution of lOOmM pyrophosphate and potassium pyrophosphate (pH 3.5), and a solution containing lOOmM D-2-deoxyribose.
  • 1.5 mM of D-2-Doxyribose-5-phosphate was produced.
  • Example 3 The culture cells prepared in Reference Example 1 were used for a solution containing 100 mM acetate buffer (pH 3.5), a mixed solution of 700 mM pyrophosphate and potassium pyrophosphate (PH3.5), and a solution containing 100 mM various pentoses. Then, the bacterial cell liquid was added so that the activity value in the reaction liquid became 7.3 U / mL (5 mg of wet bacterial cells ZmL), and the mixture was reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • Various pentoses used as substrates are L-2-dexoxyribose, D-ribose, D-arabinose, and L-arabinose.
  • the culture bacterium prepared in Reference Example 1 was added to a solution containing lOOmM acetate buffer (pH 3.5), a mixed solution of lOOmM pyrophosphate and potassium pyrophosphate (pH 3.5), and a solution containing lOOmM D-2-deoxyribose.
  • a solution containing lOOmM acetate buffer (pH 3.5) a mixed solution of lOOmM pyrophosphate and potassium pyrophosphate (pH 3.5), and a solution containing lOOmM D-2-deoxyribose.
  • Add the bacterial cell solution so that the activity value in the reaction solution is 0.73-7.3 U / mL (0.5-5.0 mg wet bacterial cell ZmL), and add 1 ⁇ l at 37 ° C. Allowed to react for hours.
  • the result of HPLC analysis of the reaction solution is shown in FIG.
  • the cells were added to the cells so that the activity value in the reaction solution became 3.9 U / mL (4 mg wet cells ZmL), and reacted at 37 ° C for 22 hours.
  • a reaction solution containing 30 ⁇ ⁇ (75 ⁇ ) of a phytase preparation derived from Schwanniomyces occidentals IFO1840 used in Example 6 was added, and a filter derived from Aspegillus ficuum NRRL3135 used in Example 7 was added.
  • the reaction solution containing 7.5 mg (20 U) of the enzyme was prepared in the same manner and reacted for 5 hours.
  • the reaction solution was analyzed by HPLC. 30 mM 1-methoxy-D- 2-dexoxyribose-5-phosphate ester was produced in the case of kai!
  • the present invention is useful as a method for easily producing pentose-5-phosphate ester, which is useful as a starting material for synthesizing nucleosides.

