CN114423870A - 核糖核酸的无细胞产生 - Google Patents

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德鲁·S·坎宁安
詹姆斯·R·阿布希尔
拉基特·贾殷
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Abstract

本发明涉及核酸、特别是RNA并且具体来说信使RNA(mRNA)的体外产生。

Description

核糖核酸的无细胞产生
相关申请
本申请要求2019年3月29日提交的美国临时专利申请号62/826,983的优先权，所述临时专利申请特此整体并入。
本发明涉及2018年10月11日提交的题为“Methods and Compositions forNucleoside Triphosphate and Ribonucleic Acid Production”的国际申请号PCT/US2018/05535中公开的方法，所述申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及核酸、特别是RNA并且具体来说信使RNA(mRNA)且更具体来说真核mRNA的体外产生。本文公开的试剂和方法能够以低成本、高效率和商业上有用的规模在体外产生mRNA。
背景技术
核糖核酸(RNA)在生命中无处不在，充当细胞中信息的关键信使，携带来自DNA的指令以调控和合成蛋白质。RNA在生物技术中受关注，因为合成调节细胞中的mRNA水平在诸如农业作物保护、抗癌治疗剂、基因疗法、疫苗、免疫系统调节、疾病检测和动物健康的领域中具有应用。功能性单链(例如mRNA)和双链RNA分子已经在活细胞中和体外使用纯化的重组酶和纯化的三磷酸核苷酸产生(参见例如，欧洲专利号1631675，美国专利申请公布号2014/0271559A1和PCT/US2018/05535，所述专利各自以引用的方式并入本文)。尽管如此，以实现广泛商业应用的规模产生RNA且具体地mRNA目前成本太高。需要更便宜、更快且易于执行的方法，优选不需要作为对过程提供更严格控制以有利于产品安全和质量的手段的特殊试剂的外部供应商；并且需要产生与现有技术方法相当的数量和等级的RNA、特别是mRNA的方法。
发明内容
本文提供了用于以商业上有用的数量和成本产生体外RNA，特别是mRNA的试剂和方法。
如下文所述，在一方面，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；以及任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶和v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生mRNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码具有polyA尾的mRNA的DNA模板和viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中，任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶。
在第二方面，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体，和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶和v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码mRNA的DNA模板和viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生mRNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物，或(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生mRNA。
在第三方面，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶和v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码具有poly A尾的mRNA的DNA模板，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及(d)交换来自步骤(c)的所述反应混合物的缓冲液条件并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
在第四方面，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶和v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽、未加尾RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶和vii)至少一种编码mRNA的DNA模板，并且进一步其中，任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生未加帽RNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物；或(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生未加帽RNA；以及e)交换来自步骤(c)的所述反应混合物的缓冲液条件并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
在第五方面，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶和v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生mRNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码具有polyA尾的mRNA的DNA模板和viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶。
在第六方面，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体，和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶和v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码mRNA的DNA模板和viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生mRNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合或(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生mRNA。
在第七方面，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶和v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶和vii)至少一种编码具有poly A尾的mRNA的DNA模板；并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及(d)交换来自步骤(c)的所述反应混合物的缓冲液条件并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
在第八方面，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶和v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽、未加尾RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶和vii)至少一种编码mRNA的DNA模板，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；(d)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生未加帽RNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物；或(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生未加帽RNA；以及(e)交换来自步骤(c)的所述反应混合物的缓冲液条件并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
本发明的这些和其他特征和优点将通过以下详细描述结合所附权利要求书而得到更充分地理解。应注意，权利要求书的范围由其中的表述限定，而非由本发明描述中列出的特征和优点的特定讨论限定。
附图说明
图1.用于产生mRNA的方法的示意图。1A)DNA模板中编码的PolyA尾和通过加帽试剂进行加帽；B)酶促添加PolyA尾和通过加帽试剂加帽；C)在DNA模板中编码的PolyA尾和通过加帽酶部和加帽；以及D)酶促添加PolyA尾和通过加帽酶加帽。
图2.用于产生RNA的生物合成途径。示出使用细胞RNA作为起始材料用于产生NTP和下游RNA的生物合成途径。在此途径中，核糖核酸酶用于将细胞RNA降解为NMP或NDP(图2b)。
图3.RNA产物1。示出在反应中产生的RNA产物的琼脂糖凝胶，所述反应包含RNA聚合酶和通过解聚产生的NMP(-NMP)或纯化的NMP(+NMP，各自4mM)。缩写：–2log：2-log DNA梯状条带(New England Biolabs)，NMP：5’-NMP的等摩尔混合物，RNA Pol：热稳定的T7 RNA聚合酶，模板1：线性DNA模板，模板2：质粒DNA模板。
图4.RNA产物2。示出在反应中产生的RNA产物的琼脂糖凝胶，所述反应包含RNA聚合酶和通过纯化的RNA的解聚产生的NMP。作为阴性对照，在不存在RNA聚合酶的情况下进行反应。缩写：–2log：2-log DNA梯状条带(New England Biolabs)，NMP：5’-核苷一磷酸的等摩尔混合物，RNA Pol：热稳定的T7 RNA聚合酶，模板1：线性DNA模板，模板2：质粒DNA模板。
图5.RNA产物3。示出在37℃下使用野生型聚合酶(W)或热稳定的聚合酶突变体(T)通过无细胞RNA(CFR)合成产生的RNA产物的琼脂糖凝胶。缩写：–2log：2-log DNA梯状条带(New England Biolabs)，W：野生型T7 RNA聚合酶(New England Biolabs),T：热稳定的T7RNA聚合酶，模板1：线性DNA模板，模板2：质粒DNA模板。
图6.随时间推移产生的核苷酸。使用纯化的RNA酶R或核酸酶P1在各种来源的RNA的解聚期间随时间推移产生的酸溶性核苷酸(mM)的图。通过UV吸光度测量酸溶性核苷酸。
图7.通过核酸酶P1产生的可用NMP。示出在使用核酸酶P1解聚来自大肠杆菌或酵母的RNA期间随时间推移产生的可用5’-NMP百分比的图。可用5’-NMP的百分比通过液相色谱-质谱法(LC-MS)测定。
图8.不同裂解物温度的分析。来自大肠杆菌的裂解物在不同温度下进行RNA解聚的核组学特征图。示出20种分析物的累积浓度。核苷以白色斑点图案显示，并且产生最少。还收集了针对50℃的数据，但未示出。
图9.NTP的无细胞合成的分析。呈现示出在48℃下孵育1小时后，无论核苷酸来源，NTP的无细胞合成都产生类似NTP滴度的图。对于每种核苷酸来源(细胞RNA、纯化的NMP或纯化的NDP)，将足以提供大约4mM的每种核苷酸的量的底物添加至反应中。例如，与NDP的反应包含各自4mM的ADP、CDP、GDP和UDP。
图10.绿色荧光蛋白(GFP)在CFR mRNA转染的HeLa细胞中的表达。通过体外转录产生的mRNA作为对照呈现。示出荧光显微镜图像。
图11.由具有不同非翻译区(UTR)的mRNA产生的GFP表达的量化。示出相对荧光单位(RFU)。UTR源基因：HSD，5’羟基甾醇脱氢酶，3’白蛋白；COX，5’细胞色素氧化酶，3’白蛋白；HBG，5’,3’人β-珠蛋白；XBG，5’,3’非洲爪蟾β-珠蛋白。
图12.mRNA的毛细管凝胶电泳分析。示出通过体外转录(IVT)和CFR产生的mRNA的毛细管凝胶电泳结果，以及每个样品中代表目标mRNA种类的总核酸的百分比。
图13.CFR或IVT产生的RNA中的mRNA。示出免疫印迹。Ref，可商购的参考mRNA。
图14.mRNA制剂的内毒素分析。示出每mL的内毒素单位(EU)。
图15.反相离子对高效液相色谱后mRNA的产率和组成。示出样品的核酸、蛋白质、盐、未反应的NMP和其他干燥固体的质量百分比的色谱图和分析，以及代表目标mRNA种类的核酸的百分比(上图)和总体纯度(样品中的核酸％×作为目标种类的核酸％，下图)。
图16.酶联免疫吸附测定(ELISA)定量的使用CFR mRNA在HeLa提取物中血凝素(HA)的产生。浓度以ng/mL表示。HBG(5’,3’人β-珠蛋白)和XBG(5’,3’非洲爪蟾β-珠蛋白)代表不同的UTR。示出粗样品和HPLC纯化的样品两者。
图17.使用CFR mRNA，HeLa提取物中HA产生的蛋白质印迹。示出与通过体外转录产生的mRNA的产生的比较。箭头突出显示HA蛋白的预期大小(63kDa)。
图18.使用CFR mRNA，HeLa提取物中的萤火虫荧光素酶表达的发光定量。HBG(5’,3’人β-珠蛋白)和XBG(5’,3’非洲爪蟾β-珠蛋白)代表不同的UTR。-mRNA，无RNA(阴性对照)。
图19.使用CFR mRNA，HeLa细胞中的萤火虫荧光素酶表达的发光定量。如所示，HBG(1)和HBG(2)代表高和低水平的lipofectamine。示出多个时间点。
图20.使用CFR mRNA，小鼠中的荧光素酶表达的体内成像系统(IVIS)图像。LNP，脂质纳米颗粒。GenVoy，商业配方。箭头突出显示指示荧光素酶表达的发光区域。
图21.使用CFR mRNA，体内荧光素酶表达的发光定量。针对来自IVT mRNA的结果示出施用后0至72小时的测量值(参见标记)。
图22.具有ARCA加帽的核苷修饰的mRNA。(A)CFR产生的mRNA对IVT产生的mRNA的纯度；(B)核苷修饰和加帽的定量(GLB–GreenLight Bio；IVT–体外转录)。
图23.小鼠中的靶基因表达。注射D-荧光素后5、24、48和72小时的靶基因表达。通过将mRNA专有脂质纳米颗粒制剂以0.2μg剂量(左)和1μg剂量配制到BALB/c小鼠(n＝10/组，IM)中来实现基因表达。
图24.小鼠中的血清免疫。来自用30μg和3μg剂量的血凝素mRNA处理的小鼠对比用灭活的H1N1处理的阳性对照小鼠的滴度。圆圈指示选择用于后续激发研究的小鼠。
图25.体重变化施用了HA mRNA(30μg)或灭活H1N1的小鼠免受流感相关的体重减轻，而未治疗的小鼠(圆圈)和用FLuc mRNA(30μg；正方形)治疗的小鼠显示体重减轻。
图26.RNA产生。(A)未加帽的IVT产生的mRNA(参考)的电泳图；(B)使用细胞RNA来源的核苷酸的CFR产生的mRNA的电泳图；和(C)使用纯化核苷一磷酸(各自5mM)的等摩尔混合物，未加帽的CFR产生的mRNA的电泳图。
图27.CFR产生的mRNA和polyA尾长度。使用长度为0、50、100或150个核苷酸的polyA尾的CFR产生的mRNA的覆盖电泳图。
具体实施方式
本文提供了用于RNA，并且具体地信使RNA(mRNA)且更具体地真核mRNA的无细胞产生(生物合成)的方法、组合物、细胞、构建体和系统。在如下文进一步具体阐述的某些实施方案中，本公开提供了使用廉价、可扩展的起始材料(或“生物质”)的无细胞RNA(CFR)产生以提供RNA的结构单元(building block)的方法。在如下文进一步具体阐述的某些实施方案中，本文提供的方法包括所公开方法的以下一般描述的步骤。
细胞RNA转化为核苷一磷酸
为了产生RNA的核苷一磷酸“结构单元”，将细胞(内源性)RNA与一种或多种使细胞RNA(尤其包括核糖体或rRNA；信使或mRNA；以及转移RNA或tRNA)解聚为它的组分5’核苷一磷酸(NMP)的酶在无细胞反应混合物中孵育。在某些实施方案中，RNA解聚酶是使细胞RNA解聚为5’-NMP的核糖核酸酶(例如，核酸酶P1、RNA酶R)。细胞(作为RNA的来源)可被工程化为表达核酸酶，或者核酸酶可由单独的细胞产生并引入反应中。例如，来自酵母的细胞RNA可通过由桔青霉(Penicillium citrinum)产生的核酸酶P1解聚。核酸酶P1是锌依赖性单核酸酶，可将单链RNA和DNA水解为5’核苷一磷酸。所述酶没有碱基特异性。
此后(即，当细胞RNA已解聚时)，在一些实施方案中核酸酶被消除(例如通过物理分离，如过滤、沉淀、捕获和/或色谱法)或灭活(例如通过温度、pH、盐、洗涤剂、醇或其他溶剂，和/或化学抑制剂)。为了将本文所述的RNA合成方法与体外转录(IVT)的RNA合成方法进行对比，本文所述的RNA合成方法被表示为“无细胞”RNA合成。虽然IVT方法在技术上也是无细胞的，但这种方法依赖于直接添加三磷酸化的核苷酸底物，并且因此不需要额外的能量。术语“无细胞”用于对比，表示允许不需要三磷酸化的核苷酸底物(例如，5’-核苷一磷酸和/或核苷二磷酸)的RNA合成方法，因为所述方法提供激酶(或酶)和能量源(例如，磷酸供体，如聚磷酸盐或六偏磷酸盐)以将较低磷酸化程度的核苷酸转化为它们各自的三磷酸化形式。
细胞RNA转化为核苷二磷酸
在其他实施方案中，使细胞RNA解聚为核苷二磷酸(NDP)。在替代实施方案中，RNA解聚酶是在磷酸存在下使细胞RNA解聚为NDP的核糖核酸酶(例如多核苷酸磷酸化酶(PNPase))。细胞(作为RNA的来源)可被工程化为表达细胞特异性核酸酶，或者核酸酶可由单独的细胞产生并引入反应中。此后(即，当细胞RNA已解聚时)，在一些实施方案中核酸酶被消除(例如通过物理分离，如过滤、沉淀、捕获和/或色谱法)或灭活(例如通过温度、pH、盐、洗涤剂、醇或其他溶剂，和/或化学抑制剂)。
核苷三磷酸的产生
在解聚后，将无细胞反应混合物在使得NMP或NDP磷酸化为NTP(核苷三磷酸)的条件下使用多种激酶或激酶的混合物进行孵育，所述激酶包括在一些实施方案中对磷酸化所述混合物中的单独NMP中的每一者(即AMP、GMP、CMP和UMP)具有特异性的核苷单磷酸激酶、核苷二磷酸激酶(NDK)和聚磷酸盐激酶(PPK)。在解聚反应产生NDP的情况下(例如当使用PNPase时)，所述混合物将由核苷二磷酸激酶(NDK)、聚磷酸盐激酶(PPK)和任选的一种或多种核苷单磷酸激酶组成，以通过与NDK和PPK的可逆反应补救所产生的任何NMP。激酶可在发酵中(例如，在大肠杆菌细胞中)以高滴度产生。然后可使细胞裂解(例如使用高压均质化)以产生含有激酶的细胞提取物。然后例如通过加热从含有激酶的细胞提取物中除去(即消除或灭活)所述细胞提取物中存在的不合乎需要的酶活性(尤其是磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和/或水解酶)，而不使激酶活性灭活；在使用热来灭活此类不合乎需要的酶活性的某些实施方案中，激酶可以是其热稳定变体，从而产生含有激酶活性的制剂。在某些实施方案中，不合乎需要的酶活性被消除(例如通过物理分离，如过滤、沉淀、捕获和/或色谱法)或灭活(例如通过温度、pH、盐、洗涤剂、醇或其他溶剂，和/或化学抑制剂)。然后在能量源(例如聚磷酸盐，如六偏磷酸盐)存在下将NMP或NDP与所述制剂一起孵育，以在无细胞反应混合物中产生NTP。最低限度地，需要PPK和能量源来将NMP或NDP转化为NTP。任选地，包括NDK和对单独NMP中的每一者具有特异性的核苷单磷酸激酶。
聚合成RNA
使用RNA聚合酶(例如，噬菌体T7 RNA聚合酶)和工程化的模板(例如，DNA模板，由工程化的细胞表达并包含作为无细胞反应混合物的细胞组分，或稍后添加至无细胞反应混合物中)，如上所述产生的NTP可随后或同时聚合成RNA(在同一反应混合物中或在单独的反应混合物中)。在用于产生真核mRNA的一些实施方案中，提供了DNA模板，其中所述模板中编码的序列的3’末端后接聚腺苷酸序列，使得所得的RNA含有真核mRNA所特有的聚腺苷酸(polyA)尾。如本文所用，术语未加尾用于描述“缺乏polyA尾的RNA”。可替代地，在不编码位于模板中编码的序列的3’末端的聚腺苷酸序列的DNA模板中，可通过添加polyA聚合酶并在ATP存在下孵育而以酶促方式添加polyA尾。ATP可直接添加，或通过使用聚磷酸盐激酶和聚磷酸盐使AMP和/或ADP磷酸化而产生。真核mRNA产生还需要添加5’帽，这可使用本领域已知的加帽酶或加帽试剂来完成，如下文更具体地阐述的。如本文所用，术语未加帽是指缺乏帽的RNA。
待合成的RNA
如下文所述，在一个实施方案中，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；以及任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶和v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生mRNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码具有polyA尾的mRNA的DNA模板和viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中，任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶。
在第二实施方案中，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体，和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶和v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码未加尾RNA的DNA模板和viii)一种或多种加帽试剂；并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生mRNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物，或(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生mRNA。
在第三实施方案中，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶和v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码具有poly A尾的mRNA的DNA模板，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及(d)交换来自步骤(c)的所述反应混合物的缓冲液条件并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
在第四实施方案中，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶和v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽、未加尾RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码mRNA的DNA模板，并且进一步其中，任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生未加帽RNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物；或(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生未加帽RNA；以及e)交换来自步骤(c)的所述反应混合物的缓冲液条件并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
在第五实施方案中，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶和v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生mRNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码具有polyA尾的mRNA的DNA模板、viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶。
在第六实施方案中，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体，和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶和v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码未加尾RNA的DNA模板和viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生mRNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合或(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生mRNA。
