WO2006080313A1 - ３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸の酵素合成法 - Google Patents

３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸の酵素合成法 Download PDF

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WO2006080313A1
WO2006080313A1 PCT/JP2006/301062 JP2006301062W WO2006080313A1 WO 2006080313 A1 WO2006080313 A1 WO 2006080313A1 JP 2006301062 W JP2006301062 W JP 2006301062W WO 2006080313 A1 WO2006080313 A1 WO 2006080313A1
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atp
pndk
enzyme
dna fragment
paps
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PCT/JP2006/301062
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Kazuya Ishige
Toshitada Noguchi
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Yamasa Corporation
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    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide

Definitions

  • the present invention relates to adenosine 5, a triphosphate sulfurylase (ATPS) and adenosine 5'-phosphosulfate kinase derived from the thermostable bacterium Diovacillus' Stear mouth thermophilus : APSK), polyphosphate-dependent nucleoside 5'-diphosphate kinase (PNDK) from Pseudomonas aeruginosa, adenosine 5, monotriphosphate (adenosine using PNDK) 5, one triphosphate: ATP) supply 'regeneration system, and the practical one, one phosphoadenosine 5, one phosphosulfate (3, -phosphoa denosine 5, — linked with the ATPS, APSK and ATP supply' regeneration system It relates to the enzymatic synthesis of phosphosulfate (PAPS).
  • PAPS triphosphate sulfurylase
  • PNDK polyphosphate-dependent nucleoside 5'-diphosphat
  • PAPS is a sulfuric acid donor widely used in vivo from microorganisms to plants and higher animals.
  • the relationship between PAPS and several diseases typified by proteodalican disease has been reported, and the role of PAPS in vivo is very important, and it may be used in the field of pharmaceuticals and other products. There is.
  • ATP is adenosine 5, monotriphosphate
  • ADP is adenosine 5, monodiphosphate
  • AP S is adenosine 5, -phosphosulfate
  • PPi is inorganic pyrophosphate
  • SO 2_ is sulfate ion
  • AT PS and APSK must be purified from the cell disruption solution of the thermostable bacteria.
  • the intracellular content of both enzymes is low, so a large amount of cell culture is required, and the purification procedure for both enzymes is extremely complicated! .
  • polyphosphoric acid is known as an inexpensive phosphoric acid donor, and ATP supply from adenosine 5 and monomonophosphate (AMP) using this polyphosphoric acid is known.
  • AMP polyphosphate kinase
  • ADK adenylate kinase
  • Patent Document 5 A system using polyphosphate: AMP phosphotransferase (PAP) and ADK shown in 5) and (6) is known (Patent Document 5).
  • ATP is adenosine 5′-triphosphate
  • ADP is adenosine 5′-diphosphate
  • AM P is adenosine 5, -monophosphate
  • Poly P is polyphosphate
  • n is an integer
  • PPK is considered to function as a polyphosphate synthase in vivo, and the equilibrium of the enzyme reaction represented by formula (4) is greatly biased toward the polyphosphate synthesis side (Non-patent Document 2). )
  • an ATP supply / regeneration system using the enzyme functions well, for example, in a reaction at a low substrate concentration of about 5 mM or less, but the substrate concentration is low. It has been found that reactions at concentrations as high as 10 mM cannot function well.
  • Non-Patent Documents 3 and 4 Polyphosphate ⁇ Driven Nucleoside Diphosphate Kinase
  • this PNDK exhibits polyphosphate-dependent phosphorylation activity of ADP similar to PPK, its amino acid sequence has no homology to that of PPK, and 100 of E. coli-derived PPK. It is an enzyme that has a remarkably high specific activity that is more than 1000 times that of PPK derived from Pseudomonas aeruginosa (Non-patent Document 2). Since the reaction equilibrium is largely biased toward the ATP synthesis side, it is considered to be ideal as an enzyme used in the ATP supply / regeneration system.
  • Patent Document 1 Patent No. 3098591
  • Patent Document 2 Patent No. 3078067
  • Patent Document 3 Patent No. 3029915
  • Patent Document 4 WO98 / 48031
  • Patent Document 5 WO03Zl00056
  • Patent Document 6 JP 2002-78498
  • Non-Patent Literature 1 Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 171-172 (1992)
  • Non-Patent Literature 2 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 16684-16688 (2002)
  • Non-Patent Literature 3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 439-442 (1997)
  • Non-patent document 4 Biochem. Biophys. Res. Commun., 281, 821 -826 (2001)
  • Non-patent document 5 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 99, 16678-16683 (2002) Disclosure of the invention
  • the present invention which establishes a practical PAPS production method, The purpose is to find genes encoding ATPS and APSK from the chromosome of D. bacillus 'Stear mouth thermophilus (formerly Bacillus' Stear mouth thermophilus) and to produce the enzyme in large quantities using recombinant DNA techniques.
  • an object of the present invention is to establish efficient production of PNDK using recombinant DNA technology.
  • the present invention relates to the construction of an extremely powerful ATP supply 'regeneration system using PNDK, and the ATPS and APSK derived from the ATP supply / regeneration system and the thermostable bacterium D.
  • the purpose is to provide an efficient manufacturing method for linked PAPS.
  • the present inventors found for the first time genes encoding ATPS and APSK from the thermostable bacterium Geobacillus' stear mouth thermophilus chromosome, and recombined.
  • a DNA technique was used to enable mass production of the enzyme.
  • the PAPS synthesis activity is remarkably improved, which makes it possible to efficiently perform both enzymes without special purification. PAPS production became possible.
  • PAP is selected as an enzyme that phosphorylates AMP to generate ADP
  • PNDK is selected as an enzyme that generates and regenerates ATP by phosphorylating ADP.
  • the ATP supply / regeneration system consisting of PAP and PNDK, or the ATP supply / regeneration system consisting of ADK and PNDK is different from that of PAPS using ATPS and APSKPAPS derived from Gyobacillus steer thermophilus.
  • ATPS and APSKPAPS derived from Gyobacillus steer thermophilus When applied to enzymatic synthesis, we found that any ATP supply / regeneration system maintained the ATP concentration in the reaction system dominantly with respect to ADP and AMP, and as a result, PAPS could be synthesized efficiently.
  • the present invention is as follows.
  • a DNA fragment consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding adenosine 5'-triphosphate sulfurylase (ATPS) derived from D. sterolum thermophilus.
  • a crude enzyme having ATPS activity is prepared by a recombinant DNA technique using any one of the DNA fragments described in (1) to (3) above, and the resulting crude enzyme is heated.
  • a method for preparing an enzyme having ATPS or ATPS activity is provided.
  • APSK monophosphosulfate kinase
  • DN A encoding the enzyme having the APSK activity, which also has the base sequence ability represented by SEQ ID NO: 2, and one or several bases deleted, substituted, inserted or added fragment.
  • a DNA fragment encoding an enzyme having K activity is provided.
  • a crude enzyme having K activity is prepared, and the resulting crude enzyme is heat-treated,
  • PNDK monophosphate kinase
  • AMP monomonophosphate
  • PNDK polyphosphate-dependent nucleoside 5
  • PAP AMP phosphotransferase
  • ATP Triphosphoric acid
  • AMP adenosine 5, -monophosphate
  • PNDK polyphosphate-dependent nucleoside 5, diphosphate kinase
  • ADK adenylate kinase
  • Useful substances produced by enzymatic reactions that consume ATP as an energy source and Z or substrate include 3, monophosphoadenosine 5, monophosphosulfate (PAPS), sugar nucleotides , S A method for producing a useful substance according to (28) above, which is any one of adenosylmethionine (SAM).
  • SAM adenosylmethionine
  • ATP was sulfated and phosphorylated using adenosine 5, monotriphosphate sulfurylase (ATPS) and adenosine 5, monophosphosulfate kinase (APSK), and 3, monophosphoadenosine 5 'phosphosulfate.
  • ATP adenosine 5, monotriphosphate sulfurylase
  • APSK monophosphosulfate kinase
  • PAPS a method for producing PAPS, wherein the ATP supply'regeneration system according to any one of the above (21) to (27) is used instead of ATP.
  • the ATP supply / regeneration system of the present invention uses only inexpensive raw materials such as AMP and polyphosphoric acid, and when this is applied to the synthesis of PAPS, the ATP concentration in the reaction system is set to ADP or A PAPS can be synthesized with an efficiency of over 60% conversion to AMP, which can be maintained in a dominant manner with respect to MP.
  • This synthesis efficiency is more than five times the efficiency when applying the ATP supply / regeneration system using the cooperative action of PPK and ADK, and when applying the ATP supply / regeneration system using PAP and ADK. 1. Efficiency is more than 5 times.
  • ATPS and APSK are derived from microorganisms belonging to the genus Geobacillus
  • PNDK is derived from microorganisms belonging to the genus Pseudomonas
  • PAP is derived from microorganisms belonging to the genus Acinetobacter
  • ADK derived from E. coli or yeast
  • FIG. 1 shows the amount of PAPS produced over time when the ATP supply / regeneration system is not conjugated (Example 3 (3)).
  • the country indicates the amount of PAPS produced in the control reaction
  • the triangle indicates the amount of PAPS produced in the reaction using the non-heat-treated crude enzyme
  • the symbol ⁇ indicates the amount of PAPS produced in the reaction using the heat-treated crude enzyme solution.
  • FIG.2 PAP conjugated with ATP supply and regeneration system of the present invention using ADK and PNDK
  • FIG. 3 shows changes over time in a PAPS synthesis reaction in which the ATP supply / regeneration system of the present invention using PAP and PNDK is conjugated (Example 8 (8)).
  • FIG. 4 shows changes over time in a PAPS synthesis reaction in which a conventional soot supply / regeneration system is conjugated using the cooperative action of PPK and ADK (Comparative Example 1).
  • FIG. 5 shows the change over time in a PAPS synthesis reaction in which a conventional ATP supply / regeneration system using PAP and ADK is conjugated (Comparative Example 2).
  • (A) Gibacillus' stea mouth thermophilus-derived ATPS and APSK ATPS and APSK derived from Giobacillus stear mouth thermophilus lack the enzyme having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively, or one or several amino acids in the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • An enzyme having a deleted, substituted or added amino acid sequence is an enzyme having a deleted, substituted or added amino acid sequence.
  • Deletion of several amino acids means, for example, a deletion within 30 amino acids, preferably a deletion within 10 amino acids.
  • the substitution of several amino acids means, for example, within 25 amino acids, preferably within 10 amino acids.
  • the addition of several amino acids refers to, for example, 40 amino acids or less, preferably 20 amino acids or less.
  • amino acid deletion, substitution or attachment includes those having 85% or more, more than 90%, particularly 95% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. Even with these changes, it is necessary to have ATPS or APSK activity, respectively.
  • Genes encoding ATPS and APSK derived from Gyobacillus' Stear mouth thermophilus are genes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively, or SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • Examples of the gene having a base sequence in which one or more base groups have been deleted, substituted, or added include those that hybridize with the DNA fragment of SEQ ID NO: 1 or 2 under stringent conditions.
  • stringent conditions include conditions such as 50 ° C in 0.2 X SSC containing 0.1% SDS and 60 ° C in 1 X SSC containing 0.1% SDS.
  • a gene having a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added has 85% or more, more than 90%, in particular 95% or more homology with the base sequence of SEQ ID NO: 1 or What you have is included.
  • Such a gene can be obtained, for example, by a method of amplifying a target gene by a PCR method using synthetic DNAs at both ends of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 as primers and a D. Can be acquired.
  • Each isolated gene can be held in various host-vector systems by ligating to a vector DNA.
  • Various hosts such as microorganisms, insect cells, cultured cells, etc. Things can be used.
  • microorganisms such as E. coli
  • yeast when yeast is used, the SC1 system can be used.
  • any commercially available plasmid can be used as a vector as long as it is stably maintained in the microbial cells.
  • E. coli when used as the host, it is preferable to use a plasmid such as pTrc99A (Amersham).
  • ATPS and APSK of the present invention can be produced in large quantities.
  • pTrc99A has a trc promoter capable of inducing expression, and isopropyl- ⁇ D thiogalatatopyranoside (IPTG) can be added to the medium during the culture to produce the desired AT PS and APSK. it can.
  • IPTG isopropyl- ⁇ D thiogalatatopyranoside
  • the transformant can be cultured by a conventional method. That is, taking bacteria belonging to the genus Bacillus or Escherichia coli as an example, the medium is bouillon medium, LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride) or 2xYT medium (1.6). % Tryptone, 1% first extract, 0.5% salt, etc.), inoculate the medium with the inoculum, and then incubate at 30-50 ° C for 10-50 hours with stirring if necessary. Then, the obtained culture broth can be separated by centrifugation to recover microbial cells.
  • the ATPS and APSK obtained in this manner can enhance PAPS synthesis activity by subjecting the crude enzyme solution to a heat treatment.
  • the heat treatment can be performed by keeping the temperature at 45 ° C to 65 ° C for about 5 minutes to 1 hour, preferably at 55 ° C for about 30 minutes.
  • the DNA fragment used in the present invention is 101 to 1171 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • DNA fragments a DNA fragment in which a nucleotide sequence corresponding to 72 to 87 amino acid residues is deleted, preferably a nucleotide sequence corresponding to 73 to 83 amino acid residues.
  • Examples thereof include DNA fragments from which the nucleotide sequence corresponding to amino acid residues 73, 77, 80, or 83 shown in the Examples below is deleted.