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Abstract

　リボース、アラビノース、２−デオキシリボースまたは１−メトキシ−２−デオキシリボース等のペントースと、ピロリン酸またはそのアルカリ金属塩等のリン酸供与体とを、酸性ホスファターゼ存在下で反応させることにより、リボース—５—リン酸エステル、アラビノース—５—リン酸エステル、２—デオキシリボース—５—リン酸エステルまたは１−メトキシ−２−デオキシリボース—５—リン酸エステル等のペントース—５—リン酸エステルを製造することができる。

Description

明 細 書
ペントース— 5—リン酸エステルの製造方法。
技術分野
[0001] 本発明は、ペントース— 5—リン酸エステルの製造方法に関する。さらに詳しくは、医 薬品および機能化学品の製造原料の一つであるヌクレオシド類を合成する出発物質 として有用なペントース— 5—リン酸エステルの製造方法に関する。
背景技術
[0002] ペントース -5-リン酸エステルは、ヌクレオシド類を合成する出発物質として有用な 化合物である。例えば、 2—デォキシリボース— 5—リン酸エステルをホスホペントムター ゼにより 2—デォキシリボース— 1—リン酸エステルに変換し、次 ヽでヌクレオシドホスホ リラーゼによって各種核酸塩基とグリコシルイ匕することにより、各種デォキシリボヌクレ オシド類を製造する方法が報告されて 、る (特許文献 1)。この製造方法で用いられ ている 2—デォキシリボース— 5—リン酸エステルは、 DNAの酵素による加水分解によ り調製されているが、この調製方法は、原料となる DNAが高価であり、分離'精製の 工程の多い方法である。
[0003] また、デォキシリボキナーゼを 2—デォキシリボースならびにリン酸供与体であるアデ ノシントリリン酸 (ATP)に作用させ、 2—デォキシリボース— 5—リン酸エステルを生成さ せる方法も報告されている（非特許文献 1)。しかしながら、この方法に用いられる AT Pは高価である。
[0004] ATPに比べて安価なポリリン酸をリン酸供与体とし、仔ゥシ腸に由来するアルカリホ スファターゼを用いて有機ヒドロキシルイ匕合物をリン酸ィ匕する方法も報告されている（ 特許文献 2)。ここには、有機ヒドロキシルイ匕合物として、アルコール類であるグリセ口 ール、糖類である D—グルコースおよび D—リボースを使用した実験が記載されて 、る 。 D—グルコースおよび D—リボース等の糖類には分子内に複数個の水酸基が存在す るが、該糖類の分子内に存在する水酸基のうちのどの水酸基にリン酸基が導入され るのかにつ ヽては明らかにされて!/ヽな!、。
[0005] ホスファターゼは反応至適 pHの違いによって酸性ホスファターゼとアルカリホスファ ターゼに分類される。酸性ホスファターゼを用いたリン酸ィ匕反応としてヌクレオシドぉ よびグルコースのリン酸ィ匕反応が報告されている (非特許文献 2、非特許文献 3)。し 力しながら、これまで酸性ホスファターゼによるペントースのリン酸ィ匕反応を示した例 はない。
特許文献 1： WO01/14566
特許文献 2：特開平 01-27484
非特許文献 1 : Arch. Biochem. Biophys. , 164, 1974
非特許文献 2 : Biosci. Bioeng. ,92, 2001
非特許文献 3 : Org. Biomol. Chem. , 1, 2003
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、ペントース— 5—リン酸エステルを簡便に製造する方法を提供することを 目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ペントースとポリリン酸と の
反応を酸性ホスファターゼの存在下で行うことにより、ペントース— 5—リン酸エステル のみが選択的に得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0008] すなわち本発明は、ペントースとリン酸供与体とを酸性ホスファターゼの存在下で 反応させるペントース— 5—リン酸エステルの製造方法に関するものである。
発明の効果
[0009] 本発明によれば、 2—デォキシリボース等のペントースとピロリン酸等のリン酸供与体 とから、選択的かつ簡便に 2—デォキシリボース 5 リン酸エステル等のペントースー 5 —リン酸エステルを製造することができる。 図面の簡単な説明
[0010] [図 1]デォキシリボース（以下、「dR」と略記する。）に対してピロリン酸とピロリン酸カリ ゥムの混合溶液の濃度を lOOmM— 700mMに変えて反応させて得られた結果を示 す図である。
[0011] [l]dRZピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液 =ιοοΖΐοο