在第七实施方案中，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶和v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶和vii)至少一种编码具有poly A尾的mRNA的DNA模板；并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及(d)交换来自步骤(c)的所述反应混合物的缓冲液条件并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
在第八实施方案中，本公开的特征是一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶和v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽、未加尾RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶和vii)至少一种编码mRNA的DNA模板，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；(d)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生未加帽RNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物；或(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生未加帽RNA；以及(e)交换来自步骤(c)的所述反应混合物的缓冲液条件并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
在其他实施方案中，对于上述每个实施方案，可在(c)的其余步骤之前而不是同时进行步骤(c)(i)-(c)(v)以产生核苷酸三磷酸。
在上述实施方案中，第二反应混合物可通过混合第二反应混合物或将所列举组分添加至第一反应混合物来产生第二反应混合物而实现。
此外，如上所述，通过除每个实施方案的步骤(a)和(b)中所述的细胞RNA的解聚以外的方法产生的核苷酸(例如，源自发酵过程、化学过程或化学酶促过程的核苷酸)也可用作步骤(c)中的核苷酸，从而消除对每个实施方案的步骤(a)和(b)的需要。此类核苷酸可包括NMP、NDP、NTP或其混合物。此外，此类核苷酸可由一种或多种未修饰的核苷酸、修饰的核苷酸或其混合物组成。此类核苷酸可进一步由一种或多种未修饰的NMP和一种或多种修饰的NTP，或未修饰的AMP、CMP和具有假UTP的GMP，或未修饰的AMP、GMP、假UTP和5-甲基CTP组成。可将修饰的核苷酸添加至细胞来源的核苷酸中以实现部分修饰的所得mRNA。与此一致，此类核苷酸的使用可产生如本文实施方案中所述的mRNA。
在一个实施方案中，所述方法涉及使用细胞RNA的无细胞RNA合成，其中poly-A尾在DNA模板中编码。所述方法包括(a)裂解包含激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、一种或多种加帽酶的一种或多种细胞培养物，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将细胞RNA与使RNA解聚的酶(例如核酸酶P1)在一个或多个反应中合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述反应，从而产生包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的一种或多种细胞裂解物，以产生5’NMP制剂和酶制剂；(d)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子和位于在所述模板中编码的序列的3’末端的聚腺苷酸序列，从而产生包含未加帽RNA的无细胞反应混合物；以及(e)交换缓冲液并将在步骤(c)中产生的一种或多种加帽酶制剂与甲基供体(例如，S-腺苷甲硫氨酸)一起添加至步骤(d)的反应混合物，并在GTP存在下孵育，从而产生mRNA。在一方面，步骤(d)中的无细胞反应混合物包含NMP、激酶、能量和磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶以及能量和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。任选地，在RNA合成之后，用脱氧核糖核酸酶处理所述反应混合物。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞RNA的无细胞RNA合成，其中酶促添加polyA尾。所述方法包括(a)裂解包含激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、PolyA聚合酶、一种或多种加帽酶的一种或多种细胞培养物，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将细胞RNA与使RNA解聚的酶(例如核酸酶P1)在一个或多个反应中合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述反应，从而产生包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的一种或多种细胞裂解物，以产生5’NMP制剂和酶制剂；(d)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子，从而产生包含未加帽、未加尾RNA的无细胞反应混合物；(e)用脱氧核糖核酸酶处理所述无细胞反应混合物；(f)在polyA聚合酶和ATP存在下酶促添加polyA尾以产生未加帽RNA；以及(g)交换缓冲液并将在步骤(c)中产生的一种或多种加帽酶制剂与甲基供体(例如，S-腺苷甲硫氨酸)一起添加至步骤(f)的反应混合物，并在GTP存在下孵育，从而产生mRNA。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，其中poly-A尾在DNA模板中编码。所述方法包括(a)裂解包含细胞RNA、激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶的一种或多种细胞培养物，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将步骤(a)中产生的包含细胞RNA的一种或多种细胞裂解物与使RNA解聚的酶(例如核酸酶P1)合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述细胞裂解物，从而产生包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的包含激酶和RNA聚合酶的一种或多种细胞裂解物，以产生5’NMP制剂和酶制剂；(d)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)、加帽试剂、DNA模板和加帽试剂存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子和位于在所述模板中编码的序列的3’末端的聚腺苷酸序列，从而产生包含mRNA的无细胞反应混合物。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。任选地，在RNA合成之后，用脱氧核糖核酸酶处理所述反应混合物。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，其中酶促添加poly-A尾。所述方法包括(a)裂解包含细胞RNA、激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、polyA聚合酶的一种或多种细胞培养物，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将步骤(a)中产生的包含细胞RNA的一种或多种细胞裂解物与使RNA解聚的酶(例如核酸酶P1)合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述细胞裂解物，从而产生包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的包含激酶、RNA聚合酶和polyA聚合酶的一种或多种细胞裂解物，以产生5’NMP制剂和酶制剂；(d)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)、DNA模板和加帽试剂存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码未加尾RNA的核苷酸序列的启动子，从而产生包含未加尾RNA的无细胞反应混合物；(e)用脱氧核糖核酸酶处理所述无细胞反应混合物；以及(f)在polyA聚合酶和ATP存在下酶促添加polyA尾，从而产生mRNA。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，所述细胞裂解物包含含有启动子的DNA模板，其中poly-A尾在模板中编码。所述方法包括(a)裂解包含激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、DNA模板、一种或多种加帽酶的一种或多种细胞培养物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子和位于在所述模板中编码的序列的3’末端的聚腺苷酸序列，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将细胞RNA与使RNA解聚的酶(例如核酸酶P1)在一个或多个反应中合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述反应，从而产生包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的一种或多种细胞裂解物，以产生5’-NMP制剂、酶制剂和DNA模板制剂；(d)将所述DNA模板与紧邻所编码polyA尾的3’裂解的限制性核酸内切酶(例如IIS型限制性核酸内切酶)一起孵育，以产生线性化DNA模板的制剂，且随后灭活或除去所述限制性核酸内切酶；(e)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，从而产生包含未加帽RNA的无细胞反应混合物；以及(e)交换缓冲液并将在步骤(c)中产生的一种或多种加帽酶制剂与甲基供体(例如，S-腺苷甲硫氨酸)一起添加至步骤(d)的反应混合物并在GTP存在下孵育，从而产生mRNA。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，所述细胞裂解物包含含有启动子的DNA模板，其中酶促添加poly-A尾。所述方法包括RNA合成方法可包括(a)裂解包含激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、PolyA聚合酶、DNA模板、一种或多种加帽酶的一种或多种细胞培养物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码未加尾RNA的核苷酸序列的启动子，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将细胞RNA与使RNA解聚的酶(例如核酸酶P1)在一个或多个反应中合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述反应，从而产生包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的一种或多种细胞裂解物，以产生5’-NMP制剂、酶制剂和DNA模板制剂，将所述DNA模板与紧邻所编码未加尾RNA的3’裂解的限制性核酸内切酶(例如IIS型限制性核酸内切酶)一起孵育，以产生线性化DNA模板的制剂，且随后灭活或除去所述限制性核酸内切酶；(d)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，从而产生包含未加帽、未加尾RNA的无细胞反应混合物；(e)用脱氧核糖核酸酶处理所述无细胞反应混合物；(f)在polyA聚合酶和ATP存在下酶促添加polyA尾，从而产生包含未加帽RNA的无细胞反应混合物；(g)交换缓冲液并将在步骤(c)中产生的一种或多种加帽酶制剂与甲基供体(例如，S-腺苷甲硫氨酸)一起添加至步骤(f)的反应混合物并在GTP存在下孵育，从而产生mRNA。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，其中poly-A尾在模板中编码。所述方法包括(a)裂解包含细胞RNA、激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、DNA模板的一种或多种细胞培养物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子和位于在所述模板中编码的序列的3’末端的聚腺苷酸序列，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将在步骤(a)中产生的包含细胞RNA的一种或多种细胞裂解物与使RNA解聚的酶(例如核酸酶P1)合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述细胞裂解物，从而产生包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的包含激酶、RNA聚合酶和一种或多种加帽酶的一种或多种细胞裂解物，以产生5’-NMP制剂、酶制剂和DNA模板制剂；(d)将所述DNA模板与紧邻所编码polyA尾的3’裂解的限制性核酸内切酶(例如IIS型限制性核酸内切酶)一起孵育，以产生线性化DNA模板的制剂，且随后灭活或除去所述限制性核酸内切酶；(e)将在(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)、加帽酶和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，从而产生包含mRNA的无细胞反应混合物。任选地，在RNA合成之后，用脱氧核糖核酸酶处理所述反应混合物。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，所述细胞裂解物包含DNA模板，其中酶促添加poly-A尾。所述方法包括RNA合成方法可包括(a)在一个或多个反应中裂解包含细胞RNA、激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、PolyA聚合酶、DNA模板的一种或多种细胞培养物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码未加尾RNA的核苷酸序列的启动子，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将在步骤(a)中产生的包含细胞RNA的一种或多种细胞裂解物与使RNA解聚的酶(例如核酸酶P1)合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述细胞裂解物，从而产生包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷一磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的包含激酶和RNA聚合酶的一种或多种细胞裂解物，以产生5’-NMP制剂、酶制剂和DNA模板制剂；(d)将所述DNA模板与紧邻所编码未加尾RNA的3’裂解的限制性核酸内切酶(例如IIS型限制性核酸内切酶)一起孵育，以产生线性化DNA模板的制剂，且随后灭活或除去所述限制性核酸内切酶；(e)将在(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)、加帽酶和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，从而产生包含未加尾RNA的无细胞反应混合物；(f)用脱氧核糖核酸酶处理所述无细胞反应混合物；以及(g)通过在polyA聚合酶和ATP存在下孵育而酶促添加polyA尾，从而产生mRNA。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，其中poly-A尾在DNA模板中编码。所述方法包括(a)裂解包含激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、一种或多种加帽酶的一种或多种细胞培养物，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将细胞RNA与使RNA解聚的酶(例如PNPase)在一个或多个反应中合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述反应，从而产生包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的一种或多种细胞裂解物，以产生NDP制剂和酶制剂；(d)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子和位于在所述模板中编码的序列的3’末端的聚腺苷酸序列，从而产生包含未加帽RNA的无细胞反应混合物；(e)交换缓冲液并将在步骤(c)中产生的一种或多种加帽酶制剂与甲基供体(例如，S-腺苷甲硫氨酸)一起添加至步骤(d)的反应混合物并在GTP存在下孵育，从而产生mRNA。任选地，在RNA合成之后，用脱氧核糖核酸酶处理所述反应混合物。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，所述细胞裂解物包含含有启动子的DNA模板，其中酶促添加poly-A尾。所述方法包括(a)裂解包含激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、PolyA聚合酶、一种或多种加帽酶的一种或多种细胞培养物，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将细胞RNA与使RNA解聚的酶(例如PNPase)在一个或多个反应中合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述反应，从而产生包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的一种或多种细胞裂解物，以产生5’NDP制剂和酶制剂；(d)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码未加尾RNA的核苷酸序列的启动子，从而产生包含未加帽、未加尾RNA的无细胞反应混合物；(e)用脱氧核糖核酸酶处理所述无细胞反应混合物；(f)通过添加polyA聚合酶并在ATP存在下孵育而酶促添加polyA尾，从而产生未加帽RNA；(g)交换缓冲液并将在步骤(c)中产生的一种或多种加帽酶制剂与甲基供体(例如，S-腺苷甲硫氨酸)一起添加至步骤(f)的反应混合物并在GTP存在下孵育，从而产生mRNA。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，其中poly-A尾在DNA模板中编码。所述方法包括(a)裂解包含细胞RNA、激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶的一种或多种细胞培养物，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将步骤(a)中产生的包含细胞RNA的一种或多种细胞裂解物与使RNA解聚的酶(例如PNPase)合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述细胞裂解物，从而产生包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的包含激酶和RNA聚合酶的一种或多种细胞裂解物，以产生5’-NDP制剂和酶制剂；(d)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)、加帽试剂和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子和位于在所述模板中编码的序列的3’末端的聚腺苷酸序列，从而产生包含mRNA的无细胞反应混合物。任选地，在RNA合成之后，用脱氧核糖核酸酶处理所述反应混合物。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，所述细胞裂解物包含含有启动子的DNA模板，其中酶促添加poly-A尾。所述方法包括(a)裂解包含细胞RNA、激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、PolyA聚合酶的一种或多种细胞培养物，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将步骤(a)中产生的包含细胞RNA的一种或多种细胞裂解物与使RNA解聚的酶(例如PNPase)合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述细胞裂解物，从而产生包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的包含激酶、RNA聚合酶和一种或多种加帽酶的一种或多种细胞裂解物，以产生5’-NMP制剂和酶制剂；(d)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)、加帽试剂和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码未加尾RNA的核苷酸序列的启动子，从而产生包含未加尾RNA的无细胞反应混合物；(e)用脱氧核糖核酸酶处理所述无细胞反应混合物；(f)通过添加polyA聚合酶并在ATP存在下孵育而酶促添加polyA尾，从而产生mRNA。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，其中poly-A尾在DNA模板中编码。所述方法包括(a)裂解包含激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、DNA模板、一种或多种加帽酶的一种或多种细胞培养物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子和位于在所述模板中编码的序列的3’末端的聚腺苷酸序列，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将细胞RNA与使RNA解聚的酶(例如PNPase)在一个或多个反应中合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述反应，从而产生包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的一种或多种细胞裂解物，以产生5’NDP制剂、酶制剂和DNA模板制剂；d)将所述DNA模板与紧邻所编码polyA尾的3’裂解的限制性核酸内切酶(例如IIS型限制性核酸内切酶)一起孵育，以产生线性化DNA模板的制剂，且随后灭活或除去所述限制性核酸内切酶；(e)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，从而产生包含未加帽RNA的无细胞反应混合物；以及(f)交换缓冲液并将在步骤(c)中产生的一种或多种加帽酶制剂与甲基供体(例如，S-腺苷甲硫氨酸)一起添加至步骤(e)的反应混合物，并在和GTP存在下孵育，从而产生mRNA。任选地，在RNA合成之后，用脱氧核糖核酸酶处理所述反应混合物。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，其中poly-A尾在DNA模板中编码。所述方法包括(a)裂解包含激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、PolyA聚合酶、DNA模板和一种或多种加帽酶的一种或多种细胞培养物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码未加尾RNA的核苷酸序列的启动子，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将细胞RNA与使RNA解聚的酶(例如PNPase)在一个或多个反应中合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述反应，从而产生包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的一种或多种细胞裂解物，以产生5’NDP制剂、酶制剂和DNA模板制剂，(d)将所述DNA模板与紧邻所编码未加尾RNA的3’裂解的限制性核酸内切酶(例如IIS型限制性核酸内切酶)一起孵育，以产生线性化DNA模板的制剂，且随后灭活或除去所述限制性核酸内切酶；(e)将在(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，从而产生包含未加帽、未加尾RNA的无细胞反应混合物；(f)用脱氧核糖核酸酶处理所述无细胞反应混合物；(g)通过添加polyA聚合酶并在ATP存在下孵育而酶促添加polyA尾，从而产生未加帽RNA；(h)交换缓冲液并将在步骤(c)中产生的一种或多种加帽酶制剂与甲基供体(例如，S-腺苷甲硫氨酸)一起添加至步骤(e)的反应混合物并在GTP存在下孵育，从而产生mRNA。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，RNA合成方法可包括(a)在一个或多个反应中裂解包含细胞RNA、激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、DNA模板的一种或多种细胞培养物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子和位于在所述模板中编码的序列的3’末端的聚腺苷酸序列，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将在步骤(a)中产生的包含细胞RNA的一种或多种细胞裂解物与使RNA解聚的酶(例如PNPase)合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述细胞裂解物，从而产生包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的包含激酶、RNA聚合酶和一种或多种加帽酶的一种或多种细胞裂解物，以产生5’NDP制剂、酶制剂和DNA模板制剂；d)将所述DNA模板与紧邻所编码polyA尾的3’裂解的限制性核酸内切酶(例如IIS型限制性核酸内切酶)一起孵育，以产生线性化DNA模板的制剂，且随后灭活或除去所述限制性核酸内切酶；(e)将在步骤(c)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)、加帽酶和DNA模板存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，从而产生包含mRNA的无细胞反应混合物。任选地，在RNA合成之后，用脱氧核糖核酸酶处理所述反应混合物。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