  • Such a DNA fragment corresponds to the 5 'end after deletion of the target amino acid equivalent of the ppk2 structural gene encoding PNDK, as described in detail in the Examples below. Obtained by amplifying the target DNA fragment by PCR using two types of primers, synthetic DNA and synthetic DNA of the 3 ′ end of the ppk2 structural gene. be able to.
  • Each isolated DNA fragment can be ligated to vector DNA to construct various host vector vectors, and the desired PNDK of the present invention can be obtained by a method commonly used in the selected host vector system. Can be manufactured.
  • the PNDK of the present invention various hosts such as microorganisms, insect cells, and cultured cells can be used.
  • the EK1 system can be used when E. coli is used
  • the SC1 system can be used when yeast is used.
  • any commercially available plasmid can be used as the vector as long as it is stably maintained in the microbial cells.
  • E. coli when used as the host, it is preferable to use a plasmid such as pTrc99A (Amersham).
  • a large amount of the PNDK of the present invention can be produced by linking a cloned gene (DNA fragment) downstream of a specific promoter sequence.
  • pTrc99A has a trc promoter capable of inducing expression
  • the target PNDK can be produced by adding isopropyl ⁇ D thiogalatatoviranoside (IPTG) to the medium during the culture.
  • IPTG isopropyl ⁇ D thiogalatatoviranoside
  • the culture of the transformant can be performed by a conventional method. Ie, Bacillus or E. coli
  • the medium may be bouillon medium, LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% salt) or 2xYT medium (1.6% tryptone, 1% 1st extract, 0.5% salt), etc., and after inoculating the medium with the inoculum, it is cultured at 30-50 ° C for about 10-50 hours with stirring as necessary, and the resulting culture solution
  • the microbial cells can be recovered by centrifuge separation.
  • the fraction having PNDK activity from the above-mentioned treated bacterial cell product is purified by conventional enzyme purification means (salting out treatment, isoelectric point precipitation treatment, organic solvent precipitation treatment, dialysis treatment, various types of crystals). It can be purified by oral matography, etc.) and used as a partially purified enzyme or purified enzyme.
  • the PNDK of the present invention thus prepared is a PNDK having an amino acid sequence corresponding to the DNA fragment used and lacking at least 72 amino acid residues corresponding to the N-terminal side of SEQ ID NO: 10.
  • Regeneration system includes (i) supply of ATP composed of AMP, polyphosphoric acid, PNDK and PAP. Supply of regenerating system and (ii) ATP composed of AMP, polyphosphoric acid, PNDK and ADK ' A regeneration system is included.
  • the ATP supply 'regeneration system of the present invention includes reagents constituting the ATP supply-regeneration system.
  • PAP, ADK and PNDK are all known enzymes, and are not limited to specific origins such as animal origin, plant origin, and microorganism origin. It is convenient to use a microorganism-derived enzyme from the viewpoint of ease of enzyme preparation. It is also possible to clone the gene using recent gene recombination techniques, mass-produce it using Escherichia coli or the like as a host, and prepare the enzyme from the obtained recombinant bacteria.
  • enzymes derived from microorganisms belonging to the genus Pseudomonas described above as PNDK, those derived from microorganisms belonging to the genus Acinetobacter as PAP, and those derived from Escherichia coli or yeast as ADK are used as enzymes. Is preferred.
  • Each of the enzymes added to the reaction system may be in any form as long as it has a desired activity.
  • microbial cells including transformants
  • Examples of the treated product or an enzyme obtained from the treated product can be given.
  • Preparation of microbial cells can be carried out by a method of collecting the cells by centrifugation or the like after culturing by a conventional method using a medium in which the microorganism can grow.
  • the medium may be bouillon medium, LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride) or 2xYT medium (1. 6% tryptone, 1% yeast extract, 0.5% salt) can be used.
  • After inoculating the medium incubate at 30-50 ° C for 10-50 hours with stirring if necessary.
  • the obtained culture solution can be centrifuged to collect the microbial cells.
  • the above microbial cells are mechanically destroyed (by Warinda Blender 1, French press, homogenizer, mortar, etc.), freeze-thawed, self-digested, dried (freeze-dried, air-dried, etc.) ), Enzyme treatment (such as lysozyme), ultrasonic treatment, chemical treatment (such as acid or alkali treatment), and so on.
  • Enzyme treatment such as lysozyme
  • ultrasonic treatment such as acid or alkali treatment
  • chemical treatment such as acid or alkali treatment
  • a fraction having a desired enzyme activity from the above-mentioned processed bacterial cell product is purified by conventional enzyme purification means (salting out treatment, isoelectric point precipitation treatment, organic solvent precipitation treatment, dialysis treatment, various chromatograms). Examples thereof include a crude enzyme or a purified enzyme obtained by performing a photographic process.
  • AMP commercial product
  • polyphosphate commercial product
  • various enzyme PAP, PNDK and ADK concentrations added to the ATP supply and regeneration system of the present invention are useful for applying the ATP supply and regeneration system.
  • AMP is, for example, 1 to 200 mM, preferably 10 to 100 mM
  • polyphosphoric acid is 1 to L000 mM, preferably 50 to 500 mM in terms of inorganic phosphoric acid
  • enzyme Concentration is 0.001 unit ZmL or more, preferably 0.001 Range force of ⁇ 10 units ZmL Can be set as appropriate.
  • Useful substances applicable to such an ATP supply / regeneration system may be any useful substance produced by an enzymatic reaction that consumes ATP as an energy source and Z or substrate.
  • PAPS sugar nucleotides
  • SAM S-adenosylmethionine
  • the enzyme synthesis reaction of PAPS is based on the catalytic action of ATP and sulfate ion power ATPS.
  • ATP is phosphorylated by phosphoric acid donor and phosphorylated by the catalytic action of APSK (Formula 2).
  • ATP can be used as the ATP to be added to the reaction.
  • concentration used may be appropriately set, for example, in the range of 1 to 200 mM, preferably 1 to 20 mM.
  • sulfate group donor to be added to the reaction commercially available sulfates such as sodium sulfate and magnesium sulfate can be used as long as they can generate sulfate ions in the reaction solution.
  • concentration used for example, a range force of 1 to 200 mM, preferably 10 to LOOmM can be set as appropriate.
  • PAPS is synthesized by adding ATP and sulfate in an appropriate buffer having a pH in the range of 4 to 9, and further adding 0.001 units or more, preferably 0.001 to 1.0 units of ATPS and 0. Add 01 units or more, preferably 0.001 to 1.0 units of APSK, and mix at 20 ° C or more, preferably 30 to 50 ° C for 1 to 50 hours with stirring as necessary. It can be carried out by reacting.
  • the above-mentioned ATP supply / regeneration system can be used in combination without using ATP.
  • PAPS synthesis using an ATP supply / regeneration system consisting of AMP, polyphosphate, PNDK and ADK was carried out in a suitable buffer solution with a pH of 4-9.
  • polyphosphoric acid and 0.001 unit / mL or more, preferably 0.001 to 10 units ZmL ADK, 0.001 unit / mL or more, preferably 0.001 to: L0 unit Z mL or more PNDK, 0.001 unit or more, preferably 0.001 to 10 units of ATPS and 0.001 unit or more, preferably 0.001 to 10 units of APSK, and 20 ° C or more, preferably At 30 to 50 ° C, 1 to:
  • the reaction can be carried out by stirring for about L00 hours, if necessary.
  • pyrophosphoric acid produced by ATPS reaction may cause product inhibition. Therefore, 0.001 unit ZmL or more, preferably 0.001-10 unit ZmL of inorganic pyrophosphatase. (Inorganic Pyrophosphatase) can be added to improve synthesis efficiency.
  • the PAPS produced in the reaction solution can be isolated and purified by a usual chromatographic method using activated carbon, ion-exchange resin or the like.
  • the tBLASTn program was used to search for the presence of a DNA region capable of encoding an open reading frame (hereinafter abbreviated as ORF) of an amino acid sequence similar to the known ATPS (Accession Number CAA04411) derived from Bacillus subtilis. .
  • the strain chromosome contains a DNA region capable of encoding an ORF having an amino acid sequence similar to that of ATPS derived from Bacillus subtilis. Further, an NA region capable of encoding ORF having an amino acid sequence similar to that of APSK (Accession Number CAA04412) derived from Bacillus subtilis was found downstream of the gene. These were expected to be ATPS and APSK genes, respectively, in the bacterium.
  • a DNA fragment expected to be the bacterial ATPS gene was amplified by the PCR method shown below. That is, using the following primers (A) and (B), in 0.1 mL of the reaction solution (50 mM potassium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, and D.
  • the reaction solution 50 mM potassium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, and D.
  • Stearum thermophilus TH6-2 strain (FERM BP-2758) chromosomal DNAO.l ⁇ g, 2 types of primer DNA each 0.2 M, ExTaqDNA polymerase 2.5 units) was prepared by Perkin—Elmer Cetus Instrument DNA Using the Thermal Cycler, the steps of heat denaturation (94 ° C, 1 minute), annealing (55 ° C, 1 minute), and polymerase (72 ° C, 2 minutes) were repeated 30 times.
  • the TH6-2 strain is named Bacillus steer mouth thermophilus TH6-2-2 on February 4, 1989, 1-chome Tsukuba 1-chome, Ibaraki 305-8566, Japan It is deposited as FERM BP-2758 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • Bacillus 'Stear Mouth Thermophilus is now named Giobacillus' Stear Mouth Thermophilus.
  • the same strain was deposited as FERM BP-10466 on December 7, 2005 under the name of J. Bacillus' Stear mouth thermophilus TH6-2 in the Patent Organism Depositary.
  • Each of the DNAs was cleaved with restriction enzymes EcoRI and Pstl, and ligated with plasmid pTrc99A (obtained from Pharmacia Biotech), which was also digested with restriction enzymes EcoRI and Pstl, using T4 DNA ligase.
  • Each ligation reaction solution was used to transform E. coli JM109, and plasmids pTrc-ylnB and pTrc-yl nC were isolated from the resulting ampicillin resistant transformants.
  • Plasmid pTrc-ylnB is a plasmid carrying a DNA fragment containing the AT PS gene derived from D. bacillus' Stear mouth thermophilus TH6-2.
  • PTrc-ylnC was loaded with a DNA fragment containing the AP SK gene derived from the same strain. It is a plasmid.
  • the bacterial ATPS gene was the DNA base sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the bacterial APSK gene was the DNA base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the bacterial ATPS was the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the bacterial APSK was the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the ATPS showed 68% amino acid sequence homology with the Bacillus subtilis enzyme, and APSK showed 63% amino acid sequence homology with the Bacillus subtilis enzyme.
  • the cells are collected by centrifugation (10, OOOxg, 10 minutes) and suspended in 10 mL of buffer solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mM EDTA, lmM2-mercaptoethanol). Then, ultrasonic treatment was performed to disrupt the cells, and the cell residue was removed by centrifugation (10, OOOx g, 10 minutes). The supernatant fraction thus obtained was used as a crude enzyme solution.
  • buffer solution 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mM EDTA, lmM2-mercaptoethanol
  • the ATPS activity in each crude enzyme solution was measured as follows. In other words, the final concentrations were 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8), 20 mM magnesium sulfate, and ATPlmM, respectively, and lunit / mL pyrophosphatase (Roche Diagnostics) and lunit / mL APSK (Calbiochem). Then, the enzyme solution was added and incubated at 37 ° C for 10 minutes, and then the reaction was stopped by adding ice-cooled 0.5M sodium dihydrogen phosphate solution. The amount of PAPS produced was quantified by HPLC, and the amount of ATPS produced by 1 mole of PAPS per minute was defined as 1 unit.
  • APSK activity was measured as follows. That is, lunitZmL of pyrophosphatase (Roche Diagnostics), lunitZmL of ATP S (Calbiochem), and enzyme solution were added to the reaction mixture with final concentrations of Tris-HCl buffer (pH 8) 50 mM, magnesium sulfate 20 mM, and ATPlmM, respectively. The reaction was stopped, kept at 37 ° C for 10 minutes, and then the reaction was stopped by adding an ice-cooled 0.5 M sodium dihydrogen phosphate solution. The amount of PAPS produced was quantified by HPLC, and the amount of APSK produced by 1 mole of PAPS per minute was defined as 1U unit. The measurement results are shown in Tables 1 and 2.
  • the final concentration is 50 mM Hepes buffer (pH 8), 25 mM magnesium chloride, 100 mM sodium sulfate, 50 mM ATP, 5 units ZmL pyrophosphatase (Roche), 0.2% ATPS crude enzyme solution, 0.5% APSK crude enzyme solution was added and incubated at 37 ° C.
  • each crude enzyme solution was immersed in a water bath adjusted to 55 ° C for 30 minutes, then allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and centrifuged.
  • a reaction mixture was prepared by adding the same amount of the supernatant obtained from the separation to that described above, and kept warm in the same manner.
  • a reaction mixture was prepared by adding the same amount of the crude enzyme solution prepared from Escherichia coli JM109, which holds pTrc99A instead of both crude enzyme solutions, as a control container, and kept warm in the same manner.
  • Figure 1 shows the changes over time in the amount of PAPS produced in these reactions.
  • the amount of PAP S produced was 2-3 times greater at each time point when the PAPS synthesis efficiency was significantly higher.