[2]dRZピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液 =100Ζ300
[3]dRZピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液 =100Ζ500
[4]dRZピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液 =100Ζ700
[図 2]反応液中の活性値を 0. 73U/mL— 7. 3U/mL (0. 5—5. Omg湿菌体 Zm L)に変えて反応させて得られた結果を示す図である。
[0012] [1]0. 73U/mL (0. 5mg湿菌体 ZmL)
[2]1. 5U/mL (l. Omg湿菌体 ZmL)
[3] 3. 6U/mL (2. 5mg湿菌体 ZmL)
[4] 7. 3U/mL (5. Omg湿菌体 ZmL)
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本明細書において、「ペントース」とは、「リボース、キシロース、ァラビノース、リキソ ース、 1一 3位の水酸基が水素原子に置換されたリボース、 1一 3位の水酸基が水素 原子に置換されたキシロース、 1一 3位の水酸基が水素原子に置換されたァラビノー ス、 1一 3位の水酸基が水素原子に置換されたリキソース、 1一 3位の水酸基が炭素 数 1一 5のアルコキシル基に置換されたリボース、 1一 3位の水酸基が炭素数 1一 5の アルコキシル基に置換されたキシロース、 1一 3位の水酸基が炭素数 1一 5のアルコキ シル基に置換されたァラビノースまたは 1一 3位の水酸基が炭素数 1一 5のアルコキ シル基に置換されたリキソース」を意味するものと定義する。
[0014] ペントースとリン酸供与体とを酸性ホスファターゼの存在下で反応させることにより ペントース— 5—リン酸エステルを製造することができる。
[0015] 本発明に使用されるペントースとしては、例えば、リボース、キシロース、ァラビノー ス、リキソース、 2—デ才キシリボース、 2—デォキシキシロース、 2—デォキシァラビノー ス、 2—デォキシリキソース、 1—メトキシリボース、 1—メトキシキシロース、 1—メトキシァ ラビノース、 1ーメトキシリキソース、 1—メトキシ一 2—デォキシリボース、 1—メトキシ一 2— デォキシキシロース、 1—メトキシ— 2—デォキシァラビノースおよび 1—メトキシ— 2—デォ キシリキソース等が挙げられる。これらは D体であっても L体であっても構わな 、。 [0016] ペントース中には不斉炭素原子が存在する。本発明に使用されるペントースとして 、 3位および 4位の立体配置が（3S、 4R)または（3R、 4S)であるペントースは好まし い。
[0017] 本発明に使用されるペントースとして、リボース、ァラビノース、 2—デ才キシリボース および 1—メトキシ— 2—デォキシリボースはより好まし!/、。
[0018] 本発明に使用されるリン酸供与体としては、酸性ホスファターゼの存在下でベント ースにリン酸基を与えてペントース— 5—リン酸エステルを製造しうるものであれば制限 はなぐ例えば、ポリリン酸またはその塩が挙げられる。
[0019] ポリリン酸またはその塩としては、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、および これらのナトリウム塩もしくはカリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。
[0020] これらのリン酸供与体は単独で使用してもよぐまた二種類以上を併用することもで きる。
[0021] 前記のリン酸供与体の中でも、ピロリン酸またはピロリン酸のカリウム塩は好ましい。
[0022] 本発明に使用される酸性ホスファターゼとしては、ペントースの 5位の炭素原子にリ ン酸基を導入する反応を触媒するものであれば特に制限はなぐ種々の生物由来の 酸性ホスファターゼが使用できる。例えば、 Aspergillus ficuum等のカビに由来す フィグ1 ~~で、 ¾accnaromyces cerevisiae、 Schwanniomyces occidentalism の酵母に由来す フイタ1 ~~セ、 Enterobacter aerogenes、 Escherichia blattae 、 Kleosiella planticola、 Morganella morganu、 Prevotella intermema、 Pr ovidencia stuartii、 Salmonella typhimurium、 Shigella flexneri、 Zymomo nas mobilis等の細菌に由来する酸性ホスファターゼ、 -ヮトリ等の動物に由来する 酸性ホスファターゼ、ジャガイモ等の植物に由来する酸性ホスファターゼ等が挙げら れ、これらは市販品として入手できるものもある。これらの中でも、 Shigella flexneri (Shigella属ノ、 Schwanniomyces occidentans (ScnwanniomycesJ¾)、 Asper gillus ficuum (Aspergillus属）由来の酸性ホスファターゼは好まし!/、。