在另一实施方案中，所述方法涉及使用细胞裂解物的无细胞RNA合成，所述细胞裂解物包含DNA模板，其中酶促添加poly-A尾。所述方法包括(a)在一个或多个反应中裂解包含细胞RNA、激酶(例如核苷一磷酸(NMP)激酶、核苷二磷酸(NDP)激酶、聚磷酸盐激酶)、RNA聚合酶、PolyA聚合酶、DNA模板的一种或多种细胞培养物，所述DNA模板含有可操作地连接至编码未加尾RNA的核苷酸序列的启动子，从而产生一种或多种细胞裂解物；(b)将在步骤(a)中产生的包含细胞RNA的一种或多种细胞裂解物与使RNA解聚的酶(例如PNPase)合并，并在使得RNA解聚的条件下孵育所述细胞裂解物，从而产生包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物；(c)用消除或灭活不需要的酶活性的一种或多种处理来处理(i)在步骤(b)中产生的包含5’核苷二磷酸的无细胞反应混合物和(ii)在步骤(a)中产生的包含激酶和RNA聚合酶的一种或多种细胞裂解物，以产生5’NDP制剂、酶制剂和DNA模板制剂；(d)将所述DNA模板与紧邻所编码未加尾RNA的3’裂解的限制性核酸内切酶(例如IIS型限制性核酸内切酶)一起孵育，以产生线性化DNA模板的制剂，且随后灭活或除去所述限制性核酸内切酶；(e)将在步骤(c-d)中产生的一种或多种制剂合并在包含激酶和RNA聚合酶的无细胞反应混合物中，并在能量和磷酸源(例如聚磷酸盐)和加帽试剂存在下在使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件下孵育所述无细胞反应混合物，从而产生包含未加尾RNA的无细胞反应混合物；(g)用脱氧核糖核酸酶处理所述无细胞反应混合物；(h)通过添加polyA聚合酶并在ATP存在下孵育而酶促添加polyA尾，从而产生mRNA。在一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶、磷酸源、DNA模板和RNA聚合酶。在另一方面，所述无细胞反应混合物包含NMP、激酶和磷酸源。然后将所述反应混合物与DNA模板和RNA聚合酶混合。
合成mRNA的其他实施方案包括，在由分别解聚为NMP或NDP的细胞RNA产生的任何未加帽mRNA中包含内部核糖体进入位点(IRES)，如上所述。在其他实施方案中，由任何前述实施方案产生的未加帽mRNA随后使用加帽酶加帽以产生加帽的mRNA。在其他实施方案中，由分别解聚为NMP或NDP的细胞RNA产生的未加帽mRNA随后使用加帽酶加帽以产生加帽的mRNA。在其他实施方案中，任何前述实施方案的含有RNA聚合酶的步骤还包括帽类似物，从而产生加帽的mRNA而不是未加帽RNA，并且避免了对后续酶促加帽步骤的需要。
如上所述，RNA终产物的实例优选包括信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，RNA终产物(生物合成的RNA)的浓度是至少1g/L至50g/L。例如，RNA终产物的浓度可以是1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50g/L或更高。在许多实施方案中，RNA终产物的浓度是至少1g/L。单批次可达到或超过10,000L。
无细胞产生
“无细胞产生”是在不使用活细胞的情况下使用生物过程合成生物分子或化合物。最初在此类方法中，使细胞裂解，从而产生细胞裂解物。均含有酶的未纯化(粗)部分或部分纯化的部分可用于产生所需产物。在一些实施方案中，在此类过程中使用的酶是可添加至细胞裂解物的纯化酶。作为非限制性实例，可通过高压均质化或其他细胞裂解方法(例如化学细胞裂解)来培养、收获和裂解细胞。无细胞反应可以分批或补料分批模式进行。在一些情况下，酶促途径填充反应器的工作容积，并且可比细胞内环境中更稀。然而基本上所有的细胞催化剂都可由此提供，包括膜缔合的催化剂。
应当理解，虽然本文描述的许多实施方案提及“裂解包含特定酶的培养细胞”，但所述短语意图涵盖裂解从单一培养物获得的细胞的克隆群体(例如，含有合成RNA所需的所有酶)以及裂解多于一个细胞克隆群体，每个克隆群体从不同的细胞培养物获得(例如，各自含有合成RNA所需的一种或多种酶和/或细胞RNA底物)。例如，在一些实施方案中，表达特定激酶的细胞群体(例如，工程化的细胞)可一起培养并用于产生一种细胞裂解物，并且表达不同激酶的另一个细胞群体(例如，工程化的细胞)可一起培养并用于产生另一种细胞裂解物。然后可将这两种或更多种细胞裂解物(各自包含不同的激酶)合并用于本公开的无细胞mRNA生物合成方法中。在本发明的实施方案中，其中在酶如需要维持其酶活性的激酶的存在下使用热来灭活不需要的酶活性，有利地采用此类酶(如激酶或)的热稳定变体。
生物质核糖核酸解聚为核苷一磷酸
本公开是基于通过涉及一系列酶促反应的无细胞过程将RNA从生物质(例如，内源性细胞RNA)转化为所需的合成mRNA。首先，存在于反应混合物中的源自细胞RNA的RNA(例如，内源性RNA)通过核酸酶转化为其组成单体。如本文所用和本领域所理解的，术语“生物质”意图表示细胞材料的总质量，并且包括但不限于碳水化合物、DNA、脂质、蛋白质、RNA以及其片段。任选地，在转化为单体之前，可对RNA进行粗纯化。来自生物质的RNA(例如，内源性RNA)通常包括核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、其他RNA或它们的组合。用适当的核酸酶，例如产生5’-核苷一磷酸(5’-NMP)的核酸酶解聚或降解RNA产生5’-NMP的池，也简称为“单体”。这些单体(其被转化为核苷二磷酸，所述核苷二磷酸被进一步转化为核苷三磷酸)用作mRNA的下游聚合/合成的起始材料。在一些实施方案中，所述单体具有修饰的主链谱系或者是替代碱基，即硫代酸酯，并且用专门的核酸酶解聚并用专门的激酶磷酸化。如题为“Methods and Compositions for Nucleoside Triphosphate andRibonucleic Acid Production”的PCT/US2018/05535中所描述，预期阐述商业数量的NTP，所述专利以引用的方式整体并入本文。
合成mRNA所需的RNA(例如，内源性RNA)的量可变化，这取决于例如特定mRNA的所需长度和产量以及相对于细胞的RNA(例如，来自大肠杆菌细胞或酵母细胞的内源性RNA)的核苷酸组成，mRNA的核苷酸组成。通常，对于细菌细胞，例如RNA(例如，内源性RNA)含量在总细胞质量的5％-50％的范围内，而对于真核细胞，所述量是约20％。例如，可使用以下等式计算起始材料的质量百分比：(千克(kg)的RNA/千克的干细胞重量)x 100％。
内源性RNA可通过化学或酶促方式解聚或降解为其组成单体。然而，RNA的化学水解通常产生2'-和3’-NMP，所述2'-和3’-NMP不能聚合成RNA并且因此不如酶促降解方法有利。因此，如本文提供的方法、组合物和系统主要使用酶来使内源性RNA解聚。“使RNA解聚的酶”催化RNA分子中的两个核苷酸之间的磷酸二酯键的水解。因此，“使RNA解聚的酶”将RNA(细胞RNA)转化为其单体形式，即核苷一磷酸(NMP)或核苷二磷酸(NDP)。取决于酶，RNA的酶促解聚可产生3’-NMP、5’-NMP、3’-NMP和5’-NMP的组合或5’-NDP。因为不可能聚合3’-NTP(由3’-NDP转化，所述3’-NDP由3’-NMP转化)，所以产生5’-NMP(其然后转化为5’-NDP，且然后转化为5’-NTP)或5’-NDP(其然后转化为5’-NTP)的酶如核酸酶P1或PNPase是优选的。在一些实施方案中，从工程化细胞的基因组DNA中除去产生3’-NMP的酶以提高RNA产生的效率。在一些实施方案中，用于RNA解聚的酶是核酸酶P1。在一些实施方案中，所用核酸酶P1的浓度是0.1-3.0mg/mL(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0mg/mL)。在一些实施方案中，所用核酸酶P1的浓度是1-3mg/mL。
使RNA解聚的酶的实例包括但不限于核酸酶(例如，核酸酶P1)，包括核糖核酸酶(RNA酶，例如RNA酶R)和磷酸二酯酶。核酸酶催化核酸降解成更小的组分(例如，单体，也称为核苷一磷酸或寡核苷酸)。磷酸二酯酶催化磷酸二酯键的降解。使RNA解聚的这些酶可由全长基因或由基因融合体(例如，在两种不同酶活性下编码的包含至少两种不同基因(或基因片段)的DNA)编码。
RNA酶在细胞中起作用以调控RNA成熟和转换。每种RNA酶都具有特定底物偏好。因此，在一些实施方案中，不同RNA酶的组合或不同核酸酶的组合通常可用于使生物质来源的RNA(例如，内源性RNA)解聚。例如，可组合使用1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10种不同的核酸酶来使RNA解聚。在一些实施方案中，可组合使用至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同的核酸酶来使RNA解聚。如本文所提供使用的核酸酶的非限制性实例包括在表1中。在一些实施方案中，所使用的核酸酶是核酸酶P1。
表1.用于RNA解聚的酶的实例
Figure BDA0003356710250000351
Figure BDA0003356710250000361
使RNA解聚的酶(例如，RNA酶)可以是宿主细胞内源性的(宿主来源的)，或者它们可由外源引入宿主细胞中(例如，在附加型载体上或整合到宿主细胞的基因组中)的工程化的核酸编码。可替代地，可将酶作为分离的蛋白质(包括商业来源的分离的蛋白质)添加至反应中。作为其他替代方案，部分纯化的酶可用于反应中，包括从内源性产生酶的细胞或经工程化以产生酶的细胞部分纯化的酶。
为了在无细胞反应混合物中孵育细胞RNA，使得RNA解聚的条件是本领域已知的或者可由本领域普通技术人员确定，例如将特定核酸酶(例如，核酸酶P1)活性的最佳条件，包括pH、温度、时间长度和细胞裂解物的盐浓度以及任何外源性辅因子考虑在内。这些反应条件的实例包括先前描述的那些(参见例如，Wong等人,1983,J.Am.Chem.Soc.105:115-117；欧洲专利号EP1587947B1；或Cheng和Deutscher,2002,J Biol Chem.277:21624-21629)。
在一些实施方案中，金属离子(例如，Zn2+、Mg2+)从解聚反应中耗尽。在一些实施方案中，金属离子(例如，Zn2+、Mg2+)的浓度是8mM或更低(例如，小于8mM、小于7mM、小于6mM、小于5mM、小于4mM、小于3mM、小于2mM、小于1mM、小于0.5mM、小于0.1mM和小于0.05mM)。在一些实施方案中，金属离子(例如，Zn2+、Mg2+)的浓度是0.1mM-8mM、0.1mM-7mM或0.1mM-5mM。在一些实施方案中，金属离子是Zn2+。
在RNA解聚反应期间细胞裂解物的pH可具有3至8的值。在一些实施方案中，细胞裂解物的pH值是3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、3-7、4-7、5-7、6-7、3-6、4-6、5-6、3-5、3-4或4-5。在一些实施方案中，细胞裂解物的pH值是3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。在一些实施方案中，细胞裂解物的pH值是5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在一些有利的实施方案中，pH是5.8。可根据需要调节细胞裂解物的pH。
在RNA解聚反应期间细胞裂解物的温度可以是15℃至99℃。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间细胞裂解物的温度是15℃-95℃、15℃-90℃、15℃-80℃、15℃-70℃、15℃-60℃、15℃-50℃、15℃-40℃、15℃-30℃、25℃-95℃、25℃-90℃、25℃-80℃、25℃-70℃、25℃-60℃、25℃-50℃、25℃-40℃、25℃-30℃、30℃-95℃、30℃-90℃、30℃-80℃、30℃-70℃、30℃-60℃、30℃-50℃、40℃-95℃、40℃-90℃、40℃-80℃、40℃-70℃、40℃-60℃、40℃-50℃、50℃-95℃、50℃-90℃、50℃-80℃、50℃-70℃、50℃-60℃、60℃-95℃、60℃-90℃、60℃-80℃或60℃-70℃。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间细胞裂解物的温度是70℃。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间细胞裂解物的温度是15℃、25℃、32℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃。
在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间无细胞反应混合物在70℃的温度下孵育24小时。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间反应混合物在70℃的温度下孵育5-30分钟。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间反应混合物具有5-5.5的pH并且在70℃的温度下孵育15分钟。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间反应混合物可在使得大于65％的RNA转化为NDP或RNA转化为5’-NMP的条件下孵育。在一些实施方案中，RNA以(或至少)50mM/hr、100mM/hr或200mM/hr的速率转化为NDP或5’-NMP。在其他实施方案中，在RNA解聚反应期间反应混合物在较高温度(例如，50℃-70℃)下孵育。
可将为实现RNA解聚反应而产生的细胞裂解物孵育5分钟(min)至72小时(hr)。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间将细胞裂解物孵育5-10分钟、5-15分钟、5-20分钟、5-30分钟或5分钟-48小时。例如，在RNA解聚反应期间细胞裂解物可孵育5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间细胞裂解物在37℃的温度下孵育24小时。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间细胞裂解物在70℃的温度下孵育5-10分钟。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间细胞裂解物具有5-5.5的pH并且在70℃的温度下孵育15分钟。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间细胞裂解物可在使得大于65％的RNA转化为5’-NMP的条件下孵育。在一些实施方案中，RNA以(或至少)50mM/hr、100mM/hr或200mM/hr的速率转化为5’-NMP。
在一些实施方案中，将盐添加至细胞裂解物，例如以防止酶聚集。例如，可将氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾或它们的组合添加至细胞裂解物。在RNA解聚反应期间细胞裂解物中盐的浓度可以是5mM至1M。在一些实施方案中，在RNA解聚反应期间细胞裂解物中盐的浓度是5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、500mM、750mM或1M。在一些实施方案中，细胞裂解物包含混合物，所述混合物包含40-60mM磷酸钾、1-5mM MnCl2和/或10-50mM MgCl2(例如，20mM MgCl2)。
在一些实施方案中，将缓冲液添加至细胞裂解物，例如以达到特定pH值和/或盐浓度。缓冲液的实例包括但不限于磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、苹果酸盐缓冲液、MES缓冲液、组氨酸缓冲液、PIPES缓冲液、bis-tris缓冲液和乙醇胺缓冲液。
在一些实施方案中，核酸酶P1用于使生物质解聚。在一些实施方案中，核酸酶P1在后续步骤之前从反应中滤出。
RNA的解聚可使得产生5’-NMP，包括5’-AMP、5’-UMP、5’-CMP和5’-GMP。应理解，RNA的解聚不会产生任何预定比例的NMP，而是将取决于细胞RNA的组成。
在一些实施方案中，PNPase用于使生物质解聚。在一些实施方案中，PNPase在后续步骤之前被灭活或从反应中消除。
在磷酸盐存在下RNA的解聚可使得产生5’-NDP，包括5’-ADP、5’-UDP、5’-CDP和5’-GDP。应理解，RNA的解聚不会产生任何预定比例的NDP，而是将取决于细胞RNA的组成。如本文所用，使用PNPase制备NDP需要使用磷酸盐。
在一些实施方案中，细胞中50％-98％的内源性RNA在裂解时转化为(解聚为)5’-NMP或5’-NDP。例如，50％-95％、50％-90％、50％-85％、50％-80％、75％-98％、75％-95％、75％-90％、75％-85％或75％-80％的RNA转化为(解聚为)5’-NMP。在一些实施方案中，细胞中65％-70％的内源性RNA在裂解时转化为(解聚为)5’-NMP或5’NDP。较低的产率也是可接受的。
RNA解聚酶的消除或灭活
在通过内源性和/或外源性核酸酶将来自生物质的RNA(例如，内源性RNA)转化为其单体组分(例如，NMP或NDP)之后，反应混合物或细胞裂解物中可能仍残留多种酶，包括核酸酶和磷酸酶，所述酶可对RNA生物合成具有有害影响。例如，用于解聚的核酸酶(例如核酸酶P1)可在生物质解聚后保持活性。作为另一个实例，细胞RNA来源含有许多天然磷酸酶，其中许多使NTP、NDP和NMP去磷酸化。在RNA解聚后，源自细胞RNA的NMP的去磷酸化可导致非磷酸化核苷的累积，并且导致可用NMP底物的损失，从而降低合成RNA产率。
不需要的酶活性的消除或灭活
对于包含源自细胞的材料(例如细胞裂解物或从细胞裂解物获得的酶制剂)的反应混合物，使用本文所述的任何方法除去、消除或灭活不需要的天然酶活性可以是有利的。不需要的天然酶活性包括例如磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。在RNA解聚为NMP后，NDP或NTP的去磷酸化可导致无用的能量循环(产生低产率合成RNA的能量循环)，在此期间NMP被磷酸化为NDP和NTP，并且进而去磷酸化为NMP或核苷起点。无用的循环降低每单位能量输入(例如聚磷酸盐、ATP或其他高能磷酸盐来源)的RNA产物产率。
许多方法可用于除去、消除或灭活不需要的酶活性。在一些实施方案中，通过从宿主基因组中除去编码有害酶的基因来除去不需要的酶活性。如本文提供的对RNA生物合成有害的酶可在工程化期间从宿主细胞基因组中缺失，条件是所述酶对于宿主细胞(例如，细菌细胞)存活和/或生长不是必需的。酶或酶活性的缺失可例如通过在宿主细胞基因组中缺失或修饰编码所述酶的基因来实现。如果宿主细胞在没有特定酶的表达和/或活性的情况下不能，则酶是“宿主细胞存活所必需的”。类似地，如果宿主细胞在没有特定酶的表达和/或活性的情况下不能分裂和/或生长，则酶是“宿主细胞生长所必需的”。
如果对RNA的生物合成有害的酶是宿主细胞存活和/或生长所必需的，则可使用其他方法。在一些实施方案中，通过热灭活来消除酶活性。在一些实施方案中，通过pH的变化来消除酶活性。在一些实施方案中，通过盐浓度的变化来消除酶活性。在一些实施方案中，通过用醇或另一种有机溶剂处理来消除酶活性。在一些实施方案中，通过洗涤剂处理来消除酶活性。在一些实施方案中，通过使用化学抑制剂消除酶活性。在一些实施方案中，通过物理分离消除酶活性，所述物理分离包括但不限于过滤、沉淀和捕获和/或色谱法的方法。在一些实施方案中，所使用的色谱法是固定化金属色谱法。在一些实施方案中，捕获方法需要酶具有六组氨酸标签。也可使用任何前述方法的组合。
在一些实施方案中，通过遗传修饰、从细胞分泌酶、定位(例如周质靶向)和/或蛋白酶靶向来除去天然酶活性。在其他实施方案中，通过温度、pH、盐、洗涤剂、醇或其他溶剂和/或化学抑制剂使天然酶活性灭活。在其他实施方案中，通过物理分离如沉淀、过滤、捕获和/或色谱法消除天然酶活性。
可使用遗传、条件或分离方法除去不需要的(例如，天然的)酶活性。在一些实施方案中，使用遗传方法来除去不需要的酶活性。因此，在一些实施方案中，对细胞进行修饰以减少或除去不需要的酶活性。可用于降低或除去不需要的酶活性的遗传方法的实例包括但不限于分泌、基因敲除和蛋白酶靶向。在一些实施方案中，使用条件方法来除去不需要的酶活性。因此，在一些实施方案中，表现出不需要的活性的不需要的酶保留在酶制剂、细胞裂解物和/或反应混合物中并且被选择性地灭活。可用于降低或除去不需要的酶活性的条件方法的实例包括但不限于温度、pH、盐、洗涤剂、醇或其他溶剂和/或化学抑制剂的变化。在一些实施方案中，使用分离/纯化方法来除去不需要的酶活性。因此，在一些实施方案中，使表现出不需要的活性的不需要的酶与酶制剂、细胞裂解物和/或反应混合物物理分离。可用于降低或消除不需要的酶活性的分离方法的实例包括但不限于物理分离，如过滤、沉淀、捕获和/或色谱法。
在本文提供的各种实施方案中，由表达途径酶的细胞或细胞裂解物制备的酶用于反应混合物中以产生NTP和/或RNA。在这些细胞或细胞裂解物中，存在可能对NTP和/或RNA产生具有有害影响的酶。此类酶的非限制性实例包括磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和/或水解酶，如由大肠杆菌细胞表达的那些。磷酸酶除去磷酸基团(例如，将NMP转化为核苷，将NDP转化为NMP，或者将NTP转化为NDP)，这由于核苷酸磷酸化/去磷酸化的无用循环而降低NTP产生。核酸酶将核酸裂解成单体或寡聚体，其导致RNA产物降解(例如，通过RNA酶)和/或DNA模板降解(例如，通过DNA酶)。蛋白酶将蛋白质裂解成氨基酸或肽，其降解途径酶。脱氨酶除去氨基，其通过将途径中间体转化为无用的底物(例如黄嘌呤和次黄嘌呤)而降低NTP浓度，并且可导致RNA产物中的突变(例如，C至U)。水解酶(例如，核苷水解酶或核苷酸水解酶)将核苷或核苷酸裂解成碱基和糖部分，这由于核苷酸的不可逆降解而降低NTP浓度。氧化还原酶催化电子从一个分子(氧化剂)转移至另一个分子(还原剂)。氧化和/或还原反应可例如损伤DNA和/或RNA中的核碱基，从而导致转录和/或翻译错误，或损伤蛋白质或酶，从而导致功能丧失。
因此，在许多实施方案中，除去、消除或灭活酶制剂、细胞裂解物和/或反应混合物中的这些天然酶活性或其他不需要的酶活性是有利的。
可从宿主细胞的基因组中热灭活、缺失或物理除去的酶的实例包括但不限于核酸酶(例如，RNA酶III、RNA酶I、RNA酶R、核酸酶P1、PNPase、RNA酶II和RNA酶T)、磷酸酶(例如，核苷一磷酸酶、核苷二磷酸酶、核苷三磷酸酶)以及使RNA解聚或使核苷酸去磷酸化的其他酶。使RNA解聚的酶包括能够裂解、部分水解或完全水解RNA分子的任何酶。
使酶灭活的技术的实例包括条件方法。在一些实施方案中，酶制剂、细胞裂解物和/或反应混合物包含表现出不需要的活性的被选择性灭活的酶。在一些实施方案中，通过将酶暴露于消除条件(例如，高温或低温、酸性或碱性pH值、高盐或低盐、洗涤剂和/或有机溶剂)来选择性地灭活表现出不需要的活性的酶。在一些实施方案中，通过沉淀或色谱法来消除不合乎需要的酶活性。