  • the conversion ratio of 1Z2ATP to 10 hours after the start of the reaction was 75% for the reaction using both heat-treated crude enzyme solutions, compared to 38% for the same non-heat-treated crude enzyme solution. It was too much.
  • PPK2F1 5 '-TTCCATGGGAGAGGTGTAAGGCTTTCCT-3' SEQ ID NO: 11
  • PPK2F2 5 '-AACCATGGGCGAAGAACCCACTGTCAGT-3' SEQ ID NO: 12
  • PPK2F5 5 '-AACCATGGGCAGCGAGGACAGCACCTCG-3' (SEQ ID NO: 14)
  • PPK2F7 5 '-AACCATGGCGCGGATGCGCCGCAACGAG-3' SEQ ID NO: 16
  • PPK2F8 5, -AACCATGGACGAGTACGAGAAGGCCAAG-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • PPK2F9 5 '-TTCCATGGAGGTGCAGAGCTGGGTGAAG-3' SEQ ID NO: 18
  • PPK2F10 5 '-TTCCATGGACAGCACCTCGGCGAGCCT-3' SEQ ID NO: 19
  • PPK2F11 5 '-TTCCATGGCGAGCCTGCCGGCGAACTAT-3' SEQ ID NO: 20
  • PPK2R1 5 '-TTGGATCCTGCCGTACAAGCAGATCGTG-3' SEQ ID NO: 22
  • N-terminal region deletion by PCR Amplification of PNDK-encoding gene was performed in lOOmL (50 mM potassium chloride, lOmM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, temperate DNAO. l ⁇ g, each of the two primer DNAs of combinations 1 to 11 shown in Table 4 0.2 M, ExTaq DNA polymerase 2.5 units) was heated using a DNA Thermal Cycler manufactured by Perkin—Elmer Cetus Instrument. The steps of denaturation (94 ° C, 1 minute), annealing (55 ° C, 1.5 minutes) and polymerization (72 ° C, 1.5 minutes) were repeated 30 times.
  • Each ligation reaction solution was used to transform Escherichia coli JM109, and the resulting ampicillin-resistant transformants were used for each plasmid (pTrc-ppk2, pTrc-ppk2N3, pTrc-ppk2N60, pTrc-ppk2N72, pTrc- ppk2N74, pTrc—ppk2N78, pTrc—ppk2N80, pTrc—ppk2N81, pTrc—ppk2N84, pTrc—ppk2N89, pTrc—ppk2N94, and pTrc—ppk2N109) were isolated.
  • Plasmid pTrc—ppk2 is a gene encoding full-length PNDK
  • pTrc—ppk2N3 is a gene encoding PNDK lacking 2 amino acid residues on the N-terminal side (hereinafter referred to as PNDKN3)
  • pTrc—ppk2N60 Is a gene encoding PNDK lacking 59 amino acid residues on the N-terminal side (hereinafter referred to as PNDK N60)
  • pTrc—ppk2N72 is a gene encoding PNDK lacking 71 amino acid residues on the N-terminal side (hereinafter referred to as PNDKN72)
  • PTrc—ppk2N7 4 is a gene encoding PNDK lacking 73 amino acid residues on the N-terminal side (hereinafter referred to as PNDKN74)
  • pTrc—ppk2N78 is a PNDK lacking 77 amino acid residues
  • PTrc—ppk2N81 lacks 80 amino acid residues on the N-terminal side
  • pTrc—ppk 2N84 lacks 83 amino acid residues on the N-terminal side.
  • PTrc—ppk2N89 encodes a gene encoding PNDK lacking the N-terminal 88 amino acid residues (hereinafter referred to as PNDKN89)
  • pTrc—ppk2N94 refers to PNDK lacking the N-terminal 93 amino acid residue (hereinafter referred to as PNDKN94).
  • PTrc—p pk2N104 is a PNDK lacking 103 amino acid residues on the N-terminal side (hereinafter referred to as PNDKN104) Are inserted into the NcoI-BamHI cleavage site downstream of the trc promoter of the Ncol-BamHI DNA fragment strength pTrc99A.
  • Escherichia coli JM109 carrying each of the above plasmids was inoculated into 300 mL of 2xYT medium containing 100 g / mL ampicillin and cultured with shaking at 37 ° C.
  • IPTG was added to the culture solution to a final concentration of ImM, and shaking culture was continued at 37 ° C. for 5 hours.
  • the cells were collected by centrifugation (10, OOOxg, 10 minutes) and suspended in 30 mL of buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, lmM2-mercaptoethanol). Thereafter, ultrasonic treatment was performed to disrupt the cells, and the cells were removed by centrifugation (10, OOOxg, 10 minutes). The supernatant fraction thus obtained was used as a crude enzyme solution.
  • the unit of PNDK activity in the above crude enzyme solution was measured and calculated by the method shown below. That is, each of the above crude enzyme solutions was added to 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 10 mM magnesium chloride, 80 mM ammonium sulfate, 10 mM ADP, and polyphosphoric acid (30 mM as inorganic phosphoric acid). Then, the reaction was carried out by keeping the temperature at 37 ° C, and the reaction was stopped by heat treatment at 100 ° C for 1 minute. ATP in the reaction solution was quantified using high performance liquid chromatography (HPLC), and the activity to produce 1 ⁇ mol of ATP per minute at 37 ° C was defined as 1 unit. Table 5 shows the PNDK activity in the above-mentioned various N-terminal region-deleted PNDK crude enzyme solutions.
  • Pseudomonas aeruginosa-derived PNDK The preparation of Pseudomonas aeruginosa-derived PNDK is as described in Example 2.
  • E. coli sputum was prepared by the method described in the literature (J. Biosci. Bioeng., 91, 557-563 (2001)).
  • the unit of sputum activity was calculated by the method shown below. That is, an enzyme sample solution was added to 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 10 mM magnesium chloride, 80 mM ammonium sulfate, 10 mM ADP, and polyphosphoric acid (30 mM as inorganic phosphoric acid). After incubating at 37 ° C for 10 minutes, the reaction was stopped by treating in a boiling water bath for 1 minute. ATP in the reaction solution was quantified using high performance liquid chromatography (HPLC), and the activity to generate 1 ⁇ mol of ATP in 1 minute was defined as 1 unit.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • PAP derived from Acinetobacter johnsonii was prepared by the method described in the literature (WO03Z100056).
  • the unit of PAP activity (unit) was calculated by the following method. That is, the enzyme sample solution was added to 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 10 mM magnesium chloride, 80 mM ammonium sulfate, 10 mM AMP, and polyphosphoric acid (30 mM as inorganic phosphoric acid). After incubating at 37 ° C for 10 minutes, the reaction was stopped by treating in a boiling water bath for 1 minute. ATP in the reaction solution was quantified using high performance liquid chromatography (HPLC), and the activity to generate 1 ⁇ mol of ADP per minute was defined as 1 unit.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • E. coli ADK was prepared by the method described in the literature (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14168-14171 (200 0)).
  • the unit of ADK activity was calculated by the method shown below. That is, add enzyme sample solution to 50 mM Tris-HCl buffer (PH8.0) containing 10 mM sodium chloride, 10 mM AMP, and 10 mM ATP, incubate at 37 ° C for 10 minutes, and then add 1 in a boiling water bath. The reaction was stopped by treating for minutes. ATP in the reaction solution was quantified using high performance liquid chromatography (HPLC), and the activity to generate 2 ⁇ mol of ADP per minute was defined as 1 unit.
  • PH8.0 Tris-HCl buffer
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Inorganic pyrophosphatase was from Roche Diagnostics.
  • the unit of inorganic pyrophosphatase activity was calculated by the method shown below. In other words, add enzyme sample solution to 50 mM Tris-HCl buffer (PH8.0) containing 10 mM magnesium chloride and 10 mM inorganic pyrophosphate, incubate at 37 ° C for 10 minutes, and then in a boiling water bath for 1 minute. The reaction was stopped by treatment. The amount of inorganic phosphoric acid produced was determined according to the method of Molybden venoré ("Treatise on Analytical Chemistry" l. M. Kolthoff & P. J. Elving, Vol. 5, pages 317-402, Interscience, New York (1961)). The amount of inorganic pyrophosphatase that was quantified and produced 2 mol of inorganic phosphoric acid per minute was defined as 1 unit.