[0023] 近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、 目的遺伝子を公知の遺伝子 工学的手法により製造および取得することが容易になった。そのため、前記の微生 物が産生する酸性ホスファターゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析す ることにより、該酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を該微生物株より取得し、該 遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された遺伝子組換えプラスミドを構築し 、これを任意の宿主に導入し、酸性ホスファタ一ゼを産生する遺伝子組換え体を作 出することができる。
ここで 、う発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するォペレ 一ター配列を含む） 'リボソーム結合配列（SD配列） '転写終結配列等を示している。 ノ クテリアを宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリ プトファンオペロンの trpオペレーター、ラタトースォペロンの lacオペレーター、ラムダ ファージ由来の PLプロモーターおよび PRプロモーター、枯草菌由来のダルコン酸 合成酵素プロモーター、ァノレカリプロテアーゼプロモーター、中'性プロテアーゼプロ モ^ ~ At ~
、 α—アミラーゼプロモーター等が挙げられる。また、 tacプロモーターのように独自に 改変 ·設計された配列も利用できる。リボソーム結合配列としては、大腸菌由来または 枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する 配列であれば特に限定されるものではない。例えば、 163リボソーム1^^\の3 '末端 領域に相補的な配列が 4塩基以上連続したコンセンサス配列を DNA合成により作 成してこれを利用してもよい。また、酸性ホスファターゼの上流に位置している SD配 列が利用できるのであれば、その SD配列を利用するのが好ましい。転写終結配列 は必ずしも必要ではないが、 p因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミテ 一ター、 trpオペロンターミネータ一等が利用できる。これら制御領域の組換えプラス ミド上での配列順序は、 5'末端側上流力もプロモーター配列、リボソーム結合配列、 酸性ホスファターゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ま ヽ。 ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有して いる pBR322、 pUC18、 pBluescript II SK( +；)、 pKK223— 3、 pSClOlや、枯 草菌中での自律複製可能な領域を有している pUB110、pTZ4、pC194、 11, φ 1、 φ 105等をベクターとして利用することができる。また、 2種類以上の宿主内で自 律複製が可能なプラスミドの例として、 pHV14、 TRp7、 YEp7および pBS7等をべク ターとして利用することができる。 [0025] ここで 、う任意の宿主には、後述の実施例に記載したような大腸菌（Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、大腸菌に限定されるものではなぐ枯草菌 (Bacc ilus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
[0026] 酵母を宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、 eno— 1プロモーター 、ガラクトシダーゼプロモーター、アルコールォキシダーゼプロモーター等が挙げられ る。プラスミドの具体例としては、酵母内で自律複製可能な pESC、 pPIC、 pAO、 p MET、 pYES、 pTEF、 pNMT等が挙げられる力 これらは大腸菌内でも自律複製 可會である。 fedの具体 f列としては、 Saccharomycessや Scnizosaccharomyces 、 Pichia等が挙げられる。
[0027] 本発明の製造方法には、酸性ホスファタ一ゼ産生能を有する微生物および高等生 物由来の細胞、酸性ホスファターゼをコードする遺伝子で形質転換された細胞その ものおよびこれら細胞の破砕物を使用することもできる力 該細胞、該細胞の破砕物 および該細胞の破砕物を硫安沈殿やカラムクロマトグラフィー等の処理を行って精製 した酸性ホスファターゼ活性を含む画分を担体に担持させた固定化物を使用するこ とちでさる。