“热灭活”是指将无细胞反应混合物加热至足以灭活(或至少部分灭活)内源性核酸酶、磷酸酶或其他酶的温度的过程。通常，热灭活过程涉及有害酶的变性(解折叠)。内源性细胞蛋白质变性的温度因生物体而异。例如，在大肠杆菌中，内源性细胞酶通常在41℃以上的温度下变性。对于其他生物体，变性温度可高于或低于41℃。如此处提供的反应混合物的酶可在55℃-95℃或更高的温度下热灭活。在一些实施方案中，反应混合物的酶可在55℃-90℃、55℃-80℃、55℃-70℃、55℃-60℃、60℃-95℃、60℃-90℃、60℃-80℃、60℃-70℃、70℃-95℃、70℃-90℃或70℃-80℃的温度下热灭活。例如，无细胞反应混合物中的酶可在55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃的温度下热灭活。在一些实施方案中，无细胞反应混合物的酶可在55℃-95℃的温度下热灭活。在一些实施方案中，无细胞反应混合物的酶可在70℃的温度下热灭活。在一些实施方案中，无细胞反应混合物的酶可在60℃的温度下热灭活。还有可能引入有害酶的化学抑制剂。此类抑制剂可包括但不限于原钒酸钠(蛋白质磷酸酪氨酰磷酸酶的抑制剂)、氟化钠(磷酸丝氨酰和磷酸苏氨酰磷酸酶的抑制剂)、焦磷酸钠(磷酸酶抑制剂)、磷酸钠和/或磷酸钾。
将无细胞反应混合物在升高的温度下孵育以实现不需要的酶的热灭活的时间段可变化，这取决于例如无细胞反应混合物的体积和由其制备生物质的生物体。在一些实施方案中，将无细胞反应混合物在55℃-99℃的温度下孵育0.5分钟(min)至24小时(hr)。例如，可将无细胞反应混合物在55℃-99℃的温度下孵育0.5分钟、1分钟、2分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟或1小时。在一些实施方案中，将无细胞反应混合物在55℃-99℃的温度下孵育30分钟，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、36、42或48小时。
在一些实施方案中，使酶在60℃-80℃的温度下热灭活10-20分钟。在一些实施方案中，使酶在70℃的温度下热灭活15分钟。
在一些实施方案中，使内源性RNA解聚的酶包含一种或多种使酶对热更敏感的修饰(例如，突变)。这些酶被称为“热敏酶”。热敏酶在低于其野生型对应物的温度下变性并变得灭活，和/或降低热敏酶活性所需的时间段比其野生型对应物短。
应理解，热灭活的酶在一些情况下可保持一定程度的活性。例如，热灭活酶的活性水平可以是未热灭活的相同酶的活性水平的小于50％。在一些实施方案中，热灭活酶的活性水平是未热灭活的相同酶的活性水平的小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％或小于0.1％。
因此，可完全消除或降低酶的活性。如果酶的变性(热灭活)形式不再催化由其天然形式的酶催化的反应，则认为酶完全灭活。当热灭活酶的活性相对于未加热(例如，在其天然环境中)的酶的活性降低至少50％时，热灭活、变性的酶被认为是“灭活的”。在一些实施方案中，热灭活酶的活性相对于未加热的酶的活性降低50％-100％。例如，热灭活酶的活性相对于未加热的酶的活性降低50％-90％、50％-85％、50％-80％、50％-75％、50％-70％、50％-65％、50％-60％或50％-55％。在一些实施方案中，热灭活酶的活性相对于未加热的酶的活性降低25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％。
在一些实施方案中，将反应混合物暴露于使表现出不需要的活性的酶暂时或不可逆地灭活的酸或碱(pH的变化)。“酸或碱灭活”是指将反应混合物调节至足以使不需要的酶灭活(或至少部分灭活)的pH的过程。通常，酸或碱灭活的过程涉及酶的变性(解折叠)。酶变性的pH因生物体而异。在大肠杆菌中，例如，天然酶通常在高于7.5或低于6.5的pH下变性。变性pH可高于或低于其他生物体的变性pH。如本文所提供的，反应混合物的酶可在7.5-14或更高的pH下碱灭活。在一些实施方案中，无细胞反应混合物的酶在8-14、8.5-14、9-14、9.5-14、10-14、10.5-14、11-14、11.5-14、12-14、12.5-14、13-14或13.5-14的pH下碱灭活。在一些实施方案中，无细胞反应混合物的酶在7.5-13.5、7.5-13、7.5-12.5、7.5-12、7.5-11.5、7.5-11、7.5-10.5、7.5-10、7.5-9.5、7.5-9、7.5-8.5或7.5-8的pH下碱灭活。例如，无细胞反应混合物的酶可在大约7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5或14的pH下碱灭活。如本文所提供的，无细胞反应混合物的酶可在6.5-0或更低的pH下酸灭活。在一些实施方案中，无细胞反应混合物的酶在6.5-0.5、6.5-1、6.5-1.5、6.5-2、6.5-2.5、6.5-3、6.5-3.5、6.5-4、6.5-4.5、6.5-5或6.5-6的pH下酸灭活。在一些实施方案中，无细胞反应混合物的酶在6-0、5.5-0、5-0、4.5-0、4-0、3.5-0、3-0、2.5-0、2-0、1.5-0、1-0或0.5-0的pH下酸灭活。例如，无细胞反应混合物的酶可在大约6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5或0的pH下酸灭活。
在一些实施方案中，将无细胞反应混合物暴露于使表现出不需要的活性的酶暂时或不可逆地灭活的高盐或低盐(盐浓度的变化)。“盐灭活”是指将酶制剂、细胞裂解物和/或无细胞反应混合物调节至足以使酶灭活(或部分灭活)的盐浓度的过程。通常，盐灭活过程涉及酶的变性(解折叠)。酶变性的盐浓度因生物体而异。在大肠杆菌中，例如，天然酶通常在高于600mM的盐浓度下变性。变性盐浓度可高于或低于其他生物体的变性盐浓度。盐是阴离子和阳离子的组合。可用于如本文所述的无细胞反应混合物中不需要的酶活性的盐灭活的阳离子的非限制性实例包括锂、钠、钾、镁、钙和铵。可用于如本文所述的无细胞反应混合物中不需要的酶活性的盐灭活的阴离子的非限制性实例包括乙酸盐、氯化物、硫酸盐和磷酸盐。如本文所提供的，无细胞反应混合物的酶可在600-1000mM或更高的盐浓度下盐灭活。在一些实施方案中，酶制剂、细胞裂解物和/或无细胞反应混合物的酶可在700-1000mM、750-1000mM、800-1000mM、850-1000mM、900-1000mM、950-1000mM的盐浓度下盐灭活。在一些实施方案中，酶制剂、细胞裂解物和/或无细胞反应混合物的酶可在600-950mM、600-900mM、600-850mM、600-800mM、600-750mM、600-700mM或600-650mM的盐浓度下盐灭活。例如，酶制剂、细胞裂解物和/或无细胞反应混合物的酶可在大约600mM、650mM、700mM、750mM、800mM、850mM、900mM、950mM或1000mM的盐浓度下盐灭活。如本文提供的酶制剂、细胞裂解物和/或无细胞反应混合物的酶可在400-1mM或更低的盐浓度下盐灭活。在一些实施方案中，酶制剂、细胞裂解物和/或无细胞反应混合物的酶可在350-1mM、300-1mM、250-1mM、200-1mM、150-1mM、100-1mM或50-1mM的盐浓度下盐灭活。在一些实施方案中，酶制剂、细胞裂解物和/或无细胞反应混合物的酶在400-50mM、400-100mM、400-150mM、400-200mM、400-250mM、400-300mM或400-350mM的盐浓度下盐灭活。例如，酶制剂、细胞裂解物和/或无细胞反应混合物的酶可在大约400mM、350mM、300mM、250mM、200mM、150mM、100mM、50mM或1mM的盐浓度下盐灭活。
在一些实施方案中，将有机溶剂添加至酶制剂、细胞裂解物和/或反应混合物中以使表现出不需要的活性的酶灭活。有机溶剂的非限制性实例包括乙醇、甲醇、乙醚、二噁烷、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、二甲亚砜和甲苯。
在一些实施方案中，将洗涤剂添加至酶制剂、细胞裂解物和/或反应混合物以使表现出不需要的活性的酶灭活。洗涤剂的非限制性实例包括十二烷基硫酸钠(SDS)、乙基三甲基溴化铵(ETMAB)、月桂基三甲基溴化铵(LTAB)和月桂基三甲基氯化铵(LTAC)。
在一些实施方案中，将化学抑制剂添加至酶制剂、细胞裂解物和/或反应混合物以使表现出不需要的活性的酶灭活。化学抑制剂的非限制性实例包括于原钒酸钠(蛋白质磷酸酪氨酰磷酸酶的抑制剂)、氟化钠(磷酸丝氨酰和磷酸苏氨酰磷酸酶的抑制剂)、焦磷酸钠(磷酸酶抑制剂)、磷酸钠和/或磷酸钾。在一些实施方案中，化学抑制剂选自化学抑制剂文库。
对于本文使用的任何条件方法，应理解也可使存在于细胞裂解物或无细胞反应混合物中的任何途径酶暴露于消除条件(例如，高温或低温、酸性或碱性pH值、高盐或低盐、洗涤剂和/或有机溶剂)。因此，在一些实施方案中，途径酶(例如，聚磷酸盐激酶、NMP激酶、NDP激酶和/或聚合酶)可耐受消除条件。如果酶在暴露于消除条件后保留至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)的其酶活性(相对于暴露于灭活条件之前的酶活性)，则所述酶被认为耐受消除条件。
例如，当酶制剂、细胞裂解物和/或无细胞反应混合物的天然酶被热灭活时(例如，暴露于至少55℃或55℃-95℃的温度下至少30秒或30秒-60分钟)，途径酶可以是热稳定酶。因此，在一些实施方案中，聚磷酸盐激酶、NMP激酶、NDP激酶、核苷激酶、磷酸核糖基转移酶、核苷磷酸化酶、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶和聚合酶中的至少一者是其热稳定变体。如果酶(例如，激酶或聚合酶)(a)在暂时暴露于使天然酶变性的高温(即42℃)后仍保持活性或(b)在暂时暴露于其中天然酶以低速率起作用的中至高温后以高速率起作用，则所述酶被认为是热稳定的。热稳定酶是已知的，并且本文提供了用于使用的热稳定酶的非限制性实例。本文还提供了能够耐受消除条件的途径酶的其他非限制性实例。在一些实施方案中，从反应混合物中物理除去表现出不需要的活性的天然酶。在一些实施方案中，从无细胞反应混合物中沉淀出表现出不需要的活性的酶。在一些实施方案中，从反应混合物中过滤出(例如，基于大小)表现出不需要的活性的酶。在一些实施方案中，通过捕获和/或色谱法(例如，通过对固定相的不同亲和性)从反应混合物中除去表现出不需要的活性的酶。在一些实施方案中，通过亲和色谱法从反应混合物中除去表现出不需要的活性的酶。亲和色谱法的实例包括但不限于蛋白A色谱法、蛋白G色谱法、金属结合色谱法(例如镍色谱法)、凝集素色谱法和GST色谱法。在一些实施方案中，通过离子交换色谱法从反应混合物中除去表现出不需要的活性的酶。阴离子交换色谱法(AEX)的实例包括但不限于二乙基氨基乙基(DEAE)色谱法、四级氨基乙基(QAE)色谱法和季胺(Q)色谱法。阳离子交换色谱法的实例包括但不限于羧甲基(CM)色谱法、磺乙基(SE)色谱法、磺丙基(SP)色谱法、磷酸盐(P)色谱法和磺酸盐(S)色谱法。在一些实施方案中，通过疏水相互作用色谱法(HIC)从反应混合物中除去表现出不需要的活性的酶。疏水相互作用色谱法的实例包括但不限于苯基琼脂糖色谱法、丁基琼脂糖色谱法、辛基琼脂糖色谱法、Capto苯基色谱法、Toyopearl丁基色谱法、Toyopearl苯基色谱法、Toyopearl己基色谱法、Toyopearl醚色谱法和Toyopearl PPG色谱法。上面详述的任何化学物质都可以替代地用于固定或捕获途径酶。
来自桔青霉的核酸酶P1(一种锌依赖性酶)水解RNA和热变性DNA中的3’-5’-磷酸二酯键以及由3’-磷酸终止的单核苷酸和寡核苷酸中的3’-磷酸单酯键，无碱基特异性。核酸酶P1能够将单链DNA和RNA完全水解至核糖核苷5’-一磷酸的水平。
大肠杆菌RNA酶I定位于完整细菌细胞中的周质空间，并且催化多种RNA分子(包括rRNA、mRNA和tRNA)的解聚。在生理条件下，这种酶的周质定位意味着所述酶对细胞内RNA稳定性的影响很小；然而，细菌细胞裂解物中周质和细胞质的混合允许RNA酶I进入细胞RNA。细胞裂解物中RNA酶I的存在通过RNA降解降低合成RNA的产率。RNA酶I和编码RNA酶I的基因rna两者都不是细胞活力所必需的，因此，在一些实施方案中，rna在工程化的宿主细胞中缺失或突变。在其他实施方案中，反应混合物中的RNA酶I在内源性RNA解聚后热灭活。
大肠杆菌RNA酶R和RNA酶T催化dsRNA、rRNA、tRNA和mRNA以及小的非结构化RNA分子的解聚。所述酶和分别编码所述酶的基因rnr和rnt都不是细菌细胞活力所必需的，因此，在一些实施方案中，rnr和/或rnt在工程化的宿主细胞(例如，大肠杆菌宿主细胞)中缺失或突变。在其他实施方案中，无细胞反应混合物中的RNA酶R和/或RNA酶T可在内源性RNA解聚后热灭活。
大肠杆菌RNA酶E和PNPase是降解体的组分，其负责细胞中的mRNA转换。RNA酶E被认为与PNPase和RNA酶II一起起作用以转换细胞mRNA库。编码RNA酶E的基因rne的破坏在大肠杆菌中是致命的。因此，在一些实施方案中，无细胞反应混合物中的RNA酶E可在内源性RNA解聚后热灭活。PNPase和编码PNPase的基因pnp都不是细胞活力所必需的，因此，在一些实施方案中，pnp可在工程化的宿主细胞(例如，大肠杆菌宿主细胞)中缺失或突变。在其他实施方案中，反应混合物中的PNPase在内源性RNA解聚后热灭活。
大肠杆菌RNA酶II在3’至5’方向上解聚mRNA和tRNA。RNA酶II和编码RNA酶II的基因rnb都不是细胞活力所必需的，因此，在一些实施方案中，rnb在工程化的宿主细胞中缺失或突变。在其他实施方案中，反应混合物中的RNA酶II在内源性RNA解聚后热灭活。
虽然pnp和rnb都不是宿主细胞存活所必需的，但同时破坏两者可能是致命的。因此，在一些实施方案中，PNPase和RNA酶II两者都被热灭活。
核苷一磷酸或核苷二磷酸磷酸化为核苷三磷酸
在细胞RNA转化为其组成单体后，并且在消除或灭活使RNA解聚的核酸酶和不需要的酶活性后，所得的核苷一磷酸(NMP)或核苷二磷酸(NDP)在它们聚合以形成所需的合成RNA(如单链mRNA)之前被磷酸化。此过程依赖于能量，并且因此需要能量源，通常是高能磷酸源，例如磷酸烯醇丙酮酸、ATP或聚磷酸盐。
在一些实施方案中，能量源是直接添加至细胞裂解物的ATP。在其他实施方案中，使用ATP再生系统提供能量源。例如，聚磷酸盐和聚磷酸盐激酶可用于产生ATP。其他实例包括使用乙酰磷酸和乙酸激酶来产生ATP；磷酸肌酸和肌酸激酶来产生ATP；以及磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶来产生ATP。可使用其他ATP(或其他能量)再生系统。在一些实施方案中，将能量源的至少一种组分添加至细胞裂解物、细胞裂解物混合物或无细胞反应混合物。能量源的“组分”包括产生能量(例如，ATP)所需的底物和酶。这些组分的非限制性实例包括聚磷酸盐与聚磷酸盐激酶、乙酰磷酸与乙酸激酶、磷酸肌酸与肌酸激酶以及磷酸烯醇丙酮酸与丙酮酸激酶。在一些实施方案中，聚磷酸盐激酶是地热奇异球菌(Deinococcusgeothermalis)聚磷酸盐激酶2(DgPPK2)。在一些实施方案中，聚磷酸盐激酶是SEQ ID NO:1中表示的激酶。
激酶是催化磷酸基团从高能、提供磷酸的分子(如ATP)转移至特定底物/分子的酶。此过程被称为磷酸化，其中底物获得由高能ATP分子提供的磷酸基团。这种酯交换产生磷酸化底物和ADP。在一些实施方案中，本公开的激酶将NMP转化为NDP并将NDP转化为NTP。核苷酸特异性(AMP、GMP、CMP、UMP)和泛特异性(NDP)转移酶都被考虑用于本发明。
在一些实施方案中，激酶是核苷一磷酸激酶，其催化高能磷酸从ATP转移至NMP，从而产生ADP和NDP。在一些实施方案中，细胞裂解物包含以下四种核苷一磷酸激酶中的一者或多者(或全部)：尿苷酸激酶、胞苷酸激酶、鸟苷酸激酶和腺苷酸激酶。示例性核苷一磷酸激酶列于表2-5中。本公开涵盖酶的热稳定变体。在一些实施方案中，核苷一磷酸激酶中的一者或多者是热稳定的。在一个优选的实施方案中，所有核苷一磷酸激酶都是热稳定的。在一些实施方案中，热稳定激酶在用于任何NTP或RNA产生反应之前热灭活它们的不合乎需要的活性。在一些实施方案中，尿苷酸激酶来自或源自强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)。在一些实施方案中，尿苷酸激酶是SEQ ID NO:14中表示的激酶。在一些实施方案中，胞苷酸激酶来自或源自嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)。在一些实施方案中，胞苷酸激酶是SEQ ID NO:13中表示的激酶。在一些实施方案中，鸟苷酸激酶来自或源自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)。在一些实施方案中，鸟苷酸激酶是SEQ ID NO:15中表示的激酶。在一些实施方案中，腺苷酸激酶来自嗜热栖热菌。在一些实施方案中，腺苷酸激酶是SEQ IDNO:12中表示的激酶。
表2.AMP激酶的实例
Figure BDA0003356710250000511
Figure BDA0003356710250000521
表3.CMP激酶的实例
Figure BDA0003356710250000522
Figure BDA0003356710250000531
表4.UMP激酶的实例
Figure BDA0003356710250000532
Figure BDA0003356710250000541
表5.GMP激酶的实例
Figure BDA0003356710250000542
Figure BDA0003356710250000551
在一些实施方案中，激酶是核苷二磷酸激酶，其将磷酰基转移至NDP，从而产生NTP。磷酰基的供体可以是但不限于ATP、聚磷酸盐聚合物或磷酸烯醇丙酮酸。将NDP转化为NTP的激酶的非限制性实例包括核苷二磷酸激酶、聚磷酸盐激酶和丙酮酸激酶。本公开涵盖了前述酶的热稳定变体。在一些实施方案中，NDP激酶是从风产液菌(Aquifex aeolicus)获得的。
在一些实施方案中，NMP磷酸化为NTP通过聚磷酸盐依赖性激酶途径发生，其中高能磷酸盐通过聚磷酸盐激酶(PPK)从聚磷酸盐转移至ADP。在一些实施方案中，聚磷酸盐激酶属于聚磷酸盐激酶1(PPK1)家族，其将高能磷酸从聚磷酸盐转移至ADP以形成ATP。此ATP随后被NMP激酶用于将NMP转化为它们的同源核糖核苷酸二磷酸(NDP)。NMP激酶包括但不限于AMP激酶、UMP激酶、GMP激酶和/或CMP激酶。此外，ATP随后被核苷酸二磷酸激酶用于将NDP转化为NTP。在一些实施方案中，本文公开的方法中使用的聚磷酸盐激酶是聚磷酸盐激酶2(PPK2)家族激酶。在一些特定实施方案中，聚磷酸盐激酶属于I类PPK2家族，其将高能磷酸从聚磷酸盐转移至NDP以形成NTP。通过所述系统产生的ATP用作高能磷酸供体，以将NMP转化为NDP。在一些特定实施方案中，聚磷酸盐激酶属于III类PPK2家族，其将高能磷酸从聚磷酸盐转移至NMP和NDP以形成NTP。在一些实施方案中，单独使用III类PPK2以从NMP产生NTP。在其他实施方案中。III类PPK2与其他激酶组合使用。III类PPK2从ADP、AMP和聚磷酸盐产生ATP，ATP随后被NMP和NDP激酶用于将NMP转化为NTP。示例性聚磷酸盐激酶列于表6中。
表6.聚磷酸盐激酶
Figure BDA0003356710250000561
Figure BDA0003356710250000571
在一些实施方案中，CMP、UMP、GMP、NDP和PPK激酶中的一些或全部在反应后被热灭活。在其他实施方案中，本文提供的无细胞反应混合物中使用的PPK2酶可以是热稳定的。例如，PPK2酶可以是热稳定的III类PPK2酶，其相对于聚磷酸盐聚合有利于ATP合成，并将ADP和AMP两者转化为ATP。在一些实施方案中，聚磷酸盐激酶是来自或源自地热奇异球菌的III类PPK2酶。在一些实施方案中，聚磷酸盐激酶是SEQ ID NO:1中表示的激酶。在一些实施方案中，PPK2酶用于以例如10至800mM/小时(例如，10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800mM/小时)范围内的速率将聚磷酸盐(如六偏磷酸盐)转化为ATP。
本公开还涵盖融合酶。融合酶可表现出多种活性，每种活性对应于不同酶的活性。例如，不是使用独立的核苷一磷酸激酶和独立的核苷二磷酸激酶，而是可使用具有核苷一磷酸激酶活性和核苷二磷酸激酶活性的融合酶(或任何其他酶)。
应理解，本公开还体现了本文所述的任何一种或多种酶以及所述酶的变体(例如，“PPK2变体”)的用途。变体酶可与参考酶具有一定程度的序列同一性。术语“同一性”是指如通过比较序列所确定，两个或更多个多肽或多核苷酸的序列之间的关系。同一性量度通过特定数学模型或计算机程序(例如“算法”)解决的具有空位比对(如果存在)的两个或更多个序列之间较小者的相同匹配的百分比。相关分子的同一性可通过已知方法容易地计算。“同一性百分比(％)”在它适用于氨基酸或核酸序列时定义为在将序列对准以及必要时引入空位以实现最大同一性百分比之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基相同的残基(氨基酸残基或核酸残基)的百分比。同一性取决于百分比同一性的计算，但由于引入计算中的空位和罚分可能得到不同的值。特定序列的变体可与所述特定参考序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％序列同一性，如通过本文所述以及为本领域技术人员所知的序列比对程序和参数所确定。
两个序列之间的序列的比较和同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。用于确定同一性的技术编写在公众可获得的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包(Devereu等人,1984,Nucleic Acids Research1:387,1984)、BLAST套件(Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389)和FASTA(Altschul等人,1990,J.Molec.Biol.215:403,1990)。其他技术包括：史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法(Smith等人,1981,J.Mol.Biol.147:195；尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman,S.B.等人,1970,J.Mol.Biol.48:443；以及快速最优整体序列比对算法(FOGSAA)(Chakraborty等人,2013,Sci Rep.3:1746,2013)。
DNA模板
在一些实施方案中，反应包含编码将根据本文公开的方法产生的mRNA的DNA模板。编码mRNA的DNA模板可源自工程化的细胞(例如在质粒上或整合在基因组DNA内)或通过聚合酶链反应(PCR)产生。在一些实施方案中，在RNA的生物合成期间(例如，在热灭活步骤之后)将DNA模板添加至无细胞反应混合物。在一些实施方案中，细胞裂解物中的DNA模板浓度是0.005-1.0g/L。在一些实施方案中，细胞裂解物中的DNA模板浓度是0.005g/L、0.01g/L、0.1g/L、0.5g/L或1.0g/L。
DNA模板包括启动子，任选地诱导型启动子。DNA模板还包含与启动子可操作连接的编码所需RNA产物(开放阅读框，或ORF)的核苷酸序列。任选地，DNA模板包含转录终止子。
启动子或终止子可以是天然存在的序列或工程化的序列。在一些实施方案中，启动子是天然存在的序列。在其他实施方案中，启动子是工程化的序列。在一些实施方案中，将启动子工程化以增强转录活性。在一些实施方案中，终止子是天然存在的序列。在其他实施方案中，终止子是工程化的序列。在一些情况下，可将DNA模板工程化以具有选择性地促进mRNA转录的转录启动子。
mRNA可在编码序列的一侧或两侧上含有非翻译区(UTR)。如果位于5’侧上，则将其称为5’UTR(或前导序列)，或者如果位于3’侧上，则将其称为3’UTR(或尾随序列)。UTR可具有多种生物学功能，不限于本文所述的功能。5’UTR可形成调控翻译的二级结构，并且在一些情况下本身可被翻译。5’UTR有利地包含由核糖体识别的序列，所述序列允许核糖体结合并起始mRNA的翻译。一些5’UTR已被发现与蛋白质相互作用。一些5’UTR序列与mRNA定位和输出信号以及细胞机制有关。信使RNA的3’-非翻译区(3’UTR)的序列和结构可控制它们的稳定性、定位和表达。3’UTR调控元件由多种反式作用因子识别，所述因子包括微小RNA(miRNA)、其相关机制和RNA结合蛋白(RBP)。进而，这些因子激发共同的机制策略来执行由3’UTR编码的调控程序。
在一些实施方案中，5’UTR可包含位于5’UTR的5’端的初始转录序列(ITS)，其提高转录起始的效率以使来自转录反应(例如，无细胞反应)的RNA产物产率最大化。ITS是约6至15个核苷酸的短序列。当存在时，ITS在转录的早期阶段(起始和通过启动子清除转变至延伸阶段)具有关键作用，并且影响由给定启动子转录的总体速率和产率。在一些实施方案中，ITS是天然存在的ITS，例如在T7 III类启动子下游发现的共有ITS。在一些实施方案中，共有T7 III类启动子ITS的长度是6个核苷酸(GGGAGA)。在一些实施方案中，ITS是合成ITS，例如，GGGAGACCAGGAATT(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，ITS是合成ITS，例如GGGAGACCAGGAATT(SEQ ID NO:17)的6至15个核苷酸(“截短的ITS”)。