  • ADK (0.1 unit ZmL) ⁇ PNDK (0.1 unit ZmL) in 50 mM Hepes—KOH buffer (pH 8.0) containing 25 mM magnesium chloride, 20 mM AMP, lOOmM sodium sulfate, polyphosphoric acid (lOOmM as phosphoric acid) ) ⁇ ATPS (0.25 unit ZmL), APSK (0.25 unit ZmL) and inorganic pyrophosphatase (1.0 unit ZmL) were added and incubated at 37 ° C.
  • Figure 2 shows the changes over time in the reaction solution composition. In the reaction, the concentration of ATP produced was higher than that of ADP and AMP, and the amount of PAPS produced after 48 hours was 12. OmM (vs. AMP conversion 60%).
  • PAP 0.1 unit ZmL
  • PNDK 0.1 unit ZmL
  • a PSK (0.25 unit ZmL) and inorganic pyrophosphatase (1.0 unit ZmL) were added and incubated at 37 ° C.
  • Figure 3 shows the changes over time in the reaction solution composition. Also in the reaction, the concentration of ATP produced remained high relative to that of ADP and AMP, and the amount of PAPS produced after 48 hours was 12.3 mM (vs. AMP conversion rate 62%).
  • Comparative Example 1 PAPS synthesis using conventional ATP supply / regeneration system conjugated using the cooperative action of PPK and ADK
  • PPK 0.1 unit ZmL
  • ADK 0.1 unit ZmL
  • 50 mM Hepes—KOH buffer pH 8.0
  • 25 mM magnesium chloride 20 mM AMP, lOOmM sodium sulfate, polyphosphoric acid (lOOmM as phosphoric acid)
  • ATPS (0.25 unit ZmL
  • AP SK (0.25 unit ZmL)
  • inorganic pyrophosphatase 1.0 unit ZmL
  • Comparative Example 2 Conventional ATP supply using PAP and ADK ⁇ PAP S synthesis conjugated with regeneration system

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Abstract

　本発明は、アデノシン５’－トリリン酸スルフリラーゼ（ＡＴＰＳ）とアデノシン５’－ホスホ硫酸キナーゼ（ＡＰＳＫ）とを用い、ＡＴＰを硫酸化およびリン酸化して３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）を製造する方法において、ＡＴＰの代わりに、アデノシン５’－モノリン酸（ＡＭＰ）、ポリリン酸、ポリリン酸依存的ヌクレオシド５’－ジリン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）およびポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素（ＰＡＰ）からなるアデノシン５’－トリリン酸（ＡＴＰ）の供給・再生系、またはアデノシン５’－モノリン酸（ＡＭＰ）、ポリリン酸、ポリリン酸依存的ヌクレオシド５’－ジリン酸キナーゼ（ＰＮＤＫ）およびアデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）からなるアデノシン５’－トリリン酸（ＡＴＰ）の供給・再生系を利用することを特徴とするＰＡＰＳの製造法に関する。

Description

明 細 書
3，—ホスホアデノシン— 5，—ホスホ硫酸の酵素合成法
技術分野
[0001] 本発明は、耐熱性細菌ジォバチルス 'ステア口サーモフィルス由来のアデノシン 5， —トリリン酸スノレフリラーゼ (adenosine 5，一triphosphate sulfurylase： ATPS) とァテノシン 5'—ホスホ硫酸キナーゼ (adenosine 5'— phosphosulfate kinase ： APSK)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)由来のポリリン酸依存的ヌクレオ シド 5'—ジリン酸キナーゼ (Polyphosphate— Driven Nucleoside Diphosphat e Kinase ;PNDK)、該 PNDKを利用したアデノシン 5，一トリリン酸（adenosine 5 ，一 triphosphate :ATP)供給'再生系、および該 ATPSと APSKと ATP供給'再生 系をリンクさせた実用的な 3，一ホスホアデノシン一 5，一ホスホ硫酸（3， -phosphoa denosine 5，—phosphosulfate : PAPS)の酵素合成法に関するものである。 背景技術
[0002] PAPSは、微生物から植物、高等動物に至るまで広く生体内で利用される硫酸供 与体である。また、プロテオダリカン疾患に代表されるいくつかの疾患と PAPSとの関 わりも報告されており、 PAPSの生体内での役割は非常に重要で、医薬品などの分 野で利用される可能性がある。
[0003] PAPSの酵素合成法として、例えば、パン酵母やラット肝臓カゝら抽出した ATPSと A PSKの二つの酵素を用いた 2段階反応により、 ATP力 製造する方法（下記式 1お よび 2)が知られている。
[0004] しかし、この方法では、数ミリグラム力も数十ミリグラムの PAPSし力製造することがで きず、かつ、高価な ATPを必要とし、産業的に実用的な方法とはいい難い。
[0005] [化 1]
AT P S
AT P + 'S 04 2 A P S + P P i (式 1 )
A P S K
A P S +AT P > P A P S + AD P (式 2 )
[0006] (上記式中、 ATPはアデノシン 5，一トリリン酸、 ADPはアデノシン 5，一ジリン酸、 AP Sはアデノシン 5，—ホスホ硫酸、 PPiは無機ピロリン酸、 SO 2_は硫酸イオンを示す）
4
[0007] したがって、 PAPSを実用的に生産せしめるには、生産性および操作性に優れた 微生物由来酵素を用いること (第 1の課題)と、高価 ATPを必要としない ATP供給' 再生系の構築 (第 2の課題)が必須となる。
[0008] 恩田らは、第 1の課題を解決するため、バチルス属細菌またはサーマス属細菌由来 の熱安定性の高い ATPSおよび APSKの 2つの酵素を用いることにより、 2段階反応 により PAPSを効率よく生産せしめることが可能であることを報告して 、る（特許文献 1 〜3)。
[0009] しかし、恩田らの方法を実施するためには、当該耐熱性細菌の菌体破砕液より AT PSおよび APSKを精製しなくてはならない。し力しながら、当該両酵素の細胞内含 有量は低ぐこのため大量の菌体培養を必要とし、かつ、両酵素の精製操作が極め て煩雑であると!/、う問題があった。
[0010] 一方、第 2の課題を解決するため、伊吹らは、 PAPS合成系にァセチルリン酸と酢 酸キナーゼからなる ATP再生系をリンクさせ、 APSK反応で生成する ADPを ATPに 変換して再利用する方法を報告して ヽる (非特許文献 1)。
[0011] しかし、反応当初には依然として高価な ATPを基質として使用して、また ATP再生 のためのリン酸供与体として高価なァセチルリン酸を多量に使用することから、該法 は実践的な方法となり得な力つた。
[0012] 従来、安価なリン酸ドナーとしてはポリリン酸 (Poly P )が知られており、このポリリ ン酸を用いたアデノシン 5，一モノリン酸（adenosine 5， - monophosphate： AMP )からの ATP供給 ·再生系としては、下記式（3)および (4)で示されるポリリン酸キナ ーゼ (PPK)およびアデニル酸キナーゼ (ADK)の協調作用を利用する系（特許文 献 4)と下記式（5)および (6)で示されるポリリン酸: AMPリン酸転移酵素（PAP)およ び ADKを利用する系（特許文献 5)が知られている。
[0013] [化 2]
PPKZADK協調作用
Poly Pn + AMP > Poly Pn _ ! + ADP (式 3 )
PPK
Poly P„ + ADP < > Poly Pn 丄 + ATP (式 4 ) [0014] [化 3]
PAP
Poly Pn + AMP > Poly Pn ^ + ADP (式 5 )
ADK
2ADP < > ATP + AMP (式 6 )
[0015] (上記式中、 ATPはアデノシン 5'—トリリン酸、 ADPはアデノシン 5'—ジリン酸、 AM Pはアデノシン 5，—モノリン酸、 Poly Pはポリリン酸、 nは整数を示す）
[0016] この PPKおよび ADKの協調作用を利用する ATP供給 ·再生系を PAPSの酵素合 成に応用することも、既に報告されているが（特許文献 6)、この方法を詳細に解析し た結果、 PAPSの生成量は最大でも 5mM程度でしかないことが判明した。この低収 量の原因を鋭意検討したところ、 PPKおよび ADKの協調作用を利用した ATP供給 •再生系が効果的に機能せず、反応系内の ATP濃度を ADPや AMPに対してドミナ ントに維持することが困難であり、これが結果として PAPS生成を非効率的なものとし て!、ることが判明した (後述の比較例 1参照)。
[0017] PPKは生体内ではポリリン酸合成酵素として機能していると考えられており、式 (4) に示される該酵素反応の平衡はポリリン酸合成側に大きく偏っている（非特許文献 2) 。また、その ATP合成活性は微弱であるため、該酵素を利用した ATP供給'再生系 は、例えば、基質濃度が 5mM程度以下の低い濃度での反応では良好に機能するも のの、基質濃度が 10mMを超えるような高い濃度での反応では十分に機能し得ない ことが判明した。
[0018] また、 PAPおよび ADKを利用する ATP供給 ·再生系を PAPSの酵素合成に応用 した例は報告されていないが、 ADKが式 (6)の反応を完全に可逆的に触媒するた め、後述の比較例 2に示すように、反応系内の ATP濃度を高く保つことができず、結 果として PAPSの生成は非効率的であった。
[0019] したがって、 PAPSの実践的製造を可能とするためには、 ATP濃度を ADPや AM Pに対してドミナントに維持可能な、強力な新規 ATP供給'再生系を構築することが 不可欠であった。
[0020] このような強力な ATP供給 ·再生系を構築するための一手段として、緑膿菌 (Pseu domonas aeruginosa)由来のポリリン酸依存的ヌクレオシド 5，ージリン酸キナーゼ (Polyphosphate― Driven Nucleoside Diphosphate Kinase ; PNDK)の禾 lj 用が考えられる。すなわち、最近、緑膿菌由来の PNDKが同定され (非特許文献 3、 4)、該酵素をコードする遺伝子も取得されている (非特許文献 2、 5)。
[0021] さらに、この PNDKが、 PPKと類似したポリリン酸依存的な ADPのリン酸化活性を 示すものの、そのアミノ酸配列は PPKのそれと全く相同性を有さず、また、大腸菌由 来 PPKの 100倍以上、緑膿菌由来 PPKの約 1000倍にも及ぶ顕著に高い比活性を 有する酵素であり（非特許文献 2)、 PPKとは対照的に、ポリリン酸合成活性が事実上 無視できるほど微弱であり、反応平衡が ATP合成側に大きく偏っているため、 ATP の供給 ·再生系に用いる酵素として理想的であると考えられる。
[0022] し力しながら、該酵素の緑膿菌における生産性は低いことから、該酵素を産業的に 用いるためには、遺伝子組み換え技術を利用して当該酵素の遺伝子をクローンィ匕し 、大腸菌などを宿主として該酵素を大量生産させることが必要であるが、本発明者ら が過去に行った実験では、遺伝子組み換え技術を利用したとしても、該酵素の生産 性はあいかわらず低ぐ該酵素の実用化は困難であった。
特許文献 1 :特許第 3098591号
特許文献 2：特許第 3078067号
特許文献 3：特許第 3029915号
特許文献 4： WO98/48031
特許文献 5 :WO03Zl00056
特許文献 6：特開 2002— 78498
非特許文献 1 : Nucleic Acids Symp. Ser. , 27, 171 - 172 (1992) 非特許文献 2 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 16684- 16688 (2002) 非特許文献 3 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 439-442 (1997) 非特許文献 4: Biochem. Biophys. Res. Commun. , 281, 821 -826 (2001) 非特許文献 5 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 16678- 16683 (2002) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0023] したがって、実用的な PAPS製造法を確立すベぐ本発明は、最初に耐熱性細菌 ジォバチルス'ステア口サーモフィルス（旧バチルス'ステア口サーモフィルス）染色体 より ATPSおよび APSKをコードする遺伝子を見出し、組換え DNA手法を用いた当 該酵素の大量製造を目的とする。
[0024] 次に、本発明は、組換え DNA技術を利用した PNDKの効率的な生産を確立する ことを目的とする。
[0025] 最後に、本発明は、 PNDKを用いた極めて強力な ATP供給'再生系の構築と、こ の ATP供給 ·再生系と耐熱性細菌ジォバチルス ·ステア口サーモフィルス由来の AT PSおよび APSKをリンクさせた PAPSの効率的な製造法の提供を目的とする。 課題を解決するための手段
[0026] 本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意検討を重ねた結果、耐熱性細菌ジォ バチルス'ステア口サーモフィルス染色体より ATPSおよび APSKをコードする遺伝 子を初めて見出し、組換え DNA手法を用いて当該酵素の大量製造を可能なものに した。さらに、当該酵素を高生産する大腸菌粗抽出液に加熱処理を施すことで、 PA PS合成活性が顕著に向上し、これによつて、当該両酵素を特別な精製を施すことな ぐ効率的な PAPS製造が可能となった。
[0027] 次に、既に報告されている 357アミノ酸残基より成る PNDKをコードするポリヌクレ ォチドを精査し、 N末端側の数十アミノ酸残基相当分の塩基配列を人為的に欠失さ せた DNA断片を用いることで、当該酵素の生産性が著しく向上し、目的とする酵素 活性も失わないことを見出した。
[0028] さらに、 AMPをリン酸化して ADPを生成させる酵素として PAPを、 ADPをリン酸ィ匕 して ATPを生成 ·再生させる酵素として上記の PNDKをそれぞれ選択し、両者を組 み合わせることで、極めて強力に AMPから ATPを供給でき、かつ供給された ATPを 高 ヽ濃度で維持させることが可能であることを見出した (下記式 7および 8参照)。