[0028] 前記の反応に使用するペントースとリン酸供与体のモル比は特に制限されな ヽが、 通常、どちらか一方が他方に対して 1倍モルより多く存在する条件下で反応は行われ る。例えば、リン酸供与体がペントースに対して 1倍モルより多く 20倍モル以下存在 する条件下で行われる。し力しながら、リン酸供与体がペントースに対して多く存在す る条件下で反応させることでペントース— 5—リン酸エステルの生成量は増加する力 リ ン酸供与体がペントースに対して多く存在しすぎると、リン酸の産廃が多く発生してし まいプロセス上好ましくない。よって、好ましくはリン酸供与体がペントースに対して 3 倍モル以上 7倍モル以下存在する条件下で行われる。
[0029] 反応液中のペントースの濃度は特に制限されないが、通常、 0. 05— 2Mの範囲で 行われ、好ましくは 0. 1- 1. 0Mの範囲で行われる。
[0030] 反応液中のリン酸供与体の濃度は、酸性ホスファターゼの酵素活性が阻害されな い範囲であれば特に制限されないが、通常、 0. 05— 2Mの範囲で行われ、好ましく は 0. 1 一 1. OMの範囲で行われる。
[0031] 反応液中の酸性ホスファターゼの活性値は、ペントース— 5—リン酸エステルが生成 する量が存在すれば特に制限されないが、通常、 1一 lOOOUZmLの範囲で行われ 、好ましくは 1. 5UZmL以上存在する範囲で行われる。しかしながら、反応液中の 酸性ホスファターゼの活性値を 4UZmLまで下げてもペントース— 5—リン酸エステル の生成量に変化はないが、 4UZmLより下げるとペントース— 5—リン酸エステルの生 成量も低下していく。よって、より好ましくは反応液中の酸性ホスファターゼの活性値 力 UZmL以上存在する範囲で行われる。
[0032] 反応温度は、ペントースー 5—リン酸エステルが生成する温度範囲であれば特に制 限されないが、通常、 20— 40°Cの範囲で行われ、好ましくは 30— 37°Cの範囲で行 われる。
[0033] 反応液の pHは、ペントースー 5—リン酸エステルが生成する範囲であれば特に制限 されないが、通常、 pHは 3. 0-6. 0の範囲で行われ、好ましくは 3. 5-4. 0の範囲 で行われる。
[0034] 酸性ホスファターゼの中にはマグネシウムイオン等の二価の金属イオンでホスファタ ーゼ活性の向上が見られるものもあるため、必要に応じて二価の金属イオンのような 多価金属化合物等を反応液中に存在させることができる。
[0035] 前記の反応により、反応に使用するペントースに対応するペントース— 5—リン酸エス テルが得られる。 D体のペントースからは D体のペントース— 5—リン酸エステルが、 L 体のペントースからは L体のペントース— 5—リン酸エステルが得られる。
[0036] 本発明者らは、 3位および 4位の立体配置が（3S、 4R)または（3R、 4S)であるペン トースを使用することにより、対応する 3位および 4位の立体配置が（3S、 4R)または（ 3R、 4S)であるペントースー 5—リン酸エステルがそれぞれ選択的に得られることを見 出した。すなわち、本発明の製造方法は、選択的にペントースー 5—リン酸エステルを 製造する方法として有用である。
[0037] 例えば、リボース、ァラビノース、 2—デォキシリボースまたは 1ーメトキシー 2—デォキ シリボースとピロリン酸またはピロリン酸のカリウム塩とを、 Shigella flexneri(Shigel la )、 schwanniomyces occidentalis (schwanniomyces厲ノ 3:7こ ίま Aspergill us ficuum (Aspergillus属）由来の酸性ホスファターゼの存在下で反応させること により、リボース— 5—リン酸エステル、ァラビノース— 5—リン酸エステル、 2—デォキシリ ボース— 5—リン酸エステルまたは 1ーメトキシー 2—デォキシリボース— 5—リン酸エステル がそれぞれ得られる。
[0038] 本発明の製造方法の一実施態様としては、例えば、所望の pHに調整したバッファ 一中にペントースとリン酸供与体を存在させ、そこに酸性ホスファターゼをカ卩えて反 応させる方法が挙げられる。
[0039] 前記の反応で得られるペントースー 5—リン酸エステルは、反応液から金属塩として 沈殿させる方法やカラムクロマトグラフィー等の公知の分離方法を用いて分離するこ とがでさる。
[0040] 以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるもの では
ない。なお、以下の実験において生成した目的化合物の分析は高速液体クロマトグ ラフィー（以下、「HPLC」と略記する。）に依った。 HPLC分析の条件を次に示す。
[0041] カラム： Shodex Asahipak NH2P-50 4E (昭和電工）