在一些实施方案中，由DNA模板编码的转录RNA含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。UTR可策略性地或经验性地与mRNA编码序列匹配，以优化mRNA的翻译水平和加工；换句话说，它们是mRNA的模块化组分。DNA模板可含有编码mRNA 5’UTR序列、mRNA 3’UTR序列、两者都不的DNA，或者两者都位于编码mRNA的开放阅读框的DNA的侧翼。这些方法中使用的UTR序列可来自多种物种和基因，并且如果5’和3’序列两者都存在，则所述两者不必来自同一物种或基因。UTR序列可被工程化为含有特定二级结构、结合位点或其他元件。可用于本发明方法中的UTR包括但不限于表7中所列的UTR。
表7.UTR的实例
Figure BDA0003356710250000601
本公开考虑了编码在所得mRNA的3’端的mRNA的聚腺苷酸“尾”序列的DNA模板。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾的长度介于50与250个核苷酸之间。本公开还考虑了不编码聚腺苷酸尾的DNA模板。任选地，DNA模板编码聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号由聚腺苷酸化聚合酶读取。任选地，DNA模板编码在所得mRNA的3’端的核酶序列，以使得所述核酶位于聚腺苷酸尾的3’。
在一些实施方案中，DNA模板是线性的。DNA模板可通过聚合酶链反应产生。DNA模板可包含在盒或质粒中，包括环状质粒、线性化环状质粒或线性质粒。所使用的质粒可以是本领域已知的任何质粒，包括但不限于具有高拷贝或中拷贝复制起点的pUC家族或pET家族。
DNA模板可含有限制性核酸内切酶(也称为限制性酶)裂解位点。DNA模板含有针对其的位点的限制性核酸内切酶可以是IIS型品种限制性核酸内切酶。在一些实施方案中，限制酶以钝方式切割或产生5’突出端。在一些实施方案中，限制性核酸内切酶在没有3’突出端的情况下切割以避免T7聚合酶的不需要的转录活性。在一些实施方案中，限制性核酸内切酶对裂解位点的5’端没有序列要求。在一些实施方案中，限制性核酸内切酶位点被定位成使得限制性酶在产生聚腺苷酸尾的序列之后裂解。在一些实施方案中，限制性核酸内切酶位点被定位成使得限制性酶在产生聚腺苷酸尾的序列之后裂解，在最后一个腺嘌呤碱基之后没有添加额外的核苷酸。在具有包含限制性核酸内切酶位点的环状质粒的实施方案中，可用相应的限制性核酸内切酶处理环状质粒以使其线性化。在一些实施方案中，限制酶由培养中的细胞产生。在一些实施方案中，限制性核酸内切酶由源自产生限制性核酸内切酶的细胞的细胞裂解物制备。在一些实施方案中，质粒DNA和限制性核酸内切酶在使得DNA模板线性化的条件下一起孵育。在一些实施方案中，在线性化之前或之后纯化质粒DNA和/或限制性核酸内切酶。环状质粒可包含转录终止子序列。尽管可使用其他模板形式(例如，通过聚合酶链反应(PCR)、化学合成或本领域已知的其他方式产生的线性DNA模板)，但通常在载体(如质粒)上提供DNA模板。
在一些实施方案中，在反应混合物中使用多于一种DNA模板。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4或5种不同的DNA模板。在一些实施方案中，在单个模板中编码多于一个mRNA序列。
在一些实施方案中，在聚合步骤之前用热灭活步骤处理含有DNA模板的裂解物。
核苷三磷酸聚合成核糖核酸
在如上所述产生NTP并提供一个或多个DNA模板之后，通过使用例如DNA依赖性RNA聚合酶将NTP聚合成RNA(例如ssRNA)来实现mRNA的生物合成。在所述方法的此步骤中，将DNA模板转录成目标RNA。
可在PPK存在下使用纯化的AMP或ADP加磷酸供体产生ATP。在另一方面，可在PPK存在下使用源自细胞RNA的AMP或ADP和磷酸供体产生ATP。
类似地，可将GTP直接添加至反应中，或者可在一种或多种激酶存在下，使用纯化的GMP或GDP加磷酸供体来产生GTP。在又一方面，可在一种或多种激酶存在下由源自细胞RNA的GMP或GDP和磷酸供体产生GTP。
RNA聚合需要NTP、包含转录启动子的DNA模板以及识别并转录启动子由转录启动子开始转录的聚合酶(RNA聚合酶)。通常，如本文提供的使用的聚合酶是对其同源转录启动子具有高度选择性、具有高保真度并且高效的单亚基聚合酶。此类聚合酶的实例包括但不限于T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。噬菌体T7 RNA聚合酶是对T7噬菌体启动子具有高度特异性的DNA依赖性RNA聚合酶。这种99kD酶在T7启动子的控制下催化由DNA模板合成RNA。噬菌体T3 RNA聚合酶是对T3噬菌体启动子具有高度特异性的DNA依赖性RNA聚合酶。这种99kD酶在T3启动子的控制下催化由DNA模板合成RNA。噬菌体SP6 RNA聚合酶是对SP6噬菌体启动子具有高度特异性的DNA依赖性RNA聚合酶。98.5kD聚合酶在SP6启动子的控制下催化由DNA模板合成RNA。T7、T3和SP6聚合酶中的每一者在37℃-40℃下具有最佳活性。在一些实施例中，使用T7、T3和SP6聚合酶的热稳定变体。热稳定变体聚合酶通常在高于40℃(或约40℃-60℃)的温度下具有最佳活性。在一些实施方案中，聚合酶不是热稳定的。在一些实施方案中，使用T7聚合酶。在一些实施方案中，用于方法中的T7聚合酶在用于聚合反应中之前通过沉淀和离心进行纯化或部分纯化。在一些实施方案中，通过沉淀和离心纯化或部分纯化的T7聚合酶在用于聚合反应中之前通过色谱法进一步纯化或部分纯化。
表8.聚合酶的实例
Figure BDA0003356710250000631
如本文所公开的，“使得核苷三磷酸产生和所述核苷三磷酸聚合的条件”，也称为“RNA生物合成的条件”可由本领域普通技术人员确定，将例如聚合酶活性的最佳条件(包括pH、温度、时间长度和细胞裂解物的盐浓度)以及任何外源辅因子考虑在内。
在RNA生物合成期间，无细胞反应混合物的pH可具有3.0至8.0的值。在一些实施方案中，无细胞反应混合物的pH值是3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、3-7、4-7、5-7、6-7、3-6、4-6、5-6、3-5、3-4或4-5。在一些实施方案中，无细胞反应混合物的pH值是3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。在有利的实施方案中，在RNA生物合成期间无细胞反应混合物的pH值是7.0至7.5。
在RNA生物合成期间无细胞反应混合物的温度可以是15℃至95℃。在一些实施方案中，RNA生物合成期间无细胞反应混合物的温度是30℃-60℃、30℃-50℃、40℃-60℃、40℃-50℃、50℃-70℃、50℃-60℃。在一些实施方案中，在RNA生物合成期间无细胞反应混合物的温度是30℃、32℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃。在有利的实施方案中，在RNA生物合成期间无细胞反应混合物的温度是37℃-55℃。
在RNA生物合成期间无细胞反应混合物可孵育15分钟(min)至72小时(hr)。在一些实施方案中，在RNA生物合成期间无细胞反应混合物孵育30分钟-48小时。例如，在RNA生物合成期间无细胞反应混合物可孵育30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时。在一些有利的实施方案中，在RNA生物合成期间无细胞反应混合物孵育1-4小时。
一些聚合酶活性可能需要金属离子的存在。因此，在一些实施方案中，将金属离子添加至细胞裂解物。金属离子的非限制性实例包括Mg2+、Li+、Na+、K+、Ni2+、Ca2+、Cu2+和Mn2+。可使用其他金属离子。在一些实施方案中，可使用多于一种金属离子。细胞裂解物中金属离子的浓度可以是0.1mM至100mM，或10mM至50mM。在一些实施方案中，细胞裂解物中金属离子的浓度是0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100mM。Mg2+i是反应中优选的金属离子。
热稳定酶
本公开的无细胞RNA生物合成方法的一个优点是例如将内源性RNA转化为合成mRNA所需的所有酶可(但不必)在单个工程化细胞中表达。例如，将工程化细胞的克隆群体培养至所需的细胞密度，将细胞裂解，在使得内源性RNA解聚为其单体形式的条件下(例如，在55℃-99℃的温度下)孵育，经受足以使内源性核酸酶和磷酸酶灭活的温度(例如，55℃-99℃)，并在使得ssRNA聚合的条件(例如，55℃-99℃)下孵育。为了进行至终产物合成RNA，用于将NMP转化为NDP所需的酶(例如，核苷一磷酸激酶和/或聚磷酸盐激酶)、从NDP转化为NTP所需的酶(例如，核苷二磷酸激酶和/或聚磷酸盐激酶)以及从NTP转化为RNA所需的酶(例如，聚合酶)可以是热稳定的，以避免在内源性核酸酶(和/或外源性核酸酶)和磷酸酶的热灭活期间变性。热稳定性是指酶在相对高的温度下抵抗变性的性质。例如，如果酶在42℃的温度下变性(灭活)，则具有相似活性(例如，激酶活性)的酶如果在42℃下不变性，则被认为是“热稳定的”。
如果酶(例如，激酶或聚合酶)(a)在暂时暴露于使其他天然酶变性的高温后仍保持活性或(b)在暂时暴露于其中天然酶以低速率起作用的中至高温后以高速率起作用，则所述酶被认为是热稳定的。
在一些实施方案中，热稳定酶在暂时暴露于否则将使类似的(非热稳定的)天然酶变性的相对高的温度(例如，对于从大肠杆菌获得的激酶高于41℃，对于许多RNA聚合酶高于37℃)后保留大于50％的活性。在一些实施方案中，热稳定酶在暂时暴露于否则将使类似的(非热稳定的)天然酶变性的相对高的温度后保留50％-100％的活性。例如，热稳定酶可在暂时暴露于否则将使类似的(非热稳定的)天然酶变性的相对高的温度后保留50％-90％、50％-85％、50％-80％、50％-75％、50％-70％、50％-65％、50％-60％或50％-55％的活性。在一些实施方案中，热稳定酶在暂时暴露于否则将使类似的(非热稳定的)天然酶变性的相对高的温度后保留25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的活性。
在一些实施方案中，在暂时暴露于中至高温(例如，42℃-80℃)之后热稳定酶的活性大于类似的(非热稳定的)天然酶的活性(例如，大25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)。
例如，热稳定激酶的活性可通过激酶能够磷酸化的NMP或NDP的量来测量。因此，在一些实施方案中，热稳定激酶在相对高的温度(例如，42℃)下将大于50％的NMP转化为NDP，或大于50％的NDP转化为NTP，所需的时间量与在37℃下完成类似转化相同。在一些实施方案中，热稳定激酶在相对高的温度(例如，42℃)下将大于60％的NMP转化为NDP，或大于60％的NDP转化为NTP，所需的时间量与在37℃下完成类似转化相同。在一些实施方案中，热稳定激酶在相对高的温度(例如，42℃)下将大于70％的NMP转化为NDP，或大于70％的NDP转化为NTP，所需的时间量与在37℃下完成类似转化相同。在一些实施方案中，热稳定激酶在相对高的温度(例如，42℃)下将大于80％的NMP转化为NDP，或大于80％的NDP转化为NTP，所需的时间量与在37℃下完成类似转化相同。在一些实施方案中，热稳定激酶在相对高的温度(例如，42℃)下将大于90％的NMP转化为NDP，或大于90％的NDP转化为NTP，所需的时间量与在37℃下完成类似转化相同。
例如，基于保真度和聚合动力学(例如聚合速率)评估热稳定聚合酶的活性。因此，例如，一个单位的热稳定T7聚合酶可在37℃以上的温度(例如，50℃)下在30分钟内将10纳摩尔的NTP掺入酸不溶性材料中。
热稳定酶(例如，激酶或聚合酶)可在42℃至99℃或更高的温度下保持活性(能够催化反应)。在一些实施方案中，热稳定酶在42℃-95℃、42℃-90℃、42℃-85℃、42℃-80℃、42℃-70℃、42℃-60℃、42℃-50℃、50℃-80℃、50℃-70℃、50℃-60℃、60℃-80℃、60℃-70℃或70℃-80℃的温度下保持活性。例如，热稳定酶可在42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃或90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃的温度下保持活性。稳定酶可在相对高的温度下保持活性持续15分钟至48小时或更长时间。例如，热稳定酶可在相对高的温度下保持活性持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、36、42或48小时。
热稳定的RNA聚合酶可通过修饰野生型酶来制备。此类修饰(例如，突变)是已知的。例如，变体热稳定T7 RNA聚合酶可包含以下点突变中的一者或多者：V426L、A702V、V795I、S430P、F849I、S633I、F880Y、C510R和S767G(EP2377928和EP121619A1，其各自以引用的方式并入本文)。本公开涵盖其他变体和重组热稳定聚合酶。也可使用野生型T7 RNA聚合酶。
在一些实施方案中，热稳定的T7聚合酶用于产生mRNA。例如，具有1％-2％总蛋白质浓度的热稳定的T7聚合酶(例如，在40℃-60℃的温度下孵育)可用于以大于2g/L/hr(或者，例如，2g/L/hr-10g/L/hr)的速率合成mRNA。作为另一个实例，具有3％-5％总蛋白质浓度的热稳定的T7聚合酶(例如，在40℃-60℃的温度下孵育)可用于以大于10g/L/hr(或者，例如，10g/L/hr-20g/L/hr)的速率合成mRNA。
应理解，虽然本公开的许多实施方案描述了热稳定酶的使用，但也可使用其他酶。本文讨论的酶不需要是热稳定的，但是本公开包括所有讨论的酶的热稳定变体。在一些实施方案中，可将纯化的聚合酶外源添加至热灭活的细胞裂解物，例如，以补偿热稳定酶活性的任何降低或损失。
聚腺苷酸尾的酶促添加
在一些实施方案中，使用polyA聚合酶EC 2.7.7.19(也称为多核苷酸腺苷酰转移酶)酶促添加聚腺苷酸尾。这种酶使用RNA和ATP作为底物，并且催化A核苷酸添加至RNA的3’端。在一些实施方案中，在RNA合成之后，在RNA聚合酶已经例如通过热灭活而灭活之后，在单独的步骤中使用polyA聚合酶进行聚腺苷酸化。在一些实施方案中，polyA聚合酶在此阶段与腺苷一磷酸(AMP)和聚磷酸盐一起添加。在一些实施方案中，所添加的AMP已被纯化。在一些实施方案中，AMP作为NMP混合物的一部分或作为细胞裂解物提供。
工程化的细胞
本公开的工程化的细胞可包含生物合成RNA所需的酶活性中的至少一种、大部分或全部。“工程化的细胞”是包含至少一种工程话的(例如，重组或合成的)核酸或以其他方式进行修饰以使其在结构和/或功能上与其天然存在的对应物不同的细胞。因此，含有工程化核酸的细胞被认为是“工程化的细胞”。
在一些实施方案中，本公开的工程化的细胞包含RNA、使RNA解聚的酶、激酶和/或聚合酶。在一些实施方案中，工程化的细胞还包含DNA模板，所述DNA模板含有可操作地连接至编码mRNA的核苷酸序列的启动子。
在一些实施方案中，工程化的细胞表达选择性标记物。选择性标记物通常用于选择在转染细胞后(或在用于将外来核酸引入细胞中的其他程序后)已经吸收工程化核酸的工程化的细胞。因此，核酸编码产物也可编码选择性标记物。选择性标记物的实例包括但不限于增加或降低对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的编码蛋白质的基因(例如，氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、四环素抗性基因和氯霉素抗性基因)。选择性标记物的另外实例包括但不限于使细胞能够在缺乏其他必需营养素的培养基中生长的编码蛋白质的基因(营养缺陷型标记物)。根据本公开可使用其他选择性标记物。
如果由核酸(例如工程化核酸)编码的产物由细胞产生，则工程化的细胞“表达”所述产物。本领域中已知基因表达是指使用呈核酸形式的遗传指令来合成产物，如蛋白质(例如酶)的过程。
工程化的细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，工程化的细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其他类型的细胞。实例包括但不限于酵母、大肠杆菌或弧菌细胞。这些细胞可商业采购。这些细胞可使用标准高生产力方法在培养物中生长。
本公开的工程化的细菌细胞包括但不限于工程化的埃希氏菌属、链霉菌属、发酵单胞菌属、醋杆菌属、柠檬酸杆菌属、集胞藻属、根瘤菌属、梭菌属、棒杆菌属、链球菌属、黄单胞菌属、乳杆菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属、产碱杆菌属、假单胞菌属、气单胞菌属、固氮菌属、丛毛单胞菌属、分枝杆菌属、红球菌属、葡糖杆菌属、罗尔斯通菌属、硫杆菌属、小月菌属、地杆菌属、地芽孢杆菌属、节杆菌属、黄杆菌属、沙雷氏菌属、糖多孢菌属、栖热菌属、寡养单胞菌属、色杆菌属、中华根瘤菌属、糖多孢菌属、土壤杆菌属和泛菌属。
本公开的工程化的酵母细胞包括但不限于工程化的酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属和毕赤酵母属。
在一些实施方案中，本公开的工程化的细胞是工程化的大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、恶臭假单胞菌细胞、酿酒酵母细胞或短乳杆菌细胞。在一些实施方案中，本公开的工程化的细胞是工程化的大肠杆菌细胞。如本文所用，短语“来自”物种是指基因和基因产物在所述物种中天然编码和产生，并且所述术语意图涵盖从此类物种中分离和在异源物种中重组产生，尤其是细菌、酵母或其他重组宿主。
在一些实施方案中，本公开的无细胞RNA生物合成方法可(但不必)在单个工程化细胞中表达。例如，将工程化细胞的克隆群体培养至所需的细胞密度，将细胞裂解，在使得内源性RNA解聚为其单体形式的条件下(例如，在30℃-37℃的温度下)孵育，经受足以使内源性核酸酶和磷酸酶灭活的温度(例如，40℃-99℃)，并在使得ssRNA聚合的条件(例如，30℃-50℃)下孵育。为了进行至终产物合成RNA，用于将NMP转化为NDP所需的酶(例如，核苷一磷酸激酶和/或聚磷酸盐激酶)、从NDP转化为NTP所需的酶(例如，核苷二磷酸激酶和/或聚磷酸盐激酶)以及从NTP转化为RNA所需的酶(例如，聚合酶)可以是热稳定的，以避免在内源性核酸酶(和/或外源性核酸酶)和磷酸酶的热灭活期间变性。热稳定性是指酶在相对高的温度下抵抗变性的性质。例如，如果酶在42℃的温度下变性(灭活)，则具有相似活性(例如，激酶活性)的酶如果在42℃下不变性，则被认为是“热稳定的”。
工程化的核酸
“核酸”是至少两个共价连接在一起的核苷酸，并且在一些情况下，可含有磷酸二酯键(例如，磷酸二酯“主链”)。核酸(例如，核酸的组分或部分)可以是天然存在的或工程化的。“天然存在的”核酸存在于在没有人为干预的情况下存在于自然界中的细胞中。“工程化的核酸”包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”是指通过连接核酸分子(例如，来自相同物种或来自不同物种)构建并且通常可在活细胞中复制的分子。“合成核酸”是指生物合成、化学合成或通过其他方式合成或扩增的分子。合成核酸包括经化学修饰或以其他方式修饰但可与天然存在的核酸分子碱基配对的核酸。重组和合成核酸还包括由前述任一者的复制产生的那些分子。工程化的核酸可含有天然存在的核酸的部分，但总的来说，工程化的核酸不是天然存在的并且需要人为干预。在一些实施方案中，编码本公开的产物的核酸是重组核酸或合成核酸。在其他实施方案中，编码产物的核酸是天然存在的。
如本文提供的编码RNA的工程化的核酸可与“启动子”可操作地连接，所述启动子是核酸的控制区域，在所述控制区域控制核酸的剩余部分的起始和转录速率。启动子驱动其所调控的核酸的表达或转录。
启动子可以是与基因或序列天然缔合的启动子，如可通过分离位于给定基因或序列的编码片段上游的5’非编码序列而获得。这样的启动子可被称为“内源性的”。
在一些实施方案中，编码核酸序列可位于重组或异源启动子的控制下，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与编码序列缔合的启动子。此类启动子可包括其他基因的启动子；从任何其他细胞分离的启动子；和非“天然存在”的合成启动子或增强子，例如含有不同转录调控区的不同元件和/或通过本领域中已知的遗传工程化方法改变表达的突变的那些。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，还可使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括聚合酶链反应(PCR)产生序列。
当启动子关于其所调控的核酸处于正确的功能位置和取向以控制(“驱动”)所述核酸的转录起始和/或表达时，所述启动子被认为是“可操作地连接的”。
本公开的工程化的核酸可含有组成型启动子或诱导型启动子。“组成型启动子”是指在细胞中持续活性的启动子。“诱导型启动子”是指当在诱导物或诱导剂存在下、受诱导物或诱导剂影响或接触诱导物或诱导剂时起始或增强转录活性，或在不存在引起阻抑的因子时活化的启动子。根据本公开使用的诱导型启动子包括本文所述的或本领域普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于化学/生物化学调控和物理调控的启动子，如醇调控的启动子、四环素调控的启动子、类固醇调控的启动子、金属调控的启动子、发病机制调控的启动子、温度/热调控的启动子、磷酸盐调控的启动子(例如PhoA)和光调控的启动子。
诱导物或诱导剂可以是内源性或正常外源性条件(例如光)、化合物(例如化学或非化学化合物)或以在调控诱导型启动子的转录活性方面具有活性的方式接触诱导型启动子的蛋白质。因此，核酸的“调控转录的信号”是指作用于诱导型启动子的诱导物信号。调控转录的信号可活化或灭活转录，这取决于所使用的调控系统。转录的活化可涉及直接作用于启动子以驱动转录或通过灭活阻止启动子驱动转录的阻遏物间接作用于启动子。相反，转录的失活可涉及直接作用于启动子以阻止转录或通过活化然后作用于启动子的阻遏物间接作用于启动子。
可使用本领域已知的任何方式将工程化的核酸引入宿主细胞中，包括但不限于转化、转染(例如化学(例如磷酸钙、阳离子聚合物或脂质体)或非化学(例如电穿孔、声致穿孔、穿刺转染、光学转染、流体动力学转染))和转导(例如，病毒转导)。
由天然存在的细胞内核酸编码的酶或其他蛋白质可被称为“内源性酶”或“内源性蛋白质”。
细胞培养物和细胞裂解物
在许多实施方案中，培养工程化的细胞。“培养”是指使细胞在受控条件下(通常在其自然环境之外)生长的过程。例如，工程化的细胞(如工程化的细菌细胞)可在液体营养肉汤(也称为液体“培养基”)中作为细胞悬浮液生长。
常用的细菌大肠杆菌生长培养基的实例包括但不限于LB(溶原性肉汤)米勒(Miller)肉汤(1％NaCl)：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl；LB(溶原性肉汤)伦诺克斯(Lennox)肉汤(0.5％NaCl)；1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％NaCl；SOB培养基(超级最佳肉汤)：2％蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4；SOC培养基(具有分解代谢阻遏物的超级最佳肉汤)：SOB+20mM葡萄糖；2x YT肉汤(2x酵母提取物和胰蛋白胨)：1.6％蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％NaCl；TB(极品肉汤)培养基：1.2％蛋白胨、2.4％酵母提取物、72mM K2HPO4、17mM KH2PO44和0.4％甘油；以及SB(超级肉汤)培养基：3.2％蛋白胨、2％酵母提取物和0.5％NaCl和或Korz培养基(Korz,D J等人1995)。高密度细菌大肠杆菌生长培养基的实例包括但不限于DNAGroTM培养基、ProGroTM培养基、AutoXTM培养基、DetoXTM培养基、InduXTM培养基和SecProTM培养基。
在一些实施方案中，工程化的细胞在使得酶或核酸表达的条件下培养。此类培养条件可取决于所表达的特定产物和产物的所需量。
在一些实施方案中，工程化的细胞在30℃至40℃的温度下培养。例如，工程化的细胞可在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃的温度下培养。通常，工程化的细胞(如工程化的大肠杆菌细胞)在37℃的温度下培养。
在一些实施方案中，将工程化的细胞培养12小时至72小时或更长的时间段。例如，工程细胞可培养12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72小时的时间段。通常，将工程化的细胞(如工程化的细菌细胞)培养12至24小时的时间段。在一些实施方案中，工程化的细胞在37℃的温度下培养12至24小时。
在一些实施方案中，将工程化的细胞培养(例如，在液体细胞培养基中)至在600nm的波长下测量的光密度(OD600)为5至200。在一些实施方案中，将工程化的细胞培养至OD600为5、10、15、20、25、50、75、100、150或200。
在一些实施方案中，将工程化的细胞培养至1x108(OD<1)至2x1011(OD约200)个活细胞/ml细胞培养基的密度。在一些实施方案中，将工程化的细胞培养至1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011或2x1011个活细胞/ml的密度。(转换因子：OD 1＝8x108个细胞/ml)。