[0029] [化 4]
PAP
Poly Pn + AMP > Poly Pn _ t + ADP (式 7 )
PNDK
Poly Pn + ADP > Poly Pn - 1 + ATP (式 8 ) [0030] さらに、 PNDKを ADKと共存させた場合、 PPKを ADKと共存させた場合、特許文 献 4と同様に、両者の協調作用でポリリン酸依存的な AMPのリン酸ィ匕活性が生じるこ と、生じた ADPは、 PNDK単独での強力な ADPリン酸化活性によって即座に ATP に変換され、 PNDKと ADKの組み合わせがやはり AMPからの強力な ATP供給'再 生系として機能しうることも見出した（下記式 9および 10参照)。
[0031] [化 5]
PNDKZADK協調作用
Poly Pn + AMP > Poly Pn—！ + ADP (式 9 )
PNDK
Poly Pn + ADP > Poly Pn— t + ATP (式 1 0 )
[0032] そして、 PAPおよび PNDKより成る ATP供給'再生系、または ADKおよび PNDK より成る ATP供給 ·再生系の!ヽずれかを、ジォバチルス ·ステア口サーモフィルス由来 の ATPSおよび APSKPAPSを用いた PAPSの酵素合成に応用した場合、いずれ の ATP供給 ·再生系も反応系内の ATP濃度を ADPや AMPに対してドミナントに維 持し、結果として PAPSを効率的に合成できることを見出した。
[0033] したがって、本発明は、以下の通りのものである。
(1)配列番号 1で示される塩基配列からなり、ジォバチルス 'ステア口サーモフィルス 由来のアデノシン 5 '—トリリン酸スルフリラーゼ（ATPS)をコードする DNA断片。
(2)配列番号 1で示される塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基が欠失、置換 、挿入または付加された塩基配列カゝらなり、 ATPS活性を有する酵素をコードする D NA断片。
[0034] (3)上記（1)に記載の DNA断片とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 ATP S活性を有する酵素をコードする DNA断片。
(4)上記（1)〜（3)記載の 、ずれかの DNA断片を用い、組換え DNA手法にて AT PS活性を有する粗酵素を調製し、得られた粗酵素を加熱処理することを特徴とする 、 ATPSまたは ATPS活性を有する酵素の調製法。
[0035] (5) 45〜65°Cで加熱処理する、上記 (4)の調製法。
(6)配列番号 2で示される塩基配列からなり、ジォバチルス 'ステア口サーモフィルス 由来のアデノシン 5， 一ホスホ硫酸キナーゼ (APSK)をコードする DNA断片。 [0036] (7)配列番号 2で示される塩基配列力 なり、 1個もしくは数個の塩基が欠失、置換、 挿入または付加された塩基配列力もなり、 APSK活性を有する酵素をコードする DN A断片。
(8)上記（6)に記載の DNA断片とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 APS
K活性を有する酵素をコードする DNA断片。
[0037] (9)上記（6)〜（8)記載のいずれかの DNA断片を用い、組換え DNA手法にて APS
K活性を有する粗酵素を調製し、得られた粗酵素を加熱処理することを特徴とする、
APSKまたは APSK活性を有する酵素の調製法。
(10) 45〜65°Cで加熱処理する、上記（9)の調製法。
[0038] (11)上記 (4)記載の方法により調製された ATPSと上記（9)記載の方法で調製され た APSKを用い、硫酸イオンとアデノシン 5，一トリリン酸 (ATP)から 3，一ホスホアデ ノシン一 5'—ホスホ硫酸 (PAPS)を酵素的に合成することを特徴とする、 PAPSの製 造法。
(12)配列番号 9で示される塩基配列中の 101〜 1171からなるポリリン酸依存的ヌク レオシド 5，一二リン酸キナーゼ（PNDK)をコードするポリヌクレオチドにおいて、 N末 端側の少なくとも 72アミノ酸残基相当の塩基配列を欠失した DNA断片。
[0039] (13)少なくとも 73アミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（12)記載の DN A断片。
(14) 72以上、 87以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（12)記載 の DNA断片。
[0040] (15) 73以上、 83以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（12)記載 の DNA断片。
(16) 73、 77、 80または 83のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、上記（12) 記載の DNA断片。
[0041] (17)上記（12)〜（16)いずれかの塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基が置 換、挿入または付加された塩基配列力もなり、 PNDK活性を有する酵素をコードする DNA断片。
(18)上記（12)〜（16)いずれかに記載の DNA断片とストリンジェントな条件下でノヽ イブリダィズし、 PNDK活性を有する酵素をコードする DNA断片。
[0042] (19)上記（12)〜（18)記載のいずれかの DNA断片を用い、組換え DNA手法にて PNDKを調製する、 PNDKの製造法。
(20)上記（19)記載の方法により調製された、配列番号 10の N末端側の少なくとも 7 2アミノ酸を欠落したアミノ酸配列を有する PNDK。
[0043] (21)アデノシン 5，一モノリン酸 (AMP)、ポリリン酸、ポリリン酸依存的ヌクレオシド 5， —ジリン酸キナーゼ（PNDK)およびポリリン酸: AMPリン酸転移酵素（PAP)力もな るアデノシン 5'—トリリン酸 (ATP)の供給'再生系。
(22)アデノシン 5，—モノリン酸 (AMP)、ポリリン酸、ポリリン酸依存的ヌクレオシド 5， ージリン酸キナーゼ（PNDK)およびアデ-ル酸キナーゼ (ADK)力 なるアデノシン 5 '—トリリン酸 (ATP)の供給 ·再生系。
[0044] (23) PNDKが、シユードモナス（Pseudomonas)属に属する微生物由来のものであ る、上記（21)または（22)記載の ATPの供給，再生系。
(24) PNDK力 上記（20)記載の PNDKである、上記（21)または（22)記載の ATP の供給'再生系。
[0045] (25) PAP力 ァシネトパクター（Acinetobacter)属に属する微生物由来のものであ る、上記（21)または（22)記載の ATPの供給，再生系。
(26) ADKが大腸菌または酵母由来のものである、上記（21)または（22)記載の AT Pの供給 ·再生系。
[0046] (27)組換え DNA手法で形質転換した形質転換体、該形質転換体の処理物または 該処理物から得られる酵素を酵素源として使用する、上記（21)または（22)記載の A TPの供給 ·再生系。
(28) ATPをエネルギー源および Z叉は基質として消費する酵素反応により生成さ れる有用物質を安価かつ効率的に製造する方法であって、 ATPの代わりに、上記（ 21)〜（26)の 、ずれか 1項に記載の ATPの供給'再生系を利用することを特徴とす る有用物質の製造法。
[0047] (29) ATPをエネルギー源および Z叉は基質として消費する酵素反応により生成さ れる有用物質が、 3，一ホスホアデノシン 5，一ホスホ硫酸（PAPS)、糖ヌクレオチド 、 S アデノシルメチォニン（SAM)のいずれかである、上記（28)記載の有用物質の 製造法。
[0048] (30)アデノシン 5，一トリリン酸スルフリラーゼ (ATPS)とアデノシン 5，一ホスホ硫酸キ ナーゼ（APSK)とを用い、 ATPを硫酸化およびリン酸化して 3， 一ホスホアデノシン 5' ホスホ硫酸 (PAPS)を製造する方法において、 ATPの代わりに、上記（21) 〜（27)のいずれか一項に記載の ATPの供給'再生系を利用することを特徴とする P APSの製造法。
(31) ATPSと APSKと力、ジォバシラス (Geobacillus)属に属する微生物由来のも のである、上記（30)記載の PAPSの製造法。
[0049] (32)上記 (4)記載の方法により調製された ATPSと上記（9)記載の方法で調製され た APSKを用いる、上記（30)記載の PAPSの製造法。
(33) 30〜50°Cの反応温度下、 PAPSを酵素合成する、上記（30)記載の PAPSの 製造法。
発明の効果
[0050] ジォバチルス 'ステア口サーモフィルス由来の ATPSおよび APSKのアミノ酸配列 および塩基配列共にまったく報告されていない状況において、本発明者らによって、 ジォバチルス ·ステア口サーモフィルス由来の ATPSおよび APSKに相当する遺伝 子のクロー-ングに初めて成功し、これによりジォバチルス'ステア口サーモフィルス 由来の ATPSおよび APSKを遺伝子工学の手法で大量に製造することが可能となつ た。また、遺伝子工学で得られた両酵素は活性的に満足できるものではな力つたが、 加熱処理という極めて簡便かつ実践的な処理を施すことで両酵素の PAPS合成活 性が飛躍的に高まることを見出し、これにより PAPSをより簡便かつ大量に製造するこ とを初めて可能とした。
[0051] また、既に報告されている PNDKの N末端側の少なくとも 72アミノ酸残基相当の塩 基配列を欠失した DNA断片を使用することで、 N末端側の少なくとも 72アミノ酸残基 相当分を欠落したアミノ酸配列を有する PNDKを簡便かつ大量に製造することが初 めて可能となった。この N末欠損の PNDKは、 PNDK自体の活性は維持されている ため、この PNDKを利用することで、実用的な ATP合成'再生系および GTP合成 · 再生系を構築することができる。
[0052] さらに、本発明の ATPの供給 ·再生系は、 AMP、ポリリン酸などの安価な原料のみ を使用し、これを PAPSの合成に応用した場合、反応系内の ATP濃度を ADPや A MPに対してドミナントに維持可能であり、対 AMP転換率 60%以上の効率で PAPS を合成することができる。この合成効率は、従来の PPKおよび ADKの協調作用を利 用した ATP供給 ·再生系を応用したときの 5倍以上の効率であり、 PAPおよび ADK を利用した ATP供給 ·再生系を応用したときの 1. 5倍以上の効率である。
[0053] さらにまた、 ATPSと APSKとしてジォバシラス（Geobacillus)属に属する微生物 由来のもの、 PNDKとしてシユードモナス（Pseudomonas)属に属する微生物由来 のもの、 PAPとしてァシネトパクター（Acinetobacter)属に属する微生物由来のもの 、 ADKとして大腸菌または酵母由来のものを使用することで、 30〜50°Cの反応温度 であっても酵素活性の低下を招くことなぐそれぞれの酵素が協調して PAPSを効率 的に合成可能である。
図面の簡単な説明
[0054] [図 1]ATP供給 ·再生系を共役させない時の、 PAPSの経時的な生成量を示したもの である（実施例 1の（3) )。國はコントロール反応での PAPS生成量、▲は非加熱処理 の粗酵素を用いた反応での PAPS生成量、參は加熱処理粗酵素液を用いた反応で の PAPS生成量をそれぞれ示す。
[図 2] ADKおよび PNDKを利用した本発明の ATP供給 ·再生系を共役させた PAP
S合成反応における、経時変化を示したものである（実施例 3の（7) )。
[図 3]PAPおよび PNDKを利用した本発明の ATP供給 ·再生系を共役させた PAPS 合成反応における、経時変化を示したものである（実施例 3の（8) )。
[図 4]PPKおよび ADKの協調作用を利用した従来の ΑΤΡ供給 ·再生系を共役させ た PAPS合成反応における、経時変化を示したものである（比較例 1)。
[図 5]PAPおよび ADKを利用した従来の ATP供給 ·再生系を共役させた PAPS合 成反応における、経時変化を示したものである（比較例 2)。
発明を実施するための最良の形態
[0055] (A)ジォバチルス 'ステア口サーモフィルス由来 ATPSおよび APSK ジォバチルス'ステア口サーモフィルス由来 ATPSおよび APSKは、それぞれ配列 番号 3および配列番号 4に表したアミノ酸配列を有する酵素、あるいは、配列番号 3 および配列番号 4のアミノ酸配列における 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換また は付加されたアミノ酸配列を有する酵素である。
[0056] 数個のアミノ酸の欠失とは、例えば 30アミノ酸以内をいい、好ましくは 10アミノ酸以 内の欠失を意味する。また、数個のアミノ酸の置換とは例えば 25アミノ酸以内をいい 、好ましくは 10アミノ酸以内の置換を意味する。さらに、数個のアミノ酸の付加とは例 えば 40アミノ酸以内をいい、好ましくは 20アミノ酸以内の付カ卩を意味する。また、アミ ノ酸の欠失、置換または付カ卩は、配列番号 3または配列番号 4のアミノ酸配列と 85% 以上、さらに 90%以上、特に 95%以上の相同性を有するものが含まれる。これらの 変更を有する場合でも、 ATPSまたは APSK活性をそれぞれ有することが必要であ る。
[0057] ジォバチルス 'ステア口サーモフィルス由来 ATPSおよび APSKをコードする遺伝 子は、それぞれ配列番号 1および配列番号 2に表した塩基配列を有する遺伝子であ り、あるいは、配列番号 1および配列番号 2の塩基配列における 1もしくは複数の塩基 が欠失、置換または付加された塩基配列を有する遺伝子である。 1もしくは複数の塩 基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する遺伝子としては、配列番号 1ま たは 2の DNA断片とストリンジェントな条件でハイブリダィズするものが挙げられる。こ こでストリンジェントな条件としては、 0. 1%SDSを含む 0. 2 X SSC中 50°C、 0. 1% SDSを含む 1 X SSC中 60°C等の条件が挙げられる。 1もしくは複数の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列を有する遺伝子には、配列番号 1または配列番号 2 の塩基配列と 85%以上、さらに 90%以上、特に 95%以上の相同性を有するものが 含まれる。このような遺伝子は、例えば、配列番号 1および配列番号 2それぞれの両 端部分の合成 DNAをプライマーとし、ジォバチルス'ステア口サーモフィルス染色体 DNAを铸型とする PCR法によって目的遺伝子を増幅する方法によって取得すること ができる。
[0058] 単離された各遺伝子はベクター DNAに連結することにより各種の宿主一ベクター 系に保持させることができる。宿主としては微生物、昆虫細胞、培養細胞等、種々の ものを用いることができる。微生物、例えば大腸菌を用いた場合には EK1系、酵母を 用いた場合には SC1系を用いることができる。
[0059] 微生物を宿主として用いた場合、ベクターとしては菌体内に安定に保持されるもの であれば巿販のいかなるプラスミドも使用可能である。例えば、宿主として大腸菌を 用いた場合には、 pTrc99A (アマシャム）等のプラスミドの使用が好ましい。
[0060] クローン化された遺伝子 (DNA断片）を特定のプロモーター配列の下流に連結す ることにより、本発明の ATPSおよび APSKを大量に生産させることができる。例えば 、 pTrc99Aは発現誘導可能な trcプロモーターを有し、培養の途中でイソプロピル— β D チォガラタトピラノシド (IPTG)を培地へ添加することにより、目的とする AT PSおよび APSKを生産させることができる。
[0061] 形質転換体の培養は、常法により実施できる。すなわち、バシラス属または大腸菌 類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、 LB培地（1%ト リプトン、 0. 5%イーストエキス、 1%食塩)または 2xYT培地（1. 6%トリプトン、 1%ィ 一ストエキス、 0. 5%食塩)などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、 3 0〜50°Cで 10〜50時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠 心分離して微生物菌体を回収することができる。