移動相： 50mM リン酸二水素ナトリウム
検出器:示差屈折率計
また、培養して得られた菌体のホスファターゼ活性は、 p—二トロフエ-ルリン酸エス テルから P—二トロフエノール（ ε =
Figure imgf000009_0001
pH6. 0)への変化を 410nmの 吸光度の増加を測定することにより求めた。ホスファターゼ活性の測定条件は次のと おりである。
[0042] lOOmMの酢酸バッファー（pH6. 0)、 10mMの p—二トロフエ-ルリン酸エステルを 含む溶液に、実施例 1で調製した培養菌体を添加して、 37°Cで 15分間反応させた。 1Nの NaOHを添カ卩して反応を停止し、 410nmにおける吸光度の増加を測定した。 1ユニット（U)の定義を 1分間に 1 μ molの ρ—ニトロフエ-ルを遊離することができる 酵素量とした。
[参考例 1]
公知の Shigella flexneri 2a YSH6000に由来する酸性ホスファターゼ配列を もとに、配列番号 1および配列番号 2に示した 2種のプライマーを作成し、 Shigella f lexneri 2a YSH6000由来の酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を含むプラ スミドを铸型として PCRを行った。 10mMの KOD— plusバッファー、 1. 5 Mのフォ ワードおよびリバースプライマー、 ImMの硫酸マグネシウム、 0. 2mMの dNTPs、 2 Uの KOD— plusポリメラーゼ（TOYOBO)、 50ng/ μ Lの铸型 DNAからなる反応 溶液を作成した。 94°Cで 2分間保持した後、 94°Cで 30秒間、 60°Cで 30秒間、 68°C で 1分間のサーマルサイクルを 30サイクル行った後、最後に 68°Cで 10分間保持した 。その結果、約 0. 75kbの増幅断片が得られた。得られた断片を Pstl/BamHI処理 し、 pUC19に連結した。作成したプラスミドを用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し て、ホスファターゼ活性の発現株を作成した。
[0043] バッフル付フラスコに LB broth (Difco)を調製し、 120°C、 20分間殺菌後、作成 したホスファターゼ活性の発現株を植菌して、 37°C、 120rpmで振とう培養した。遠 心分離によって菌体を回収したところ、 1Lの培養液力も湿重量で 3. 37gの菌体が得 られた。なお、この菌体の活性値は 4930Uであった。
実施例 1
[0044] lOOmMの酢酸バッファー（pH3. 5)、 lOOmMのピロリン酸とピロリン酸カリウムの 混合溶液 (pH3. 5)、 lOOmMの D— 2—デォキシリボースを含む溶液に、参考例 1で 調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が 7. 3U/mL (5mg湿菌体 ZmL)と なるように調整した菌体液を添加して、 37°Cで 1時間反応させた。反応液を HPLC分 祈した結果、 1. 5mMの D— 2—デォキシリボース— 5—リン酸エステルが生成していた 実施例 2
[0045] lOOmMの酢酸バッファー（pH3. 5)、 lOOmMの D— 2—デォキシリボースを含む 溶液に、 lOOmM— 700mMの濃度となるようにピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合 溶液 (pH3. 5)を添加し、参考例 1で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値 が 7. 3UZmL (5mg湿菌体 ZmL)となるように菌体液を添カ卩して、 37°Cで反応させ た。反応液を HPLC分析した結果を図 1に示した。
実施例 3 [0046] lOOmMの酢酸バッファー（pH3. 5)、 700mMのピロリン酸とピロリン酸カリウムの 混合溶液 (PH3. 5)、 lOOmMの各種ペントースを含む溶液に、参考例 1で調製した 培養菌体を用いて反応液中の活性値が 7. 3U/mL (5mg湿菌体 ZmL)となるよう に菌体液を添加して、 37°Cで 1時間反応させた。基質として用いた各種ペントースは 、 L— 2—デォキシリボース、 D—リボース、 D—ァラビノース、 L—ァラビノースである。反 応液を HPLC分析した結果、 L— 2—デォキシリボースより 9. 6mMの L— 2—デォキシ リボース— 5—リン酸エステル、 D—リボースより 16. 6mMの D—リボース— 5—リン酸エス テル D—ァラビノースより 4. 9mMの D—ァラビノース一 5—リン酸エステル、 L—ァラピノ ースより 2. 8mMの L—ァラビノース— 5—リン酸エステルが生成して!/、た。
実施例 4