在一些实施方案中，工程化的细胞在生物反应器中培养。生物反应器仅指在其中培养细胞的容器，如培养瓶、培养皿或可一次性使用(一次性)、可高压灭菌或可灭菌的袋。生物反应器可由玻璃制成，或者它也可由聚合物制成，或者它也可由其他材料制成。生物反应器的实例包括但不限于搅拌罐(例如，充分混合)生物反应器和管式(例如，活塞流)生物反应器、气升式生物反应器、膜搅拌罐、自旋过滤器搅拌罐、振动混合器、流化床反应器和膜生物反应器。操作生物反应器的模式可以是分批或连续过程，并且将取决于所培养的工程化细胞。当进料和产物流连续进料和从系统中排出时，生物反应器是连续的。分批式生物反应器可具有连续的再循环流，但没有连续的营养物进料或产物收获。对于间歇性收获和补料分批(或分批补料)培养，细胞以较低的活细胞密度接种在组成与分批培养基相似的培养基中。允许细胞在基本上没有外部操作的情况下呈指数生长，直到营养物有些耗尽并且细胞接近稳定生长期。此时，对于间歇性收获分批补料过程，可收获一部分细胞和产物，并且用新鲜培养基补充除去的培养基。这一过程可重复多次。对于重组蛋白质和抗体的产生，可使用补料分批工艺。虽然细胞呈指数生长，但营养物正在耗尽，连续或间歇添加浓缩补料培养基(例如，浓缩基础培养基的10-15倍)以提供额外的营养物，从而进一步增加细胞浓度和生产期的长度。新鲜培养基可与细胞浓度成比例添加，而无需除去培养基(肉汤)。为了容纳培养基的添加，补料分批培养以远低于生物反应器的全部容量的体积(例如，最大体积的大约40％至50％)开始。
本公开的一些方法涉及RNA(例如，ssRNA，更具体地mRNA)的大规模生产。对于大规模生产方法，工程化的细胞可在体积为5升(L)至250,000L或更大的液体培养基中生长。在一些实施方案中，工程化的细胞可在体积大于(或等于)10L、100L、1000L、10000L或100000L的液体培养基中生长。在一些实施方案中，工程化的细胞在体积为5L、10L、15L、20L、25L、30L、35L、40L、45L、50L、100L、500L、1000L、5000L、10000L、100000L、150000L、200000L、250000L或更大的液体培养基中生长。在一些实施方案中，工程化的细胞可在体积为5L至10L、5L至15L、5L至20L、5L至25L、5L至30L、5L至35L、5L至40L、5L至45L、10L至15L、10L至20L、10L至25L、20L至30L、10L至35L、10L至40L、10L至45L、10L至50L、15L至20L、15L至25L、15L至30L、15L至35L、15L至40L、15L至45L或15至50L的液体培养基中生长。在一些实施方案中，工程化的细胞可在体积为100L至300000L、100L至200000L或100L至100000L的液体培养基中生长。
通常，工程化的细胞培养之后是裂解细胞。“裂解”是指细胞例如通过病毒、酶促、机械或渗透机制被分解的过程。“细胞裂解物”是指含有裂解的细胞(例如裂解的工程化细胞)的内容物的流体，包括例如细胞器、膜脂质、蛋白质、核酸和倒膜囊泡。本公开的细胞裂解物可通过裂解任何工程化的细胞群体来产生，如本文所提供。
被称为“裂解”的细胞裂解方法是本领域已知的，可根据本公开使用所述方法中的任一种。此类细胞裂解方法包括但不限于物理裂解如均质化。
细胞裂解可扰乱精心控制的细胞环境，从而导致蛋白质降解和通过不受调控的内源性蛋白酶和磷酸酶修饰。因此，在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂和/或磷酸酶抑制剂可在裂解前添加至细胞裂解物或细胞，或者可通过热灭活或基因灭活除去这些活性。
在一些实施方案中，细胞裂解物可与至少一种营养物组合。例如，细胞裂解物可与Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、NaCl、MgSO4或CaCl2组合。其他营养物的实例包括但不限于硫酸镁、氯化镁、乳清酸镁、柠檬酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢铵、铵磷酸氢二铵、硫酸铵、氯化铵和氢氧化铵。
在一些实施方案中，细胞裂解物可与至少一种辅因子组合。例如，细胞裂解物可与腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或酶活性所需的其他非蛋白质化学化合物(例如，无机离子和辅酶)组合。
在一些实施方案中，细胞裂解物在使得RNA解聚的条件下孵育。在一些实施方案中，细胞裂解物在使得产生ssRNA或更具体地mRNA的条件下孵育。
用于单个反应的细胞裂解物的体积可有所变化。在一些实施方案中，细胞裂解物的体积是0.001至10m3。例如，细胞裂解物的体积可以是0.001m3、0.01m3、0.1m3、1m3、5m3、10m3。
在一些实施方案中，细胞裂解物在RNA解聚之前进行进一步加工。可使用已建立的技术(例如使用TRIzol试剂或盐、或沉淀)从培养的细胞中回收总细胞RNA。
加帽
mRNA帽具有多种功能，包括但不限于募集核糖体亚基、促进核糖体组装和翻译以及保护mRNA免受核酸外切酶活性的影响。
可使用多种方法实现加帽。在一些实施方案中，使用一种或多种酶实现加帽。加帽的过程需要表9中表示的多种酶活性。在一些实施方案中，一种蛋白质完成所有四种功能。在一些实施方案中，四种活性由两种、三种或四种酶完成。
表9.加帽酶活性
Figure BDA0003356710250000761
Figure BDA0003356710250000771
可在RNA聚合步骤之后进行加帽。在一些实施方案中，RNA聚合反应在加帽之前失活。在一些实施方案中，将加帽酶与甲基供体(例如，S-腺苷甲硫氨酸)和GTP或GMP与聚磷酸盐一起添加至反应。在一些实施方案中，通过反应中存在的激酶将GMP转化为GTP。可使用多种酶对信使RNA进行加帽。可用于本发明方法中的潜在用于使信使RNA加帽的酶的非全面列表包括在表10中。
表10.加帽酶的实例
Figure BDA0003356710250000772
在一些实施方案中，使用帽类似物对mRNA进行加帽。帽类似物可包括二核苷酸帽类似物(例如标准帽类似物或抗反向帽类似物，ARCA)或3+核苷酸帽类似物(例如来自TriLink的CleanCap)、未甲基化帽类似物或甲基化帽类似物。在一些实施方案中，将帽类似物添加至聚合反应。
在一些实施方案中，代替帽或除了帽之外，还包括一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)序列。在一些实施方案中，IRES序列被并入5’UTR序列中。在一些实施方案中，IRES来自病毒基因组，如脑心肌炎病毒(EMCV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)。在一些实施方案中，IRES来自细胞mRNA，如编码凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)、髓鞘转录因子2(MYT-2)或c-myc的那些。
加帽可在mRNA合成过程的各种不同步骤进行。加帽可共转录或转录后发生。如果进行酶促聚腺苷酸化，则这些方法可在RNA合成之后和酶促聚腺苷酸化步骤之前或之后进行。在一些实施方案中，在纯化之前在反应混合物中对RNA进行加帽。在其他实施方案中，在RNA纯化后对其进行加帽。
在一些实施方案中，辅助酶，如5’,3’核糖核酸外切酶1(xrn1)，可用于实现更有效的加帽。Xrn1处理允许以GMP开始的mRNA降解，所述GMP不能被加帽，回到NMP单体，然后可再次用于产生mRNA。由于这种降解不会影响以GTP或GDP开始的mRNA，所以这将增加可加帽的mRNA的产生。在一些实施方案中，使用特定核酸外切酶进行单磷酸化的mRNA再循环。除了CFR反应中的标准酶外，还添加了5’-一磷酸特异性核糖核酸外切酶如xrn1。Xrn1可用于降解具有5’一磷酸的mRNA，从而将NMP再循环回至CFR反应。它还可用于降解CFR中产生的mRNA中的不可加帽mRNA。
下游加工
在一些实施方案中，本文提供的方法和系统产生浓度为0.5-10g/L(例如，0.5、1、2、3、4、5或10g/L)的mRNA产物。下游加工将RNA的纯度提高至按重量计高达99％(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的RNA。下游加工的一个实例是示出以添加蛋白质沉淀剂(例如，氯化锂)开始，然后通过叠片式离心(DSC)从产物流中除去蛋白质、脂质和一些DNA。然后实施超滤以除去盐和体积。将氯化锂添加至产物流中导致RNA产物沉淀，随后使用叠片式离心将其从本体液体中分离出来，例如，从而产生约80％纯度的RNA产物流。进一步色谱精处理产生约99％的纯产物。
在一些实施方案中，通过氯化锂沉淀方案沉淀mRNA产物。在一些实施方案中，mRNA产物通过反相离子对高效液相色谱方案进行超纯化，所述方案描述于Weissman等人,2013,“HPLC purification of in vitro transcribed long RNA.”Methods in molecularbiology(Clifton,NJ),969,43中。在一些实施方案中，反相HPLC可用于从mRNA制剂中除去污染核酸产物，例如，可导致不希望的免疫反应的双链核酸。也可使用其他纯化方法。
实施例
以下实施例说明本公开的特定实施方案以及其各种用途。所述实施例仅出于说明目的而提出，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
实施例1.无细胞反应
无细胞RNA合成反应由以下组分组装：
NMP混合物：用核酸酶P1处理的酵母RNA，以产生5’核苷一磷酸(NMP)。将核酸酶P1通过超滤除去，并将混合物在用于无细胞反应之前调节至中性pH。
激酶：将过表达以下激酶的大肠杆菌菌株在高细胞密度发酵中生长，并通过高压均质化裂解：
来自嗜热栖热菌的CMP激酶(Cmk)
来自强烈火球菌的UMP激酶(PyrH)
来自海栖热袍菌的GMP激酶(Gmk)
来自风产液菌的NDP激酶(Ndk)
来自地热奇异球菌的聚磷酸盐激酶(PPK2)
RNA聚合酶：具有N末端六组氨酸标签的热稳定突变体T7 RNA聚合酶在高细胞密度发酵中在大肠杆菌中过表达。(野生型T7 RNA聚合酶也成功用于这些反应中。)通过高压均质化裂解细胞，并通过快速蛋白质液相色谱法(FPLC)纯化蛋白质。
根据表11组装无细胞RNA合成反应。在反应组装之前，将激酶裂解物在磷酸钾缓冲液中稀释至相等的总蛋白质浓度并合并。添加硫酸镁和六偏磷酸钠，然后对裂解物混合物进行热处理(70℃持续15分钟)以灭活来自激酶裂解物的途径外酶活性。
表11.示例性反应设置
组分 浓度
NMP混合物 20％v/v
MgSO<sub>4</sub> 45mM
六偏磷酸钠(HMP) 13mM
RNA聚合酶 0.1mg/mL
模板DNA 20ng/μL
激酶裂解物混合物 1.75mg/mL总蛋白质
将CFR在48℃下孵育60分钟，然后用TURBO DNA酶(Thermo Fisher)处理。通过离心沉淀不溶性碎片，并将上清液转移至新管中。按照标准技术通过氯化锂沉淀回收RNA。
实施例2：mRNA的加帽
使用含有牛痘病毒酶的商业试剂盒(例如牛痘加帽系统，New England Biolabs)使实施例1中产生的细胞裂解物进行加帽反应。反应按照产品说明书所建议进行。
实施例3：线性模板的PCR产生
将含有开放阅读框(ORF)和非翻译区(UTR)的DNA模板序列合成为线性dsDNAgBlocks(Integrated DNA Technologies)并克隆到pCR4-TOPO(Thermo FisherScientific)中。使用编码polyA尾的反向引物通过PCR扩增线性DNA模板。使用AMPure XPSPRI珠(Beckman Coulter)纯化PCR产物。此模板DNA用于实施例1中描述的程序。
实施例4：HeLa细胞中的GFP表达
将HeLa细胞用0.1μg具有XBG(β-珠蛋白，非洲爪蟾)UTR和5’ITS的编码绿色荧光蛋白(GFP)的mRNA转染，通过前面实施例中描述的无细胞过程产生，用氯化锂沉淀进行粗纯化，或通过体外转录(IVT)产生。根据制造商的说明书，使用3％MessengerMAXlipofectamine进行转染。比较了绿色荧光蛋白表达。
结果
CFR产生与通过IVT产生的表达等效的绿色荧光蛋白表达(图10)。总之，结果表明无细胞反应方法与体外转录(IVT)方法相当。
实施例5：使用不同UTR的表达
使用CFR产生编码GFP的mRNA并在HeLa细胞提取物中进行测定。制备了具有4种不同非翻译区(UTR)–5’羟基甾醇脱氢酶，3’白蛋白(HSD)；5’细胞色素氧化酶，3’白蛋白(COX)；5’,5’人β-珠蛋白(HBG)；5’,3’非洲爪蟾β-珠蛋白(XBG)(各自具有5’ITS)的mRNA。(这些UTR在表7中详述。)通过监测反应的绿色荧光(例如在具有适当设置的qPCR机器或荧光酶标仪中)定量GFP的表达。
结果
通过CFR产生的具有所有四种UTR的mRNA产生活性GFP表达(图11)。XBG、HBG、COX和HSD UTR均产生处于或高于300,000RFU的GFP的表达。
实施例6：RNA纯化
将来自CFR过程的mRNA和通过体外转录(IVT)产生的mRNA使用氯化锂沉淀粗纯化。在BioAnalyzer上使用毛细管凝胶电泳确定RNA的相对丰度。通过CFR制备的mRNA仅通过氯化锂沉淀粗纯化或使用反相离子对高效液相色谱法(超纯化或“精处理”)纯化，然后如下进行氯化锂沉淀。
HPLC纯化基本上遵循Weissman等人,2013,“HPLC purification of in vitrotranscribed long RNA.”Methods in molecular biology(Clifton,NJ),969,43的方案。
使用21.2x100mm的RNASep Semi-Prep(ADS Biotec目录号RPC-99-2110)，保持在80℃。所使用的流动相如下：
A–0.1M乙酸四乙铵(TEAA)，pH 7.0
B–0.1M TEAA，pH 7.0，25％乙腈
将样品注射到柱上并使用以下梯度程序以3ml/min的泵速进行分离：
0.0分钟，62％A，38％B
20.0分钟，40％A，60％B
20.01分钟，0％A，100％B
22.00分钟，0％A，100％B
22.01分钟，62％A，38％B
28.0分钟，62％A，38％B。
使用预润湿的30kDa截留离心过滤器(例如Amicon UFC903096)汇集并浓缩含有所需mRNA种类的级分。按照标准技术用LiCl沉淀浓缩的mRNA样品。
将粗纯化或超纯化的CFR mRNA使用根据Karikó等人,2011,“Generating theoptimal mRNA for therapy:HPLC purification eliminates immune activation andimproves translation of nucleoside-modified,protein-encoding mRNA.”NucleicAcids Research,39(21),e142的免疫印迹技术针对dsRNA进行测试。还使用EndoSafe-MCS系统(Charles River Laboratories，制造商的说明书)测试了粗纯化和超纯化CFR mRNA的内毒素，并与通过IVT产生的粗纯化或超纯化的mRNA进行比较。粗纯化和超纯化的产物进行如下基于质量的纯度分析。
按照试剂盒说明书，通过二辛可宁酸(BCA)测定试剂盒(Thermo Fisher)对残留蛋白质进行定量。将残留阳离子通过Thomas等人,2002,“Determination of inorganiccations and ammonium in environmental waters by ion chromatography with ahigh-capacity cation-exchange column.”Journal of Chromatography A,956(1-2),181-186的方法进行定量。将残留阴离子通过Boyles,1992,“Method for the analysis ofinorganic and organic acid anions in all phases of beer production usinggradient ion chromatography.”Journal of the American Society of BrewingChemists,50(2),61-63的方法进行定量。将残留核苷酸按照Edelson等人,1979,“Ion-exchange separation of nucleic acid constituents by high-performance liquidchromatography.”Journal of Chromatography A,174(2),409-419；和Hartwick等人,1975,“The performance of microparticle chemically-bonded anion-exchangeresins in the analysis of nucleotides.”Journal of Chromatography A,112,651-662的方法进行定量。
结果
通过无细胞过程制备的mRNA产生少于70％的所需mRNA的核酸纯度，尽管所达到的纯度与通过体外转录(IVT；图12)达到的纯度相似。HPLC过程除去大部分dsRNA(图13)。除去内毒素(图14)。随后使用HPLC过程对RNA进行“精处理”产生显著更高的代表目标mRNA种类的总核酸百分比-85％。商业RNA制剂含有78％的目标种类(图15)。
实施例7：流感抗原的表达
具有HBG或XBG UTR(各自包含5’ITS)的编码来自H1N1波多黎各/8/1934流感病毒的血凝素蛋白(HA)的mRNA使用CFR系统产生，并LiCl沉淀或使用HPLC超纯化。使用ELISA测量HeLa提取物中的HA。首先用捕获抗体(兔抗甲型流感/波多黎各/8/1934血凝素单克隆抗体，Sino Biological)包被微孔板，然后洗涤并封闭。稀释含有翻译的HA的HeLa细胞提取物，然后将其施加至板并在室温下孵育1小时。然后洗涤孔，之后施加检测抗体(缀合至辣根过氧化物酶的兔抗甲型流感/波多黎各/8/1934，Sino Biological)。然后添加辣根过氧化物酶底物(3’,3’,5’,5’-四甲基联苯胺)，并使用酶标仪定量650nm处的吸光度。
与通过体外转录(IVT)产生的mRNA相比，通过蛋白质印迹分析CFR产生的mRNA。使用亲和纯化的兔抗甲型流感/波多黎各/8/1934多克隆第一抗体(Sino Biological)和亲和纯化的山羊抗兔辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(Jackson Immunologicals)，还通过蛋白质印迹在细胞提取物中检测到翻译的HA。
结果
HA成功产生，并且如果对样品进行超纯化，则最终制剂中的浓度更高(图16)。产量类似于使用IVT实现的产量。(图17)。
实施例8：荧光素酶的无细胞产生
使用CFR过程产生具有HBG或XBG UTR(各自包含5’ITS)的编码萤火虫荧光素酶的mRNA。使用1步人偶联IVT试剂盒(Thermo Fisher)按照试剂盒说明测量HeLa细胞提取物中的翻译，除了添加500ng加帽的DNA酶处理的mRNA(针对纯度进行了校正)而不是纯化的DNA。按照试剂盒说明书，使用Steady-Glo荧光素酶测定系统(Promega)测量萤火虫荧光素酶的表达。测量HeLa提取物和HeLa细胞两者中来自萤火虫荧光素酶的发光，使用Promega试剂盒提供读数。HeLa细胞转染如实施例4中进行。
结果
在HeLa提取物(图18)和HeLa细胞(图19)两者中都产生了功能性荧光素酶。在HeLa提取物中，与XBG相比，在HBG UTR情况下观察到更高的荧光素酶表达。在HeLa细胞中，无论转染条件如何，具有HBG UTR的荧光素酶mRNA都产生高水平的荧光素酶表达(每孔1:0.15uLlipofectamine，每孔2:0.30uL lipofectamine，在每种情况下转染100ng mRNA)
实施例9：无细胞RNA产生的荧光素酶的体内表达
使用IVT和CFR方法产生编码萤火虫荧光素酶的mRNA，HPLC纯化并加帽。mRNA包含HBG UTR和5’ITS。对于CFR和IVT，mRNA以两种制剂产生：“内部”脂质纳米颗粒(文献制剂，由研究人员优化)和外部脂质纳米颗粒(由商业合作伙伴制造或使用Precision Nanosystems试剂盒制造)。“内部”LNP是根据Pardi等人使用D-Lin-MC3-DMA作为可电离脂质配制的：Pardi等人,2015,J.Controlled Release,217,345-351。“GenVoy”LNP是使用GenVoy-ILM可电离脂质混合物(Precision Nanosystems)配制的。两种制剂均使用NanoAssemblr台式微流体混合器(Precision Nanosystems)按照制造商说明书产生。
4种处理(2种产生方法，2种制剂)中的每一者均以40、15或5μg的单次皮内剂量施用于3只BALB/c小鼠的实验组。向动物腹膜内施用D-荧光素150mg/kg，并在mRNA施用后6小时用体内成像系统(IVIS)成像，并在72小时内测量发光。
结果
CFR产生的mRNA在引发荧光素酶表达方面至少与IVT一样有效。在较早的时间点，具有内部制剂的CFR产生的mRNA产生更高的荧光素酶表达。40和15μg施用达到相似的表达水平(图20，21)。
实施例10：用抗反向帽类似物(ARCA)加帽产生核苷修饰的mRNA
如实施例9中所述使用CFR产生核苷修饰的mRNA并进行HPLC纯化，除了用于合成反应的核苷酸来源由未修饰的核苷一磷酸腺苷和鸟苷以及假尿苷ψ和5-甲基胞苷m5C组成。未修饰的和修饰的核苷各自以5mM添加至反应，GMP除外(其以1mM添加)。以4mM添加帽类似物(ARCA)。将反应在37℃下孵育4小时，然后对反应进行DNA酶处理，通过LiCl沉淀回收并通过HPLC纯化。模板是如之前在申请中所描述通过PCR产生，并含有侧接5’和3’非翻译区的目标基因(萤火虫荧光素酶)以及3’polyA尾。随后分析了mRNA的纯度、核苷修饰的掺入、加帽和小鼠中的基因表达。
核苷修饰的定量是通过使用核酸酶、磷酸二酯酶和磷酸酶的混合物将样品消化为单核苷，并使用LC-MS定量单核苷而实现的。将修饰的核苷(例如ψ)的相对浓度与未修饰的核苷(例如U)进行比较。类似地，对于m7G帽，将m7G的相对浓度与IVT参考进行比较。
小鼠中靶基因表达的测定是通过将mRNA配制成脂质纳米颗粒制剂、然后通过肌内途径以指定剂量注射到BALB/c小鼠(每组N＝10只小鼠)中来实现的。随后在图23中所示的时间向小鼠注射D-荧光素，然后体内成像(IVIS)。
结果
在CFR产生的mRNA和通过IVT产生的相同序列的参考标准品中观察到相似的纯度(图22A)。CFR产生的mRNA和通过IVT产生的相同序列的参考标准品的核苷修饰和加帽的定量显示在图22B中。CFR产生的mRNA表现出与修饰的核苷相似的取代效率和与IVT相似的加帽。图23提供小鼠中靶基因表达的图形描述。在1μg和0.1μg剂量下，CFR产生的mRNA在所有时间点与IVT的效力相似。
实施例11：保护小鼠免受流感感染的模型流感疫苗的产生
如本申请的实施例9中所述，使用CFR产生编码模型流感疫苗的mRNA，HPLC纯化并封装在脂质纳米颗粒中。根据Petsch等人,Nat Biotechnol.2012(doi:10.1038/nbt.2436)，mRNA编码来自甲型流感/波多黎各/8/1934(H1N1)的全长血凝素(HA)蛋白，或萤火虫萤光素酶(FLuc)。mRNA序列包含5’和3’HBG UTR、5’ITS和3’A100尾。通过PCR产生模板。BALB/c小鼠(每组N＝8只小鼠)以指定剂量免疫两次(第0天初次免疫和第21天加强免疫；肌内)。施用灭活的H1N1病毒的小鼠充当阳性对照。在处理的小鼠中定量血清免疫，并测量对流感激发的保护。通过血凝抑制(HAI)测定来测定小鼠的血清免疫。在第42天通过尾静脉收集血液并加工成血清用于HAI测定。流感激发是通过用甲型流感/波多黎各/8/1934(H1N1)激发后小鼠的体重变化而测量的。在第63天向小鼠鼻内施用活病毒，然后监测体重10天。
结果
如通过HAI测定所测量的小鼠中的血清免疫显示在图24中。用两种剂量的HA mRNA处理的小鼠产生了HA灭活抗体，其中30μg剂量组至的滴度超过灭活的H1N1对照组的滴度。选择来自这些组的小鼠(图24中圈出)用于随后的激发研究。
用甲型流感/波多黎各/8/1934(H1N1)激发后小鼠的体重显示在图25中。施用HAmRNA或灭活的H1N1对照的小鼠被保护免受与流感感染相关的体重减轻，而未处理的小鼠和施用FLuc mRNA的小鼠体重减轻，直到它们达到人道研究终点(总体重减轻25％)并被处死。
这些结果表明，CFR产生的mRNA产生了针对甲型流感/波多黎各/8/1934的有效免疫反应，并且因此可充当小鼠的保护性和特异性疫苗。
实施例12：从各种核苷酸来源产生mRNA
在实施例11中描述的编码流感血凝素的mRNA通过CFR使用细胞RNA来源的核苷酸或使用纯化的核苷一磷酸产生。如本申请的实施例9中所述产生mRNA，除了将细胞RNA来源的核苷酸混合物与激酶、镁和六偏磷酸钠(HMP)一起在48℃下预孵育1小时，然后温度降至37℃，并添加模板和聚合酶。将反应在37℃下进一步孵育2小时。作为对照，通过常规体外转录(IVT)产生相同的序列。将反应物用DNA酶处理，通过LiCl沉淀纯化RNA，并使用BioAnalyzer(Agilent)通过电泳评估RNA质量。
结果
图26A是未加帽的IVT产生的mRNA的电泳图，作为纯度的参考。图26B是使用细胞RNA来源的核苷酸，未加帽的CFR产生的mRNA的电泳图。图26C是使用各自5mM的纯化的核苷一磷酸(AMP、CMP、GMP和UMP)的等摩尔混合物，未加帽的CFR产生的mRNA的电泳图。CFR反应与图26B中的反应类似地进行。无论核苷酸来源如何，通过CFR产生的mRNA都表现出与IVT相似的纯度。
实施例13：从线性化质粒模板产生具有编码的polyA尾的mRNA