[0062] 上記微生物菌体を機械的破壊 (ワーリンダブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイ ザ一、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥 (凍結乾燥、風乾などによる）、 酵素処理 (リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理 (酸、アルカリ処理などによ る）などの公知な方法で破砕し、得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは 細胞膜の変性物などの菌体処理物を本発明の ATPSおよび APSKの粗酵素液とし て用いることができる。
[0063] このようにして得られた ATPSおよび APSKは、上記粗酵素液に加熱処理を施すこ とで、 PAPS合成活性を高めることができる。加熱処理は、 45°Cから 65°Cの温度で 5 分から 1時間程度保温することで行うことができ、好ましくは、 55°Cで 30分程度の処 理が効果的である。
[0064] (B)緑膿菌由来の PNDK
[0065] 本発明で使用する DNA断片は、配列番号 9で示される塩基配列の 101〜1171か らなる PNDKをコードするポリヌクレオチドにおいて、少なくとも N末端側の 72アミノ酸 残基相当の塩基配列、好ましくは 73アミノ酸残基相当の塩基配列を欠失した DNA 断片である。
[0066] このような DNA断片の中で、 72以上、 87以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を 欠失した DNA断片、好ましくは、 73以上、 83以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列 を欠失した DNA断片が例示され、より具体的には、後述実施例に示す 73、 77、 80 または 83のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した DNA断片を挙げることができ る。
[0067] このような DNA断片は、後述実施例に詳述されているように、 PNDKをコードする p pk2構造遺伝子の目的とするアミノ酸相当分を欠失させた後の 5'末端に対応する合 成 DNA、および ppk2構造遺伝子の 3'末端部分の合成 DNAの 2種のプライマーを 用い、緑膿菌染色体 DNAを铸型として PCR法によって目的とする DNA断片を増幅 すること〖こよって取得することができる。
[0068] 単離された各 DNA断片はベクター DNAに連結することにより各種の宿主一べクタ 一系を構築でき、選択した宿主 ベクター系で汎用されている方法により目的とする 本発明の PNDKを製造することができる。
[0069] 本発明の PNDKの製造に際し、宿主としては、微生物、昆虫細胞、培養細胞等種 々のものを用いることができる。例えば、大腸菌を用いた場合には EK1系、酵母を用 いた場合には SC1系を用いることができる。
[0070] 微生物を宿主として用いた場合、ベクターとしては菌体内に安定に保持されるもの であれば巿販のいかなるプラスミドをも使用可能である。例えば、宿主として大腸菌を 用いた場合には、 pTrc99A (アマシャム）等のプラスミドの使用が好ましい。
[0071] クローン化された遺伝子 (DNA断片）を特定のプロモーター配列の下流に連結す ることにより、本発明の PNDKを大量に生産させることができる。例えば、 pTrc99A は発現誘導可能な trcプロモーターを有し、培養の途中でイソプロピル β D チ ォガラタトビラノシド (IPTG)を培地へ添加することにより、目的とする PNDKを生産さ せることができる。
[0072] 形質転換体の培養は、常法により実施できる。すなわち、バシラス属または大腸菌 類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、 LB培地（1%ト リプトン、 0. 5%イーストエキス、 1%食塩)または 2xYT培地（1. 6%トリプトン、 1%ィ 一ストエキス、 0. 5%食塩)などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、 3 0〜50°Cで 10〜50時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠 心分離して微生物菌体を回収することができる。
[0073] 上記微生物菌体を機械的破壊 (ワーリンダブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイ ザ一、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥 (凍結乾燥、風乾などによる）、 酵素処理 (リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理 (酸、アルカリ処理などによ る）などの公知な方法で破砕し、得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは 細胞膜の変性物などの菌体処理物を本発明の PNDK粗酵素液として用いることが できる。
[0074] また、場合によっては、上記菌体処理物から PNDK活性を有する画分を通常の酵 素の精製手段 (塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種ク 口マトグラフィー処理など）により精製し、部分精製酵素あるいは精製酵素として用い ることちでさる。
[0075] このようにして調製した本発明の PNDKは、使用した DNA断片に対応し、配列番 号 10の N末端側の少なくとも 72アミノ酸残基相当分を欠落したアミノ酸配列を有する PNDKである。
[0076] (C)ATP供給'再生系
本発明の ATP供給.再生系としては、（i)AMP、ポリリン酸、 PNDKおよび PAPか らなる ATPの供給.再生系と（ii)AMP、ポリリン酸、 PNDKおよび ADKからなる AT Pの供給'再生系が包含される。ここで、本発明の ATP供給'再生系は、 ATP供給- 再生系を構成する試薬を包含する。
[0077] PAP、 ADKおよび PNDKはすべて公知の酵素であり、動物由来、植物由来、微 生物由来など特定の由来に限定されない。酵素調製の簡便さなどの点から微生物 由来の酵素を使用するのが好都合である。また、近年の遺伝子組換え技術を利用し て当該遺伝子をクローン化し、大腸菌などを宿主として大量生産させ、得られた組換 ぇ菌より当該酵素を調製することも可能である。 [0078] この中でも、 PNDKとして上述したシユードモナス（Pseudomonas)属に属する微 生物由来のもの、 PAPとしてァシネトパクター（Acinetobacter)属に属する微生物 由来のもの、 ADKとして大腸菌または酵母由来のものを酵素として使用するのが好 ましい。
[0079] 反応系に添加する上記各酵素は、所望の活性を有する限りどのような形態であって もよぐ具体的には、微生物の菌体 (形質転換体を含む）、該菌体の処理物または該 処理物から得られる酵素などを例示することができる。微生物の菌体の調製は、当該 微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法 で行うことができる。具体的に、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例に挙げ 説明すれば、培地としてはブイヨン培地、 LB培地（1%トリプトン、 0. 5%イーストェキ ス、 1%食塩)または 2xYT培地（1. 6%トリプトン、 1%イーストエキス、 0. 5%食塩） などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、 30〜50°Cで 10〜50時間程 度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を回 収することができる。
[0080] 微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊 (ワーリンダブレンダ 一、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（ 凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理 (リゾチームなどによる）、超音波処理、化学 処理 (酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる 菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
[0081] 酵素としては、上記菌体処理物から所望の酵素活性を有する画分を通常の酵素の 精製手段 (塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマ トグラフィー処理など)を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができ る。
[0082] 本発明の ATPの供給 ·再生系に添加する AMP (市販品）、ポリリン酸 (市販品）、各 種酵素（PAP、 PNDKおよび ADK)濃度は、 ATP供給，再生系を応用する有用物 質によって異なるものの、 AMPとしては、例えば l〜200mM、好ましくは 10〜100 mMの範囲、ポリリン酸としては、無機リン酸に換算して 1〜： L000mM、好ましくは 50 〜500mMの範囲、酵素濃度としては 0. 001ユニット ZmL以上、好ましくは 0. 001 〜10ユニット ZmLの範囲力 適宜設定することができる。
[0083] このような ATP供給 ·再生系を応用可能な有用物質としては、 ATPをエネルギー源 および Z叉は基質として消費する酵素反応により生成される有用物質であればよぐ 具体的には、 PAPS、糖ヌクレオチド、 S—アデノシルメチォニン（SAM)などを例示 することができる。
[0084] (D) PAPSの酵素合成
PAPSの酵素合成反応は、 ATPと硫酸イオン力 ATPSの触媒作用により ATPの
5'—リン酸を硫酸ィ匕し (式 1)、生じるアデノシン一 5'—ホスホ硫酸の 3'—水酸基を、
ATPをリン酸供与体として APSKの触媒作用によりリン酸化する（式 2)ものである。
[0085] [化 6]
AT P S
A T P + S〇4 2 - > A P S + P P i (式 1 )
A P S K
A P S +AT P P A P S + AD P (式 2 )
[0086] 反応に添加する ATPは、市販のものが使用できる。使用濃度としては、例えば 1〜 200mM、好ましくは l〜20mMの範囲から適宜設定すればよい。また、反応に添カロ する硫酸基供与体としては、反応液中で硫酸イオンを生成するものであればよぐ巿 販の硫酸ナトリウムや硫酸マグネシウムなどの硫酸塩を使用することができる。使用 濃度としては、例えば l〜200mM、好ましくは 10〜： LOOmMの範囲力も適宜設定す ることがでさる。
[0087] PAPSの合成は、 pH4〜9の範囲の適当な緩衝液中に ATPおよび硫酸塩を添カロ し、さらに 0. 001ユニット以上、好ましくは 0. 001〜1. 0ユニットの ATPSおよび 0. 0 01ユニット以上、好ましくは 0. 001〜1. 0ユニットの APSKを添カ卩し、 20°C以上、好 ましくは 30〜50°Cで 1〜50時間程、必要により撹拌しながら反応させることにより実 施できる。
[0088] また、 ATPを使用せずに、前述の ATP供給 ·再生系を併用することも可能である。
[0089] すなわち、 AMP、ポリリン酸、 PNDKおよび PAPからなる ATPの供給 ·再生系を応 用した PAPSの合成は、 pH4〜9の範囲の適当な緩衝液中に、 AMP、硫酸基供与 体およびポリリン酸を添カ卩し、さらに 0. 001ユニット ZmL以上、好ましくは 0. 001〜 10ユニット/ mLの PAP、 0. 001ユニット/ mL以上、好ましくは 0. 001〜： L0ュ-ッ ト ZmL以上の PNDK、 0. 001ユニット以上、好ましくは 0. 001〜： L0ユニットの ATP Sおよび 0. 001ユニット以上、好ましくは 0. 001〜10ユニットの APSKを添カ卩し、 20 °C以上、好ましくは 30〜50°Cで 1〜： L00時間程、必要により撹拌しながら反応させる こと〖こより実施できる。
[0090] また、 AMP、ポリリン酸、 PNDKおよび ADKからなる ATPの供給 ·再生系を応用し た PAPSの合成は、 pH4〜9の範囲の適当な緩衝液中に、 AMP、硫酸基供与体お よびポリリン酸を添カロし、さらに 0. 001ユニット/ mL以上、好ましくは 0. 001〜10ュ ニット ZmLの ADK、 0. 001ユニット/ mL以上、好ましくは 0. 001〜： L0ユニット Z mL以上の PNDK、0. 001ユニット以上、好ましくは 0. 001〜10ユニットの ATPSお よび 0. 001ユニット以上、好ましくは 0. 001〜10ユニットの APSKを添カ卩し、 20°C 以上、好ましくは 30〜50°Cで 1〜： L00時間程、必要により撹拌しながら反応させるこ とにより実施できる。
[0091] なお、上記いずれの反応においても、 ATPS反応により生成するピロリン酸が生成 物阻害を起こす場合があるため、 0. 001ユニット ZmL以上、好ましくは 0. 001-10 ユニット ZmLの無機ピロホスファターゼ（Inorganic Pyrophosphatase)を添カロす ることで合成効率を向上させることができる。
[0092] 反応後、反応液中に生成した PAPSは、活性炭やイオン交換榭脂などを用いた通 常のクロマトグラフィー処理法により単離精製することができる。 実施例
[0093] 以下、実施例を示して本発明を詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例 によって限定されないことは明らかである。また、実施例における DNAの調製、制限 酵素による切断、 T4DNAリガーゼによる DNA連結、並びに大腸菌の形質転換法 は全て「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second EditionJ ( Maniatisら編、 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N ew York (1989) )に従って行った。また、反応液中のヌクレオチド類の定量は HPL C法に従って行った。具体的には、分離には YMC社製の ODS— AQ312カラムを 用い、溶出液として 0. 5Mリン酸一カリウム溶液を用いた。
[0094] 実施例 1
( 1) ATPS遺伝子および APSK遺伝子の同定
ジォバチルス 'ステア口サーモフィルス由来 ATPS遺伝子および APSK遺伝子は 未同定である力 該菌ストレイン 10株のゲノム DNAの一部の塩基配列は公開されて いる（Accession Number NC_002926)。そこで、ウェブサービス（http : // www. ncbi. nlm. nih. gov/ genomes/ geoiast. cgi？ gi= 5025&tax= 2725 67)を利用し、公開されている該株ゲノム DNAの部分配列中に、枯草菌由来の公知 の ATPS (Accession Number CAA04411)と類似したアミノ酸配列のオープン リーディングフレーム（以下、 ORFと略称する）をコードしうる DNA領域が存在するか 否かを、 tBLASTnプログラムを用いて検索した。
[0095] この結果、該株染色体には、枯草菌由来 ATPSとアミノ酸配列が類似した ORFをコ ードし得る DNA領域が存在することが判明した。さらに該遺伝子の下流には、枯草 菌由来 APSK (Accession Number CAA04412)とアミノ酸配列が類似した OR Fをコードし得る NA領域が見出された。これらは、それぞれ、該菌における ATPS遺 伝子および APSK遺伝子であると期待された。