[0047] lOOmMの酢酸バッファー（pH3. 5)、 lOOmMのピロリン酸とピロリン酸カリウムの 混合溶液 (pH3. 5)、 lOOmMの D— 2—デォキシリボースを含む溶液に、参考例 1で 調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が 0. 73-7. 3U/mL (0. 5-5. 0 mg湿菌体 ZmL)となるように菌体液を添加して、 37°Cで 1時間反応させた。反応液 を HPLC分析した結果を図 2に示した。
実施例 5
[0048] 2Mのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（pH4. 0)、 2Mの D— 2—デォキシリ ボースを含む溶液 2mLに、 Schwanniomyces occidentalis IFO1840に由来す るフイターゼの調製液を 60 L (150U)添加して、 37°Cで 4時間反応させた。 Schw anniomyces occidentalis IFO1840に由来するフイターゼの調製は、特開平 11 —206368に記載の方法に依った。反応液を HPLC分析した結果、 15mMの D— 2— デォキシリボース— 5—リン酸エステルが生成していた。
実施例 6
[0049] 0. 33gのピロリン酸カリウム、 2. 5gの 2—デォキシリボースを含む溶液を塩酸にて p H4. 5に調整し、 5mLに希釈した。これに Aspegillus ficuum NRRL3135に由 来するフイターゼ（SIGMA)を 25mg (100U)添カ卩して、 37°Cで 1時間反応させた。 反応液を HPLC分析した結果、 22mMの D— 2—デォキシリボース— 5—リン酸エステ ルが生成していた。 実施例 7
[0050] 2Mのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（pH4. 0)、 2Mの 1—メトキシ— D— 2 ーデォキシリボースを含む溶液 1. 5mLに、参考例 1で調製した培養菌体を用いて反 応液中の活性値が 3. 9U/mL (4mg湿菌体 ZmL)となるように菌体液を添カ卩して、 37°Cで 22時間反応させた。また、それとは別に、実施例 6で用いた Schwanniomyc es occidentals IFO1840に由来するフイターゼの調製液 30 Ι^ (75υ)を添カロし た反応液、実施例 7で用いた Aspegillus ficuum NRRL3135に由来するフイタ ーゼ 7. 5mg (20U)を添加した反応液も同様に調整して、 5時間反応させた。反応液 を HPLC分析した結果、調製した培養菌体を添カ卩した場合で 300mM、 Schwanni omyces occidentalis IFO 1840に由来するフイターゼを添カ卩した場合で 20mM 、 Aspegillus ficuum NRRL3135に由来するフイターゼを添カ卩した場合で 30m Mの 1—メトキシ— D— 2—デォキシリボース— 5—リン酸エステルが生成して!/、た。
産業上の利用可能性
[0051] 本発明は、ヌクレオシド類を合成する出発物質として有用なペントース— 5—リン酸ェ ステルを簡便に製造する方法として有用である。

Claims

請求の範囲
[1] ペントースとリン酸供与体とを酸性ホスファターゼの存在下で反応させるペントース一
5—リン酸エステルの製造方法。
[2] ペントースが（3S、 4R)または（3R、 4S)のペントースであり、ペントース— 5—リン酸ェ ステルが（3S、 4R)または（3R、 4S)のペントース— 5—リン酸エステルである、請求項
1に記載の製造方法。
[3] ペントースがリボース、ァラビノース、 2—デォキシリボースまたは 1—メトキシ— 2—デォ キシリボースであり、ペントース— 5—リン酸エステルがリボース— 5—リン酸エステル、ァ ラビノース— 5—リン酸エステル、 2—デォキシリボース— 5—リン酸エステルまたは 1—メト キシ— 2—デォキシリボース— 5—リン酸エステルである、請求項 1に記載の製造方法。
[4] リン酸供与体がポリリン酸又はその塩である、請求項 1に記載の製造方法。
[5] リン酸供与体がペントースに対して 1倍モルより多く 20倍モル以下存在する条件下で 反応させる、請求項 1に記載の製造方法。
[6] 酸性ホスファターゼが lUZmL以上存在する条件下で反応させる、請求項 1に記載 の製造方法。
[7] 酸性ホスファターゼが Shigella属、 Schwanniomyces属または Aspergillus属に由 来する酸性ホスファターゼである、請求項 1に記載の製造方法。
[8] 酸'性ホスファターセカ ^Shigella flexneri、 Schwanniomyces occidentalisまた は Aspergillus ficuumに由来する酸性ホスファターゼである、請求項 1に記載の製 造方法。
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