如本申请中其他地方所述，编码EGFP的未加帽mRNA通过CFR产生。构建由pUC复制起点、选择性标记物、T7启动子、侧接5’和3’HBG UTR的EGFP基因、3’polyA尾和用于线性化的独特BspQI位点组成的最小化模板质粒。在模板质粒中编码由0、50、100或150个A核苷酸组成的PolyA尾。将质粒在大肠杆菌菌株DH10b中培养，通过Plasmid Midi试剂盒(Qiagen)纯化，通过用BspQI(New England Biolabs)消化而线性化，并在用于CFR中之前通过苯酚/氯仿提取纯化。合成mRNA，通过氯化锂沉淀进行纯化，并使用BioAnalyzer(Agilent)通过电泳进行分析。
结果
图27是使用长度为0、50、100或150个核苷酸的polyA尾的CFR产生的mRNA的覆盖电泳图。每个样品中的主峰代表所需大小的全长mRNA，从而表明CFR系统与质粒模板和编码的polyA尾相容。
已详细描述本发明并且已参考本发明的具体方面和/或实施方案，显然在不脱离所附权利要求书所界定的本发明的范围的情况下，修改和变化都是可能的。更具体地，虽然本发明的一些方面在本文中可被鉴定为特别有利的，但是预期本发明并不限于本发明的这些特定方面。本文公开的百分比的量可与公开的值相差±10％、20％或30％，并且保持在预期发明的范围内。
在权利要求书中，除非相反指出或另外从上下文明显看出，否则冠词如“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”可意指一个/种或多于一个/种。除非相反指出或另外从上下文明显看出，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、被用于或以其他方式关联于给定的产物或方法，那么认为包括在组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或描述得到了满足。本发明包括组的正好一个成员存在于、用于或以其他方式关联于给定产物或过程的实施方案。本发明包括多于一个或所有的组成员存在于、用于或以其他方式关联于给定产物或过程的实施方案。
此外，本发明涵盖所有的变化、组合和排列，其中一个或多个限制、要素、条款以及描述性术语，从所列出的权利要求中的一个或多个被引入到另一权利要求。例如，任何附属在另一权利要求的权利要求可被修改以包括在任一其他属于同一基本权利要求的权利要求中所见的一个或多个限制。在要素是以例如马库西组(Markush group)格式的清单呈现的情况下，也公开了所述要素的各个亚组，并且可从所述组中除去任何一个或多个要素。应了解，一般来说，在本发明或本发明的方面被提及为包含特定要素和/或特征的情况下，本发明的某些实施方案或本发明的方面由此类要素和/或特征组成或基本上由此类要素和/或特征组成。为简单起见，那些实施方案并未在本文中具体阐述。还应该指出，术语“包含(comprising)”和“含有(containing)”意图是开放性的并且允许包括另外的要素或步骤。在给出范围时，端点被包括在内。另外，除非另外指明，或者另外从上下文以及本领域的普通技术人员的理解明显可见，否则以范围表示的值在本发明的不同实施方案中可采用所规定的范围内的任何特定值或子范围，除非上下文中另外清楚地指示，否则精确到该范围的下限单位的十分之一。
本申请引用了不同发布的专利、出版的专利申请、杂志文章和其他出版物，其全部以引用的方式并入本文。如果任何所并入的参考文献与本说明之间书存在冲突，则以本说明书为准。另外，在现有技术内的本发明的任何特定实施方案可从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为认为此类实施方案为本领域普通技术人员所已知的，即使本文没有明确阐述排除，也可排除它们。本发明的任何特定实施方案都可出于任何原因从任何权利要求项中排除，无论是否涉及现有技术的存在。
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文所描述的具体实施方案的许多等效物。本文所描述的本发明实施方案的范围不意图限于以上说明书，而是如所附权利要求书中所阐述。本领域的普通技术人员将了解到，可在不偏离本发明的精神或范围的情况下对本说明书进行各种变化和修改，如以下权利要求书中所限定的。
序列
地热奇异球菌DSM 11300PPK2
MQLDRYRVPPGQRVRLSNWPTDDDGGLSKAEGEALLPDLQQRLANLQERLYAESQQALLIVLQARDAGGKDGTVKHVIGAFNPSGVQVSNFKVPTEEERAHDFLWRIHRQTPRLGMIGVFNRSQYEDVLVTRVHHLIDDQTAQRRLKHICAFESLLTDSGTRIVKFYLHISPEEQKKRLEARLADPSKHWKFNPGDLQERAHWDAYTAVYEDVLTTSTPAAPWYVVPADRKWFRNLLVSQILVQTLEEMNPQFPAPAFNAADLRIV(SEQ ID NO:1)
红色亚栖热菌DM 1279PPK2
MGFCSIEFLMGAQMKKYRVQPDGRFELKRFDPDDTSAFEGGKQAALEALAVLNRRLEKLQELLYAEGQHKVLVVLQAMDAGGKDGTIRVVFDGVNPSGVRVASFGVPTEQELARDYLWRVHQQVPRKGELVIFNRSHYEDVLVVRVKNLVPQQVWQKRYRHIREFERMLADEGTTILKFFLHISKDEQRQRLQERLDNPEKRWKFRMGDLEDRRLWDRYQEAYEAAIRETSTEYAPWYVIPANKNWYRNWLVSHILVETLEGLAMQYPQPETASEKIVIE(SEQ ID NO:2)
尔瓦诺斯亚栖热菌DSM 9946PPK2
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细长嗜热聚球藻BP-1PPK2
MIPQDFLDEINPDRYIVPAGGNFHWKDYDPGDTAGLKSKVEAQELLAAGIKKLAAYQDVLYAQNIYGLLIIFQAMDAAGKDSTIKHVMSGLNPQACRVYSFKAPSAEELDHDFLWRANRALPERGCIGIFNRSYYEEVLVVRVHPDLLNRQQLPPETKTKHIWKERFEDINHYERYLTRNGILILKFFLHISKAEQKKRFLERISRPEKNWKFSIEDVRDRAHWDDYQQAYADVFRHTSTKWAPWHIIPANHKWFARLMVAHFIYQKLASLNLHYPMLSEAHREQLLEAKALLENEPDED(SEQ ID NO:4)
嗜热厌氧绳菌UNI-1PPK2
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嗜气暖绳菌DSM 14535PPK2
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绿色硫细菌TLS PPK2
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深海洋栖热菌DSM 14977PPK2
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绿色玫瑰弯菌DSM 13941PPK2
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玫瑰弯菌属RS-1PPK2
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Truepera radiovictrix DSM 17093PPK2
MSQGSAKGLGKLDKKVYARELALLQLELVKLQGWIKAQGLKVVVLFEGRDAAGKGSTITRITQPLNPRVCRVVALGAPTERERTQWYFQRYVHHLPAAGEMVLFDRSWYNRAGVERVMGFCTEAEYREFLHACPTFERLLLDAGIILIKYWFSVSAAEQERRMRRRNENPAKRWKLSPMDLEARARWVAYSKAKDAMFYHTDTKASPWYVVNAEDKRRAHLSCIAHLLSLIPYEDLTPPPLEMPPRDLAGADEGYERPDKAHQTWVPDYVPPTR(SEQ ID NO:11)
嗜热栖热菌Adk
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嗜热栖热菌Cmk
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强烈火球菌PyrH
MRIVFDIGGSVLVPENPDIDFIKEIAYQLTKVSEDHEVAVVVGGGKLARKYIEVAEKFNSSETFKDFIGIQITRANAMLLIAALREKAYPVVVEDFWEAWKAVQLKKIPVMGGTHPGHTTDAVAALLAEFLKADLLVVITNVDGVYTADPKKDPTAKKIKKMKPEELLEIVGKGIEKAGSSSVIDPLAAKIIARSGIKTIVIGKEDAKDLFRVIKGDHNGTTIEP(SEQ ID NO:14)
海栖热袍菌Gmk
MKGQLFVICGPSGAGKTSIIKEVLKRLDNVVFSVSCTTRPKRPHEEDGKDYFFITEEEFLKRVERGEFLEWARVHGHLYGTLRSFVESHINEGKDVVLDIDVQGALSVKKKYSNTVFIYVAPPSYADLRERILKRGTEKEADVLVRLENAKWELMFMDEFDYIVVNENLEDAVEMVVSIVRSERAKVTRNQDKIERFKMEVKGWKKL(SEQ ID NO:15)
风产液菌Ndk
MAVERTLIIVKPDAMEKGALGKILDRFIQEGFQIKALKMFRFTPEKAGEFYYVHRERPFFQELVEFMSSGPVVAAVLEGEDAIKRVREIIGPTDSEEARKVAPNSIRAQFGTDKGKNAIHASDSPESAQYEICFIFSGLEIV(SEQ ID NO:16)
ITS
GGGAGACCAGGAATT(SEQ ID NO:17)
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Sequence Listing
<110> 绿光生物科技股份有限公司(GreenLight Biosciences)
<120> 核糖核酸的无细胞产生
<130> 19-460-WO
<150> 62/826,983
<151> 2019-03-29
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
<213> 地热奇异球菌(Deinococcus geothermalis)
<400> 1
Met Gln Leu Asp Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Gln Arg Val Arg Leu
1 5 10 15
Ser Asn Trp Pro Thr Asp Asp Asp Gly Gly Leu Ser Lys Ala Glu Gly
20 25 30
Glu Ala Leu Leu Pro Asp Leu Gln Gln Arg Leu Ala Asn Leu Gln Glu
35 40 45
Arg Leu Tyr Ala Glu Ser Gln Gln Ala Leu Leu Ile Val Leu Gln Ala
50 55 60
Arg Asp Ala Gly Gly Lys Asp Gly Thr Val Lys His Val Ile Gly Ala
65 70 75 80
Phe Asn Pro Ser Gly Val Gln Val Ser Asn Phe Lys Val Pro Thr Glu
85 90 95
Glu Glu Arg Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Ile His Arg Gln Thr Pro
100 105 110
Arg Leu Gly Met Ile Gly Val Phe Asn Arg Ser Gln Tyr Glu Asp Val
115 120 125
Leu Val Thr Arg Val His His Leu Ile Asp Asp Gln Thr Ala Gln Arg
130 135 140
Arg Leu Lys His Ile Cys Ala Phe Glu Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly
145 150 155 160
Thr Arg Ile Val Lys Phe Tyr Leu His Ile Ser Pro Glu Glu Gln Lys
165 170 175
Lys Arg Leu Glu Ala Arg Leu Ala Asp Pro Ser Lys His Trp Lys Phe
180 185 190
Asn Pro Gly Asp Leu Gln Glu Arg Ala His Trp Asp Ala Tyr Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Glu Asp Val Leu Thr Thr Ser Thr Pro Ala Ala Pro Trp Tyr
210 215 220
Val Val Pro Ala Asp Arg Lys Trp Phe Arg Asn Leu Leu Val Ser Gln
225 230 235 240
Ile Leu Val Gln Thr Leu Glu Glu Met Asn Pro Gln Phe Pro Ala Pro
245 250 255
Ala Phe Asn Ala Ala Asp Leu Arg Ile Val
260 265
<210> 2
<211> 280
<212> PRT
<213> 红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)
<400> 2
Met Gly Phe Cys Ser Ile Glu Phe Leu Met Gly Ala Gln Met Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Arg Val Gln Pro Asp Gly Arg Phe Glu Leu Lys Arg Phe Asp Pro
20 25 30
Asp Asp Thr Ser Ala Phe Glu Gly Gly Lys Gln Ala Ala Leu Glu Ala
35 40 45
Leu Ala Val Leu Asn Arg Arg Leu Glu Lys Leu Gln Glu Leu Leu Tyr
50 55 60
Ala Glu Gly Gln His Lys Val Leu Val Val Leu Gln Ala Met Asp Ala
65 70 75 80
Gly Gly Lys Asp Gly Thr Ile Arg Val Val Phe Asp Gly Val Asn Pro
85 90 95
Ser Gly Val Arg Val Ala Ser Phe Gly Val Pro Thr Glu Gln Glu Leu
100 105 110
Ala Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Gln Gln Val Pro Arg Lys Gly
115 120 125
Glu Leu Val Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val Val
130 135 140
Arg Val Lys Asn Leu Val Pro Gln Gln Val Trp Gln Lys Arg Tyr Arg
145 150 155 160
His Ile Arg Glu Phe Glu Arg Met Leu Ala Asp Glu Gly Thr Thr Ile
165 170 175
Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu Gln Arg Gln Arg Leu
180 185 190
Gln Glu Arg Leu Asp Asn Pro Glu Lys Arg Trp Lys Phe Arg Met Gly
195 200 205
Asp Leu Glu Asp Arg Arg Leu Trp Asp Arg Tyr Gln Glu Ala Tyr Glu
210 215 220
Ala Ala Ile Arg Glu Thr Ser Thr Glu Tyr Ala Pro Trp Tyr Val Ile
225 230 235 240
Pro Ala Asn Lys Asn Trp Tyr Arg Asn Trp Leu Val Ser His Ile Leu
245 250 255
Val Glu Thr Leu Glu Gly Leu Ala Met Gln Tyr Pro Gln Pro Glu Thr
260 265 270
Ala Ser Glu Lys Ile Val Ile Glu
275 280
<210> 3
<211> 268
<212> PRT
<213> 西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermus silvanus)
<400> 3
Met Ala Lys Thr Ile Gly Ala Thr Leu Asn Leu Gln Asp Ile Asp Pro
1 5 10 15
Arg Ser Thr Pro Gly Phe Asn Gly Asp Lys Glu Lys Ala Leu Ala Leu
20 25 30
Leu Glu Lys Leu Thr Ala Arg Leu Asp Glu Leu Gln Glu Gln Leu Tyr
35 40 45
Ala Glu His Gln His Arg Val Leu Val Ile Leu Gln Gly Met Asp Thr
50 55 60
Ser Gly Lys Asp Gly Thr Ile Arg His Val Phe Lys Asn Val Asp Pro
65 70 75 80
Leu Gly Val Arg Val Val Ala Phe Lys Ala Pro Thr Pro Pro Glu Leu
85 90 95
Glu Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Gln His Val Pro Ala Asn Gly
100 105 110
Glu Leu Val Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val Ala
115 120 125
Arg Val His Asn Leu Val Pro Pro Ala Ile Trp Ser Arg Arg Tyr Asp
130 135 140
His Ile Asn Ala Phe Glu Lys Met Leu Val Asp Glu Gly Thr Thr Val
145 150 155 160
Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu Gln Lys Lys Arg Leu
165 170 175
Leu Glu Arg Leu Val Glu Ala Asp Lys His Trp Lys Phe Asp Pro Gln
180 185 190
Asp Leu Val Glu Arg Gly Tyr Trp Glu Asp Tyr Met Glu Ala Tyr Gln
195 200 205
Asp Val Leu Asp Lys Thr His Thr Gln Tyr Ala Pro Trp His Val Ile
210 215 220
Pro Ala Asp Arg Lys Trp Tyr Arg Asn Leu Gln Val Ser Arg Leu Leu
225 230 235 240
Val Glu Ala Leu Glu Gly Leu Arg Met Lys Tyr Pro Arg Pro Lys Leu
245 250 255
Asn Ile Pro Arg Leu Lys Ser Glu Leu Glu Lys Met
260 265
<210> 4
<211> 300
<212> PRT
<213> 细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)
<400> 4
Met Ile Pro Gln Asp Phe Leu Asp Glu Ile Asn Pro Asp Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Val Pro Ala Gly Gly Asn Phe His Trp Lys Asp Tyr Asp Pro Gly Asp
20 25 30
Thr Ala Gly Leu Lys Ser Lys Val Glu Ala Gln Glu Leu Leu Ala Ala
35 40 45
Gly Ile Lys Lys Leu Ala Ala Tyr Gln Asp Val Leu Tyr Ala Gln Asn
50 55 60
Ile Tyr Gly Leu Leu Ile Ile Phe Gln Ala Met Asp Ala Ala Gly Lys
65 70 75 80
Asp Ser Thr Ile Lys His Val Met Ser Gly Leu Asn Pro Gln Ala Cys
85 90 95
Arg Val Tyr Ser Phe Lys Ala Pro Ser Ala Glu Glu Leu Asp His Asp
100 105 110
Phe Leu Trp Arg Ala Asn Arg Ala Leu Pro Glu Arg Gly Cys Ile Gly
115 120 125
Ile Phe Asn Arg Ser Tyr Tyr Glu Glu Val Leu Val Val Arg Val His
130 135 140
Pro Asp Leu Leu Asn Arg Gln Gln Leu Pro Pro Glu Thr Lys Thr Lys
145 150 155 160
His Ile Trp Lys Glu Arg Phe Glu Asp Ile Asn His Tyr Glu Arg Tyr
165 170 175
Leu Thr Arg Asn Gly Ile Leu Ile Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser
180 185 190
Lys Ala Glu Gln Lys Lys Arg Phe Leu Glu Arg Ile Ser Arg Pro Glu
195 200 205
Lys Asn Trp Lys Phe Ser Ile Glu Asp Val Arg Asp Arg Ala His Trp
210 215 220
Asp Asp Tyr Gln Gln Ala Tyr Ala Asp Val Phe Arg His Thr Ser Thr
225 230 235 240
Lys Trp Ala Pro Trp His Ile Ile Pro Ala Asn His Lys Trp Phe Ala
245 250 255
Arg Leu Met Val Ala His Phe Ile Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Leu Asn
260 265 270
Leu His Tyr Pro Met Leu Ser Glu Ala His Arg Glu Gln Leu Leu Glu
275 280 285
Ala Lys Ala Leu Leu Glu Asn Glu Pro Asp Glu Asp
290 295 300
<210> 5
<211> 281
<212> PRT
<213> 嗜热厌氧绳菌(Anaerolinea thermophila)
<400> 5
Met Gly Glu Ala Met Glu Arg Tyr Phe Ile Lys Pro Gly Glu Lys Val
1 5 10 15
Arg Leu Lys Asp Trp Ser Pro Asp Pro Pro Lys Asp Phe Glu Gly Asp
20 25 30
Lys Glu Ser Thr Arg Ala Ala Val Ala Glu Leu Asn Arg Lys Leu Glu
35 40 45
Val Leu Gln Glu Arg Leu Tyr Ala Glu Arg Lys His Lys Val Leu Val
50 55 60
Ile Leu Gln Gly Met Asp Thr Ser Gly Lys Asp Gly Val Ile Arg Ser
65 70 75 80
Val Phe Glu Gly Val Asn Pro Gln Gly Val Lys Val Ala Asn Phe Lys
85 90 95
Val Pro Thr Gln Glu Glu Leu Asp His Asp Tyr Leu Trp Arg Val His
100 105 110
Lys Val Val Pro Gly Lys Gly Glu Ile Val Ile Phe Asn Arg Ser His
115 120 125
Tyr Glu Asp Val Leu Val Val Arg Val His Asn Leu Val Pro Pro Glu