[0096] そこで、該菌 ATPS遺伝子と期待される DNA断片を以下に示す PCR法で増幅し た。すなわち、下記 (A)および（B)のプライマーを用い、反応液 0. lmL中（50mM 塩化カリウム、 10mMトリス塩酸（pH8. 3)、 1. 5mM塩化マグネシウム、 0. 001%ゼ ラチン、ジォバチルス'ステア口サーモフィルス TH6— 2株（FERM BP— 2758)の 染色体 DNAO. l ^ g, 2種類のプライマー DNA各々 0. 2 M、 ExTaqDNAポリメ ラーゼ 2. 5ユニット)を Perkin— Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（94°C、 1分）、アニーリング（55°C、 1分）、ポリメライゼ一 シヨン（72°C、 2分）のステップを 30回繰り返した。なお、当該 TH6— 2株は、バチル ス.ステア口サーモフィルス TH6— 2の名称で 1989年 2月 4日に、〒 305— 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人 産業技術総合研 究所 特許生物寄託センターに FERM BP— 2758として寄託されている。なお、バ チルス 'ステア口サーモフィルスは、現在ジォバチルス'ステア口サーモフィルスに名 称変更されたため、念のため、同一株を、 2005年 12月 7日に、前記の特許生物寄 託センターにジォバチルス'ステア口サーモフィルス TH6— 2の名称で、 FERM B P— 10466として寄託した。
[0097] (A) 5， - TTG AATTCCTTGCCTC ATG AAC ATGGC AGC - 3，（配列番号 5)
(B) 5， -TACTGCAGGCTCATCGCGATCCTCCTTTAG - 3 ' (配列番号 6) [0098] また、該菌 APSキナーゼ遺伝子と期待される DNA断片を、 (C)および (D)の 2種 類のプライマー DNAを用いた上記と同様な PCR法で増幅した。
(C) 5， -TTGAATTCCGCTAAAGGAGGATCGCGATGA- 3 ' (配列番号 7)
(D) 5， -TTCTGCAGCGACCTTGTCAAATGACCTCCC - 3 ' (配列番号 8) [0099] 各遺伝子増幅後、反応液をフエノール Zクロ口ホルム（1： 1)混合液で処理し、水溶 性画分に 2倍容のエタノールを添カ卩して DNAを沈殿させた。沈殿回収した DNAを 文献 (Molecular Cionmg, A Laboratory Manual, Second Emtion、目 ij 述）の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、各 DNA断片を精製した。 該 DNA各々を制限酵素 EcoRIおよび Pstlで切断し、同じく制限酵素 EcoRIおよび Pstlで消化したプラスミド pTrc99A (Pharmacia Biotech社より入手）と T4DNAリ ガーゼを用いて連結した。各々の連結反応液を用いて大腸菌 JM109菌を形質転換 し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pTrc— ylnBおよび pTrc— yl nCを単離した。
[0100] プラスミド pTrc—ylnBはジォバチルス'ステア口サーモフィルス TH6— 2株由来 AT PS遺伝子を含む DNA断片を乗せたプラスミドであり、 pTrc-ylnCは同株由来 AP SK遺伝子を含む DNA断片を乗せたプラスミドである。クローンィ匕した両遺伝子の塩 基配列を解析した結果、該菌 ATPS遺伝子は配列番号 1、該菌 APSK遺伝子は配 列番号 2に表した DN A塩基配列であった。これらの DNA塩基配列をアミノ酸配列に 翻訳した結果、該菌 ATPSは配列番号 3、該菌 APSKは配列番号 4に表したアミノ酸 配列であった。該菌 ATPSは枯草菌由来同酵素と 68%のアミノ酸配列相同性を、ま た、該菌 APSKは枯草菌由来同酵素と 63%のアミノ酸配列相同性をそれぞれ示し た。
[0101] (2) ATPSおよび APSK粗酵素液の調製 大腸菌 JM109株を pTrc99Aベクター、 pTrc— ylnBおよび pTrc— ylnCの各々で 形質転換し、得られた形質転換体を、 100 gZmLのアンピシリンを含有する 2xYT 培地 lOOmLに植菌し、 30°Cで振とう培養した。 4xl08菌 ZmLに達した時点で、培 養液に終濃度 0. 4mMになるように IPTGを添カ卩し、さらに 30°Cでー晚振とう培養を 続けた。培養終了後、遠心分離（10, OOOxg, 10分）により菌体を回収し、 10mLの 緩衝液（50mMトリス塩酸（pH8. 0)、0. 5mM EDTA、 lmM2—メルカプトエタノ ール）に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（10, OOOx g、 10分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を粗酵素液とした。
[0102] 各粗酵素液中の ATPS活性を以下のように測定した。すなわち、最終濃度がそれ ぞれ、トリス塩酸緩衝液（pH8) 50mM、硫酸マグネシウム 20mM、 ATPlmMとなる 反応混液に、 lunit/mLのピロホスファターゼ（Roche Diagnostics社）、 lunit/ mLの APSK(Calbiochem社）、および酵素液を添カ卩し、 37°Cで 10分間保温後、氷 冷した 0. 5Mリン酸 2水素ナトリウム溶液を加えることによって反応を停止した。生成 した PAPSの量を HPLCによって定量し、 1分間に 1 moleの PAPSが生成する AT PSの量を 1ユニットとした。
[0103] また、 APSK活性を以下のように測定した。すなわち、最終濃度がそれぞれ、トリス 塩酸緩衝液（pH8) 50mM、硫酸マグネシウム 20mM、 ATPlmMとなる反応混液に 、 lunitZmLのピロホスファターゼ（Roche Diagnostics社）、 lunitZmLの ATP S (Calbiochem社）、および酵素液を添カ卩し、 37°Cで 10分間保温後、氷冷した 0. 5 Mリン酸 2水素ナトリウム溶液をカ卩えることによって反応を停止した。生成した PAPS の量を HPLCによって定量し、 1分間に 1 moleの PAPSが生成する APSKの量を 1Uユニットとした。それぞれの測定結果を表 1および 2に示す。
[0104] [表 1]
Figure imgf000021_0001
[0105] [表 2] ス トレイン A P S K活性 （ュニッ ト ZmL) A P S K比活性 （ュニッ ト /mg)
JM109/pTrc99A く 0. 1 <0. 01
JM109/pTrc-ylnC 2. 5 0. 19
[0106] (3)ATPS粗酵素液および APSK粗酵素液を用いた PAPSの合成
最終濃度がそれぞれ、 Hepes緩衝液 (pH8) 50mM、塩化マグネシウム 25mM、 硫酸ナトリウム 100mM、 ATP50mMとなる反応混液に、 5ユニット ZmLピロホスファ ターゼ（ロッシュ社製）、 0. 2%容量の ATPS粗酵素液、 0. 5%容量の APSK粗酵素 液を添カ卩し、 37°Cで保温した。
[0107] また、両粗酵素液の代わりに同加熱処理粗酵素液 (各粗酵素液を 55°Cに調温され た水槽に 30分間浸した後、室温にて 30分間静置し、遠心分離によって得られた上 清)を上記と同じ容量添加した反応混液を調製し、同様に保温した。さら〖こ、コント口 ールとして両粗酵素液の代わりに pTrc99Aを保持する大腸菌 JM109株より調製し た粗酵素液を上記と同じ容量添加した反応混液を調製し、同様に保温した。
[0108] これらの反応における PAPSの生成量の経時的変化を図 1に示した。この結果、コ ントロールを除くいずれの反応においても、 PAPSの経時的生成が確認された力 A TPSおよび APSK加熱処理粗酵素液を用いた反応では、非加熱処理の同粗酵素 液を用いた場合と比較して顕著に PAPS合成効率が高ぐ各時点で 2〜3倍の PAP S生成量を示した。反応開始 10時間後の対 1Z2ATP転換率は、両加熱処理粗酵 素液を用いた反応の場合は 75%であるのに対し、非加熱処理の同粗酵素液を用い た場合は 38%にすぎな 、ものであった。
[0109] 実施例 2
(1) N末端領域のアミノ酸残基が欠失した PNDKをコードする遺伝子のクローユング 緑膿菌 Pseudomonas aeruginosa PAOl株（ATCC BAA— 47)の染色体 DNAを斉藤と三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta. , 72, 619 (1963) )で調 製した。次に、表 3に示す 12種類のプライマー DNAを常法に従って合成し、表 4に 示した 1から 11の組み合わせで 2種類のプライマー DNAを用い、上記染色体 DNA をテンペレートとした PCR法により、 Ν末端領域のアミノ酸残基が様々な程度で欠失 した PNDKをコードする遺伝子を増幅した。なお、 Pseudomonas aeruginosa P AOl株は、 ATCCから入手可能である。
[0110] [表 3] 名 称 配 列
PPK2F1 5' -TTCCATGGGAGAGGTGTAAGGCTTTCCT-3' (配列番号 11)
PPK2F2 5' -AACCATGGGCGAAGAACCCACTGTCAGT-3' (配列番号 12)
PPK2F4 5' -AACCATGGCGGTGGCCCTGCAGGTCGCC-3' (配列番号 13)
PPK2F5 5' - AACCATGGGCAGCGAGGACAGCACCTCG-3' (配列番号 14)
PPK2F6 5' -AACCATGGACTATCCCTATCACACGCGG-3' (配列番号 15)
PPK2F7 5' -AACCATGGCGCGGATGCGCCGCAACGAG-3' (配列番号 16)
PPK2F8 5， -AACCATGGACGAGTACGAGAAGGCCAAG-3' (配列番号 17)
PPK2F9 5' -TTCCATGGAGGTGCAGAGCTGGGTGAAG-3' (配列番号 18)
PPK2F10 5' -TTCCATGGACAGCACCTCGGCGAGCCT-3 ' (配列番号 19 )
PPK2F11 5' -TTCCATGGCGAGCCTGCCGGCGAACTAT-3' (配列番号 20)
PPK2F13 5' -TTCCATGGTGCCGGCGAACTATCCCTATC-3' (配列番号 21)
PPK2R1 5' -TTGGATCCTGCCGTACAAGCAGATCGTG-3' (配列番号 22)
[0111] [表 4] 組み合わせ番号 DNAプライマー プラスミ ド
1 PPK2F1および PPK2R1 pTrc-ppk2
2 PPK2F2および PPK2R1 pTrc-ppk2N3
3 PPK2F4および PPK2R1 pTrc-ppk2N60
4 PPK2F5および PPK2R1 pTrc-ppk2N72
5 PPK2F10および PPK2R1 pTrc-ppk2N74
6 PPK2F11および PPK2R1 pTrc-ppk2N78
7 PPK2F13および PPK2R1 pTrc-ppk2N81
8 PPK2F6および PPK2R1 pTrc-ppk2N84
9 PPK2F7および PPK2R1 pTrc-ppk2N89
1 0 PPK2F8および PPK2R1 pTrc-ppk2N94
1 1 PPK2F9および PPK2R1 pTrc-ppk2N109
PCRによる N末端領域欠失 PNDKをコードする遺伝子の増幅は、反応液 lOOmL 中（50mM塩化カリウム、 lOmMトリス塩酸（pH8. 3)、 1. 5mM塩化マグネシウム、 0 . 001%ゼラチン、テンペレート DNAO. l ^ g,表 4に示した組み合わせ 1から 11の 2 種類のプライマー DNA各々 0. 2 M、 ExTaqDNAポリメラーゼ 2. 5ユニット）を P erkin— Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱 変性（94°C、 1分）、アニーリング（55°C、 1. 5分）、ポリメライゼーシヨン（72°C、 1. 5 分）のステップを 30回繰り返すことにより行った。
[0113] 各遺伝子増幅後、反応液をフエノール Zクロ口ホルム（1： 1)混合液で処理し、水溶 性画分に 2倍容のエタノールを添カ卩して DNAを沈殿させた。沈殿回収した DNAを 文献 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second Edition^ m^ ) の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、 0. 9〜1. 3kb相当の各 DN A断片を精製した。該 DNA各々を制限酵素 Ncolおよび BamHIで切断し、同じく制 限酵素 Ncolおよび BamHIで消化したプラスミド pTrc99A (Pharmacia Biotech 社より入手）と T4DNAリガーゼを用いて連結した。
[0114] 各々の連結反応液を用いて大腸菌 JM109菌を形質転換し、得られたアンピシリン 耐性形質転換体より各プラスミド（pTrc— ppk2、 pTrc— ppk2N3、 pTrc— ppk2N6 0、 pTrc— ppk2N72、 pTrc— ppk2N74、 pTrc— ppk2N78、 pTrc— ppk2N80、 pTrc— ppk2N81、 pTrc— ppk2N84、 pTrc— ppk2N89、 pTrc— ppk2N94、お よび pTrc— ppk2N109)を単離した。
[0115] プラスミド pTrc— ppk2は完全長の PNDKをコードする遺伝子を、 pTrc— ppk2N3 は N末端側 2アミノ酸残基を欠く PNDK (以下、 PNDKN3と称する）をコードする遺 伝子を、 pTrc—ppk2N60は N末端側 59アミノ酸残基を欠く PNDK (以下、 PNDK N60と称する）をコードする遺伝子を、 pTrc— ppk2N72は N末端側 71アミノ酸残基 を欠く PNDK (以下、 PNDKN72と称する）をコードする遺伝子を、 pTrc— ppk2N7 4は N末端側 73アミノ酸残基を欠く PNDK (以下、 PNDKN74と称する）をコードす る遺伝子を、 pTrc— ppk2N78は N末端側 77アミノ酸残基を欠く PNDK (以下、 PN DKN78と称する）をコードする遺伝子を、 pTrc— ppk2N81は N末端側 80アミノ酸 残基を欠く PNDK (以下、 PNDKN81と称する）をコードする遺伝子を、 pTrc— ppk 2N84は N末端側 83アミノ酸残基を欠く PNDK (以下、 PNDKN84と称する）をコー ドする遺伝子を、 pTrc— ppk2N89は N末端側 88アミノ酸残基を欠く PNDK (以下、 PNDKN89と称する）をコードする遺伝子を、 pTrc— ppk2N94は N末端側 93ァミノ 酸残基を欠く PNDK (以下、 PNDKN94と称する）をコードする遺伝子を、 pTrc— p pk2N104は N末端側 103アミノ酸残基を欠く PNDK (以下、 PNDKN104と称する) をコードする遺伝子を、それぞれ含有する Ncol— BamHI DNA断片力 pTrc99A の trcプロモーター下流の NcoI— BamHI切断部位に挿入されたものである。
[0116] (2)各種 N末端領域欠失 PNDK粗酵素液の調製
上記の各プラスミドを保持する大腸菌 JM109菌を、 100 g/mLのアンピシリンを 含有する 2xYT培地 300mLに植菌し、 37°Cで振とう培養した。 4 X 108菌/ mLに達 した時点で、培養液に終濃度 ImMになるように IPTGを添加し、さらに 37°Cで 5時間 振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（10, OOOxg, 10分）により菌体を回収 し、 30mLの緩衝液（50mMトリス塩酸（pH7. 5)、 0. 5mM EDTA、 lmM2—メル カプトエタノール）に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離 (10, OOOxg, 10分）により菌体残さを除去した。このように得られた上清画分を粗酵 素液とした。
[0117] (3)各種 N末端領域欠失 PNDK粗酵素液の活性測定
上記の粗酵素液中の PNDK活性の単位 (ユニット）を、以下に示す方法で測定、算 出した。すなわち、 10mM塩化マグネシウム、 80mM硫酸アンモ-ゥム、 10mM A DP、およびポリリン酸 (無機リン酸として 30mM)を含有する 50mMトリス塩酸緩衝液 (pH8. 0)に上記の粗酵素液各々を添カ卩して、 37°Cで保温することで反応を行い、 1 00°C、 1分間の熱処理により反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー (HPLC )を用いて反応液中の ATPを定量し、 37°Cで 1分間に 1 μ moleの ATPを生成する 活性を 1単位 (ユニット）とした。上記の各種 N末端領域欠失 PNDK粗酵素液中の P NDK活性を表 5に示す。
[0118] [表 5]
粗酵素液 PNDK活性 (ュニット /mL粗酵素液）
PNDK (対照） 7. 1
PNDK 3 7. 3
PNDKN60 5. 2
PNDKN 72 8. 6
PNDK 74 6 0. 5
PNDKN 78 8 4. 3
PNDKN8 1 2 9. 2
PNDK 84 1 9 1
PNDKN 89 4. 9
PNDKN 94 3. 8
PNDKN 109 1. 2
[0119] 各 PNDKの比活性は特に大きく変動しているわけではないことから、上記表 5から 明らかなように、 73以上、 83以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した DNA 断片を用いることで、 PNDKを大量に調製できることが明らかとなった。
[0120] 実施例 3
(1) PNDKの調製
緑膿菌 Pseudomonas aeruginosa由来 PNDKの調製は、実施例 2に記載した とおりである。
[0121] (2)PPKの調製
大腸菌 ΡΡΚを文献 (J. Biosci. Bioeng. , 91, 557— 563(2001))に記載の方法 で調製した。
ΡΡΚの活性の単位 (ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、 10mM塩 ィ匕マグネシウム、 80mM硫酸アンモ-ゥム、 10mM ADP、およびポリリン酸（無機リ ン酸として 30mM)を含有する 50mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.0)に酵素試料液を添 加し、 37°Cで 10分間保温後、沸騰湯浴中で 1分間処理することにより反応を停止さ せた。高速液体クロマトグラフィー (HPLC)を用いて反応液中の ATPを定量し、 1分 間に 1 μ moleの ATPを生成させる活性を 1単位 (ユニット）とした。
[0122] (3)PAPの調製
Acinetobacter johnsonii由来 PAPを文献（WO03Z100056)に記載の方法 で調製した。 PAPの活性の単位 (ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、 10mM塩 ィ匕マグネシウム、 80mM硫酸アンモ-ゥム、 10mM AMP、およびポリリン酸（無機リ ン酸として 30mM)を含有する 50mMトリス塩酸緩衝液 (pH8. 0)に酵素試料液を添 加し、 37°Cで 10分間保温後、沸騰湯浴中で 1分間処理することにより反応を停止さ せた。高速液体クロマトグラフィー (HPLC)を用いて反応液中の ATPを定量し、 1分 間に 1 μ moleの ADPを生成させる活性を 1単位 (ユニット）とした。
[0123] (4)ADKの調製
大腸菌 ADKを文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14168— 14171 (200 0) )に記載の方法で調製した。
ADKの活性の単位 (ユニット）は以下に示す方法で算出した。すなわち、 10mM塩 ィ匕マグネシウム、 10mM AMP、および 10mM ATPを含有する 50mMトリス塩酸 緩衝液 (PH8. 0)に酵素試料液を添加し、 37°Cで 10分間保温後、沸騰湯浴中で 1 分間処理することにより反応を停止させた。高速液体クロマトグラフィー (HPLC)を用 いて反応液中の ATPを定量し、 1分間に 2 μ moleの ADPを生成させる活性を 1単位 (ユニット）とした。
[0124] (5)無機ピロホスファターゼの調製
無機ピロホスファターゼはロシュ'ダイァグノスティックス（Roche Diagnostics)社 のものを使用した。
無機ピロホスファターゼの活性の単位 (ユニット）は以下に示す方法で算出した。す なわち、 10mM塩化マグネシウムおよび 10mM無機ピロリン酸を含有する 50mMトリ ス塩酸緩衝液 (PH8. 0)に酵素試料液を添加し、 37°Cで 10分間保温後、沸騰湯浴 中で 1分間処理することにより反応を停止させた。生成した無機リン酸の量をモリブデ ンブノレ一法（"Treatise on Analytical Chemistry"l. M. Kolthoff & P. J . Elving編、第 5卷、 317〜402頁、 Interscience, New York (1961) )によって 定量し、 1分間に 2 molの無機リン酸を生成させる無機ピロホスファタ一ゼの量を 1 単位 (ユニット)とした。
[0125] (6)ATPSおよび APSKの調製
Geobacillus stearothermophilus由来 ATPSおよび APSKの調製は、実施例 1 に記載したとおりである。
[0126] (7)ADKおよび PNDKを利用した本発明の ATP供給 ·再生系を共役させた PAPS 合成
25mM 塩化マグネシウム、 20mM AMP、 lOOmM 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（ リン酸として lOOmM)を含有する 50mM Hepes—KOH緩衝液（pH8. 0)に ADK (0. 1ユニット ZmL)ゝ PNDK(0. 1ユニット ZmL)ゝ ATPS (0. 25ユニット ZmL)、 APSK(0. 25ユニット ZmL)および無機ピロホスファターゼ（1. 0ユニット ZmL)を 添加し、 37°Cで保温した。反応液組成の経時的変化を図 2に示す。該反応において は、生成した ATPの濃度は ADPや AMPのそれに対して高く推移し、 48時間後の P APSの生成量は 12. OmM (対 AMP転換率 60%)であった。
[0127] (8) PAPおよび PNDKを利用した本発明の ATP供給 ·再生系を共役させた PAPS 合成
25mM 塩化マグネシウム、 20mM AMP、 lOOmM 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（ リン酸として lOOmM)を含有する 50mM Hepes—KOH緩衝液（pH8. 0)に PAP ( 0. 1ユニット ZmL)ゝ PNDK(0. 1ユニット ZmL)ゝ ATPS (0. 25ユニット ZmL)ゝ A PSK(0. 25ユニット ZmL)および無機ピロホスファターゼ（1. 0ユニット ZmL)を添 加し、 37°Cで保温した。反応液組成の経時的変化を図 3に示す。該反応においても 、生成した ATPの濃度は ADPや AMPのそれに対して高く推移し、 48時間後の PA PSの生成量は 12. 3mM (対 AMP転換率 62%)であった。
[0128] (9) PAPおよび PNDKを利用した本発明の ATP供給 ·再生系を共役させた PAPS 合成 (大量製造）
容量 2Lの恒温反応層に、 25mM 塩化マグネシウム、 40mM AMP、 lOOmM 硫酸ナトリウム、ポリリン酸 (リン酸として lOOmM)を含有する 1Lの水溶液を調製し、 水酸化ナトリウムにて pHを 8. 0に調整後、 37°Cに調温した。これに PAPを 500ュニ ット、 PNDKを 500ユニット、 ATPSを 250ユニット、 APSKを 250ユニット、および無 機ピロホスファターゼを 10, 000ユニット添加し、反応を開始した。反応開始 6時間後 にさらにポリリン酸 (リン酸として lOOmM)を添加した。なお、反応中は水酸化ナトリウ ムを用いて反応液の pHを 8. 0に維持した。この結果、反応開始 30時間後の PAPS 生成量は 29. 3mM (対 AMP転換率 73%)に達した。
[0129] 比較例 1 : PPKおよび ADKの協調作用を利用した従来の ATP供給 ·再生系を共役 させた PAPS合成
25mM 塩化マグネシウム、 20mM AMP、 lOOmM 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（ リン酸として lOOmM)を含有する 50mM Hepes— KOH緩衝液（pH8. 0)に PPK( 0. 1ユニット ZmL)、 ADK(0. 1ユニット ZmL)、 ATPS (0. 25ユニット ZmL)、 AP SK(0. 25ユニット ZmL)および無機ピロホスファターゼ（1. 0ユニット ZmL)を添カロ し、 37°Cで保温した。反応液組成の経時的変化を図 4に示す。該反応においては、 生成した ATPの濃度は ADPや AMPのそれに対して低く推移し、 48時間後の PAP Sの生成量は 2. 3mM (対 AMP転換率 12%)に過ぎなかった。
[0130] 比較例 2： PAPおよび ADKを利用した従来の ATP供給 ·再生系を共役させた PAP S合成
25mM 塩化マグネシウム、 20mM AMP、 lOOmM 硫酸ナトリウム、ポリリン酸（ リン酸として lOOmM)を含有する 50mM Hepes— KOH緩衝液（pH8. 0)に PAP ( 0. 1ユニット ZmL)、 ADK(0. 1ユニット ZmL)、 ATPS (0. 25ユニット ZmL)、 AP SK(0. 25ユニット ZmL)および無機ピロホスファターゼ（1. 0ユニット ZmL)を添カロ し、 37°Cで保温した。反応液組成の経時的変化を図 5に示す。該反応においても、 生成した ATPの濃度は ADPや AMPのそれに対して低く推移し、 48時間後の PAP Sの生成量は 8. 2mM (対 AMP転換率 41%)に留まった。

Claims

請求の範囲
[I] 配列番号 1で示される塩基配列からなり、ジォバチルス 'ステア口サーモフィルス由 来のアデノシン 5，—トリリン酸スルフリラーゼ（ATPS)をコードする DNA断片。
[2] 配列番号 1で示される塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基が欠失、置換、 挿入または付加された塩基配列力もなり、 ATPS活性を有する酵素をコードする DN A断片。
[3] 請求項 1に記載の DNA断片とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 ATPS 活性を有する酵素をコードする DNA断片。
[4] 請求項 1〜3記載の!/、ずれかの DNA断片を用い、組換え DNA手法にて ATPS活 性を有する粗酵素を調製し、得られた粗酵素を加熱処理することを特徴とする、 ATP
Sまたは ATPS活性を有する酵素の調製法。
[5] 45〜65°Cで加熱処理する、請求項 4の調製法。
[6] 配列番号 2で示される塩基配列からなり、ジォバチルス 'ステア口サーモフィルス由 来のアデノシン 5'—ホスホ硫酸キナーゼ (APSK)をコードする DNA断片。
[7] 配列番号 2で示される塩基配列からなり、 1個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿 入または付加された塩基配列力もなり、 APSK活性を有する酵素をコードする DNA 断片。
[8] 請求項 6に記載の DNA断片とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 APSK 活性を有する酵素をコードする DNA断片。
[9] 請求項 6〜8記載の!/、ずれかの DNA断片を用い、組換え DNA手法にて APSK活 性を有する粗酵素を調製し、得られた粗酵素を加熱処理することを特徴とする、 APS
Kまたは APSK活性を有する酵素の調製法。
[10] 45〜65°Cで加熱処理する、請求項 9の調製法。
[I I] 請求項 4記載の方法により調製された ATPSと請求項 9記載の方法で調製された A PSKを用い、硫酸イオンとアデノシン 5，一トリリン酸 (ATP)力 3，一ホスホアデノシ ン一 5'—ホスホ硫酸 (PAPS)を酵素的に合成することを特徴とする、 PAPSの製造 法。
[12] 配列番号 9で示される塩基配列中の 101〜 1171からなるポリリン酸依存的ヌクレオ シド 5，一二リン酸キナーゼ（PNDK)をコードするポリヌクレオチドにおいて、 N末端 側の少なくとも 72アミノ酸残基相当の塩基配列を欠失した DNA断片。
[13] 少なくとも 73アミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、請求項 12記載の DNA断 片。
[14] 72以上、 87以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、請求項 12記載の DNA断片。
[15] 73以上、 83以下のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、請求項 12記載の DNA断片。
[16] 73、 77、 80または 83のアミノ酸残基相当分の塩基配列を欠失した、請求項 12記 載の DNA断片。
[17] 請求項 12〜16いずれかの塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基が置換、揷 入または付加された塩基配列カゝらなり、 PNDK活性を有する酵素をコードする DNA 断片。
[18] 請求項 12〜16いずれかに記載の DNA断片とストリンジェントな条件下でノヽイブリ ダイズし、 PNDK活性を有する酵素をコードする DNA断片。
[19] 請求項 12〜18記載のいずれかの DNA断片を用い、組換え DNA手法にて PND
Kを調製する、 PNDKの製造法。
[20] 請求項 19記載の方法により調製された、配列番号 10の N末端側の少なくとも 72ァ ミノ酸を欠落したアミノ酸配列を有する PNDK。
[21] アデノシン 5，—モノリン酸 (AMP)、ポリリン酸、ポリリン酸依存的ヌクレオシド 5， - ジリン酸キナーゼ（PNDK)およびポリリン酸: AMPリン酸転移酵素（PAP)からなる アデノシン 5'—トリリン酸 (ATP)の供給'再生系。
[22] アデノシン 5，—モノリン酸 (AMP)、ポリリン酸、ポリリン酸依存的ヌクレオシド 5， - ジリン酸キナーゼ（PNDK)およびアデ-ル酸キナーゼ (ADK)力 なるアデノシン 5
'—トリリン酸 (ATP)の供給 ·再生系。
[23] PNDKが、シユードモナス（Pseudomonas)属に属する微生物由来のものである、 請求項 21または 22記載の ATPの供給 ·再生系。
[24] PNDKが、請求項 20記載の PNDKである、請求項 21または 22記載の ATPの供 給 ·再生系。
[25] PAP力 ァシネトパクター（Acinetobacter)属に属する微生物由来のものである、 請求項 21または 22記載の ATPの供給 ·再生系。
[26] ADKが大腸菌または酵母由来のものである、請求項 21または 22記載の ATPの供 給 ·再生系。
[27] 組換え DNA手法で形質転換した形質転換体、該形質転換体の処理物または該処 理物から得られる酵素を酵素源として使用する、請求項 21または 22記載の ATPの 供給 ·再生系。
[28] ATPをエネルギー源および Z叉は基質として消費する酵素反応により生成される 有用物質を安価かつ効率的に製造する方法であって、 ATPの代わりに、請求項 21 〜26のいずれか一項に記載の ATPの供給'再生系を利用することを特徴とする有 用物質の製造法。
[29] ATPをエネルギー源および Z叉は基質として消費する酵素反応により生成される 有用物質が、 3，一ホスホアデノシン 5，一ホスホ硫酸（PAPS)、糖ヌクレオチド、 S アデノシルメチォニン（SAM)の 、ずれかである、請求項 28記載の有用物質の製 造法。
[30] アデノシン 5，一トリリン酸スルフリラーゼ (ATPS)とアデノシン 5，一ホスホ硫酸キナ ーゼ（APSK)とを用い、 ATPを硫酸化およびリン酸化して 3，一ホスホアデノシンー5 ，一ホスホ硫酸（PAPS)を製造する方法において、 ATPの代わりに、請求項 21〜27 のいずれか一項に記載の ATPの供給 ·再生系を利用することを特徴とする PAPSの 製造法。
[31] ATPSと APSKと力 ジォバシラス（Geobacillus)属に属する微生物由来のもので ある、請求項 30記載の PAPSの製造法。
[32] 請求項 4記載の方法により調製された ATPSと請求項 9記載の方法で調製された A
PSKを用いる、請求項 30記載の PAPSの製造法。
[33] 30〜50°Cの反応温度下、 PAPSを酵素合成する、請求項 30記載の PAPSの製造 法。
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