130 135 140
Val Trp Lys Lys Arg Tyr Glu Gln Ile Asn Gln Phe Glu Arg Leu Leu
145 150 155 160
His Glu Thr Gly Thr Thr Ile Leu Lys Phe Phe Leu Phe Ile Ser Arg
165 170 175
Glu Glu Gln Lys Gln Arg Leu Leu Glu Arg Leu Ala Asp Pro Ala Lys
180 185 190
His Trp Lys Phe Asn Pro Gly Asp Leu Lys Glu Arg Ala Leu Trp Glu
195 200 205
Glu Tyr Glu Lys Ala Tyr Glu Asp Val Leu Ser Arg Thr Ser Thr Glu
210 215 220
Tyr Ala Pro Trp Ile Leu Val Pro Ala Asp Lys Lys Trp Tyr Arg Asp
225 230 235 240
Trp Val Ile Ser Arg Val Leu Val Glu Thr Leu Glu Gly Leu Glu Ile
245 250 255
Gln Leu Pro Pro Pro Leu Ala Asp Ala Glu Thr Tyr Arg Arg Gln Leu
260 265 270
Leu Glu Glu Asp Ala Pro Glu Ser Arg
275 280
<210> 6
<211> 270
<212> PRT
<213> 嗜气暖绳菌(Caldilinea aerophila)
<400> 6
Met Asp Val Asp Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Ser Thr Ile His Leu
1 5 10 15
Ser Gln Trp Pro Pro Asp Asp Arg Ser Leu Tyr Glu Gly Asp Lys Lys
20 25 30
Gln Gly Lys Gln Asp Leu Ser Ala Leu Asn Arg Arg Leu Glu Thr Leu
35 40 45
Gln Glu Leu Leu Tyr Ala Glu Gly Lys His Lys Val Leu Ile Ile Leu
50 55 60
Gln Gly Met Asp Thr Ser Gly Lys Asp Gly Val Ile Arg His Val Phe
65 70 75 80
Asn Gly Val Asn Pro Gln Gly Val Lys Val Ala Ser Phe Lys Val Pro
85 90 95
Thr Ala Val Glu Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Ile His Arg Gln
100 105 110
Thr Pro Gly Ser Gly Glu Ile Val Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu
115 120 125
Asp Val Leu Val Val Arg Val His Gly Leu Val Pro Pro Glu Val Trp
130 135 140
Ala Arg Arg Tyr Glu His Ile Asn Ala Phe Glu Lys Leu Leu Val Asp
145 150 155 160
Glu Gly Thr Thr Ile Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu
165 170 175
Gln Arg Gln Arg Leu Leu Glu Arg Leu Glu Met Pro Glu Lys Arg Trp
180 185 190
Lys Phe Ser Val Gly Asp Leu Ala Glu Arg Lys Arg Trp Asp Glu Tyr
195 200 205
Met Ala Ala Tyr Glu Ala Val Leu Ser Lys Thr Ser Thr Glu Tyr Ala
210 215 220
Pro Trp Tyr Ile Val Pro Ser Asp Arg Lys Trp Tyr Arg Asn Leu Val
225 230 235 240
Ile Ser His Val Ile Ile Asn Ala Leu Glu Gly Leu Asn Met Arg Tyr
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Asp Ile Ala Phe Asp Thr Ile Val Ile Glu
260 265 270
<210> 7
<211> 294
<212> PRT
<213> 绿色硫细菌(Chlorobaculum tepidum)
<400> 7
Met Lys Leu Asp Leu Asp Ala Phe Arg Ile Gln Pro Gly Lys Lys Pro
1 5 10 15
Asn Leu Ala Lys Arg Pro Thr Arg Ile Asp Pro Val Tyr Arg Ser Lys
20 25 30
Gly Glu Tyr His Glu Leu Leu Ala Asn His Val Ala Glu Leu Ser Lys
35 40 45
Leu Gln Asn Val Leu Tyr Ala Asp Asn Arg Tyr Ala Ile Leu Leu Ile
50 55 60
Phe Gln Ala Met Asp Ala Ala Gly Lys Asp Ser Ala Ile Lys His Val
65 70 75 80
Met Ser Gly Val Asn Pro Gln Gly Cys Gln Val Tyr Ser Phe Lys His
85 90 95
Pro Ser Ala Thr Glu Leu Glu His Asp Phe Leu Trp Arg Thr Asn Cys
100 105 110
Val Leu Pro Glu Arg Gly Arg Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser Tyr Tyr
115 120 125
Glu Glu Val Leu Val Val Arg Val His Pro Glu Ile Leu Glu Met Gln
130 135 140
Asn Ile Pro His Asn Leu Ala His Asn Gly Lys Val Trp Asp His Arg
145 150 155 160
Tyr Arg Ser Ile Val Ser His Glu Gln His Leu His Cys Asn Gly Thr
165 170 175
Arg Ile Val Lys Phe Tyr Leu His Leu Ser Lys Glu Glu Gln Arg Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Glu Arg Ile Asp Asp Pro Asn Lys Asn Trp Lys Phe Ser
195 200 205
Thr Ala Asp Leu Glu Glu Arg Lys Phe Trp Asp Gln Tyr Met Glu Ala
210 215 220
Tyr Glu Ser Cys Leu Gln Glu Thr Ser Thr Lys Asp Ser Pro Trp Phe
225 230 235 240
Ala Val Pro Ala Asp Asp Lys Lys Asn Ala Arg Leu Ile Val Ser Arg
245 250 255
Ile Val Leu Asp Thr Leu Glu Ser Leu Asn Leu Lys Tyr Pro Glu Pro
260 265 270
Ser Pro Glu Arg Arg Lys Glu Leu Leu Asp Ile Arg Lys Arg Leu Glu
275 280 285
Asn Pro Glu Asn Gly Lys
290
<210> 8
<211> 269
<212> PRT
<213> 深海洋栖热菌(Oceanithermus profundus)
<400> 8
Met Asp Val Ser Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Ser Gly Phe Asp Pro
1 5 10 15
Glu Ala Trp Pro Thr Arg Glu Asp Asp Asp Phe Ala Gly Gly Lys Lys
20 25 30
Glu Ala Lys Lys Glu Leu Ala Arg Leu Ala Val Arg Leu Gly Glu Leu
35 40 45
Gln Ala Arg Leu Tyr Ala Glu Gly Arg Gln Ala Leu Leu Ile Val Leu
50 55 60
Gln Gly Met Asp Thr Ala Gly Lys Asp Gly Thr Ile Arg His Val Phe
65 70 75 80
Arg Ala Val Asn Pro Gln Gly Val Arg Val Thr Ser Phe Lys Lys Pro
85 90 95
Thr Ala Leu Glu Leu Ala His Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Arg His
100 105 110
Ala Pro Ala Arg Gly Glu Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu
115 120 125
Asp Val Leu Val Val Arg Val His Glu Leu Val Pro Pro Glu Val Trp
130 135 140
Gly Arg Arg Tyr Asp His Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Ala Asp
145 150 155 160
Glu Gly Thr Arg Ile Val Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu
165 170 175
Gln Lys Arg Arg Leu Glu Ala Arg Leu Glu Asn Pro Arg Lys His Trp
180 185 190
Lys Phe Asn Pro Ala Asp Leu Ser Glu Arg Ala Arg Trp Gly Asp Tyr
195 200 205
Ala Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Ser Arg Thr Ser Ser Asp Arg Ala
210 215 220
Pro Trp Tyr Ala Val Pro Ala Asp Arg Lys Trp Gln Arg Asn Arg Ile
225 230 235 240
Val Ala Gln Val Leu Val Asp Ala Leu Glu Ala Met Asp Pro Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Val Asp Phe Asp Pro Ala Ser Val Arg Val Glu
260 265
<210> 9
<211> 290
<212> PRT
<213> 绿色玫瑰弯菌(Roseiflexus castenholzii)
<400> 9
Met Tyr Ala Gln Arg Val Val Pro Gly Met Arg Val Arg Leu His Asp
1 5 10 15
Ile Asp Pro Asp Ala Asn Gly Gly Leu Asn Lys Asp Glu Gly Arg Ala
20 25 30
Arg Phe Ala Glu Leu Asn Ala Glu Leu Asp Val Met Gln Glu Glu Leu
35 40 45
Tyr Ala Ala Gly Ile His Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Gly Met Asp
50 55 60
Thr Ala Gly Lys Asp Gly Ala Ile Arg Asn Val Met Leu Asn Leu Asn
65 70 75 80
Pro Gln Gly Cys Arg Val Glu Ser Phe Lys Val Pro Thr Glu Glu Glu
85 90 95
Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Val His Arg Val Val Pro Arg Lys
100 105 110
Gly Met Val Gly Val Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val
115 120 125
Val Arg Val His Ser Leu Val Pro Glu Ser Val Trp Arg Ala Arg Tyr
130 135 140
Asp Gln Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Ala Asp Thr Gly Thr Ile
145 150 155 160
Ile Val Lys Cys Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu Gln Glu Gln Arg
165 170 175
Leu Leu Ala Arg Glu Arg Asp Val Ser Lys Ala Trp Lys Leu Ser Ala
180 185 190
Gly Asp Trp Arg Glu Arg Ala Phe Trp Asp Asp Tyr Met Ala Ala Tyr
195 200 205
Glu Glu Ala Leu Thr Arg Cys Ser Thr Asp Tyr Ala Pro Trp Tyr Ile
210 215 220
Ile Pro Ala Asn Arg Lys Trp Tyr Arg Asp Leu Ala Ile Ser Glu Ala
225 230 235 240
Leu Val Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Trp Arg Arg Ala Leu
245 250 255
Asp Ala Met Ser Arg Ala Arg Arg Ala Glu Leu Glu Ala Phe Arg Ala
260 265 270
Glu Gln His Ala Met Glu Gly Arg Pro Gln Gly Ala Gly Gly Val Ser
275 280 285
Arg Arg
290
<210> 10
<211> 282
<212> PRT
<213> 玫瑰弯菌属(Roseiflexus sp)
<400> 10
Met His Tyr Ala His Thr Val Ile Pro Gly Thr Gln Val Arg Leu Arg
1 5 10 15
Asp Ile Asp Pro Asp Ala Ser Gly Gly Leu Thr Lys Asp Glu Gly Arg
20 25 30
Glu Arg Phe Ala Ser Phe Asn Ala Thr Leu Asp Ala Met Gln Glu Glu
35 40 45
Leu Tyr Ala Ala Gly Val His Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Gly Met
50 55 60
Asp Thr Ala Gly Lys Asp Gly Ala Ile Arg Asn Val Met His Asn Leu
65 70 75 80
Asn Pro Gln Gly Cys Arg Val Glu Ser Phe Lys Val Pro Thr Glu Glu
85 90 95
Glu Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Val His Lys Val Val Pro Arg
100 105 110
Lys Gly Met Val Gly Val Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu
115 120 125
Val Val Arg Val His Ser Leu Val Pro Glu His Val Trp Arg Ala Arg
130 135 140
Tyr Asp Gln Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Thr Asp Thr Gly Thr
145 150 155 160
Ile Ile Val Lys Cys Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu Gln Glu Lys
165 170 175
Arg Leu Leu Ala Arg Glu Gln Asp Val Thr Lys Ala Trp Lys Leu Ser
180 185 190
Ala Gly Asp Trp Arg Glu Arg Glu Arg Trp Asp Glu Tyr Met Ala Ala
195 200 205
Tyr Glu Glu Ala Leu Thr Arg Cys Ser Thr Glu Tyr Ala Pro Trp Tyr
210 215 220
Ile Ile Pro Ala Asn Arg Lys Trp Tyr Arg Asp Leu Ala Ile Ser Glu
225 230 235 240
Val Leu Val Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Trp Gln Arg Ala
245 250 255
Leu Asp Ala Met Ser Gln Ala Arg Leu Ala Glu Leu Lys Ala Phe Arg
260 265 270
His Gln Gln Thr Ala Gly Ala Thr Arg Leu
275 280
<210> 11
<211> 274
<212> PRT
<213> Truepera radiovictrix
<400> 11
Met Ser Gln Gly Ser Ala Lys Gly Leu Gly Lys Leu Asp Lys Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ala Arg Glu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Glu Leu Val Lys Leu Gln
20 25 30
Gly Trp Ile Lys Ala Gln Gly Leu Lys Val Val Val Leu Phe Glu Gly
35 40 45
Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Ser Thr Ile Thr Arg Ile Thr Gln Pro
50 55 60
Leu Asn Pro Arg Val Cys Arg Val Val Ala Leu Gly Ala Pro Thr Glu
65 70 75 80
Arg Glu Arg Thr Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Val His His Leu Pro
85 90 95
Ala Ala Gly Glu Met Val Leu Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala
100 105 110
Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Thr Glu Ala Glu Tyr Arg Glu
115 120 125
Phe Leu His Ala Cys Pro Thr Phe Glu Arg Leu Leu Leu Asp Ala Gly
130 135 140
Ile Ile Leu Ile Lys Tyr Trp Phe Ser Val Ser Ala Ala Glu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Arg Met Arg Arg Arg Asn Glu Asn Pro Ala Lys Arg Trp Lys Leu
165 170 175
Ser Pro Met Asp Leu Glu Ala Arg Ala Arg Trp Val Ala Tyr Ser Lys
180 185 190
Ala Lys Asp Ala Met Phe Tyr His Thr Asp Thr Lys Ala Ser Pro Trp
195 200 205
Tyr Val Val Asn Ala Glu Asp Lys Arg Arg Ala His Leu Ser Cys Ile
210 215 220
Ala His Leu Leu Ser Leu Ile Pro Tyr Glu Asp Leu Thr Pro Pro Pro
225 230 235 240
Leu Glu Met Pro Pro Arg Asp Leu Ala Gly Ala Asp Glu Gly Tyr Glu
245 250 255
Arg Pro Asp Lys Ala His Gln Thr Trp Val Pro Asp Tyr Val Pro Pro
260 265 270
Thr Arg
<210> 12
<211> 186
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)
<400> 12
Met Asp Val Gly Gln Ala Val Ile Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly
1 5 10 15
Lys Gly Thr Gln Ala Ser Arg Leu Ala Gln Glu Leu Gly Phe Lys Lys
20 25 30
Leu Ser Thr Gly Asp Ile Leu Arg Asp His Val Ala Arg Gly Thr Pro
35 40 45
Leu Gly Glu Arg Val Arg Pro Ile Met Glu Arg Gly Asp Leu Val Pro
50 55 60
Asp Asp Leu Ile Leu Glu Leu Ile Arg Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val
65 70 75 80
Ile Phe Asp Gly Phe Pro Arg Thr Leu Ala Gln Ala Glu Ala Leu Asp
85 90 95
Arg Leu Leu Ser Glu Thr Gly Thr Arg Leu Leu Gly Val Val Leu Val
100 105 110
Glu Val Pro Glu Glu Glu Leu Val Arg Arg Ile Leu Arg Arg Ala Glu
115 120 125
Leu Glu Gly Arg Ser Asp Asp Asn Glu Glu Thr Val Arg Arg Arg Leu
130 135 140
Glu Val Tyr Arg Glu Lys Thr Glu Pro Leu Val Gly Tyr Tyr Glu Ala
145 150 155 160
Arg Gly Val Leu Lys Arg Val Asp Gly Leu Gly Thr Pro Asp Glu Val
165 170 175
Tyr Ala Arg Ile Arg Ala Ala Leu Gly Ile
180 185
<210> 13
<211> 208
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)
<400> 13
Met Arg Gly Ile Val Thr Ile Asp Gly Pro Ser Ala Ser Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ser Val Ala Arg Arg Val Ala Ala Ala Leu Gly Val Pro Tyr Leu Ser
20 25 30
Ser Gly Leu Leu Tyr Arg Ala Ala Ala Phe Leu Ala Leu Arg Ala Gly
35 40 45
Val Asp Pro Gly Asp Glu Glu Gly Leu Leu Ala Leu Leu Glu Gly Leu
50 55 60
Gly Val Arg Leu Leu Ala Gln Ala Glu Gly Asn Arg Val Leu Ala Asp
65 70 75 80
Gly Glu Asp Leu Thr Ser Phe Leu His Thr Pro Glu Val Asp Arg Val
85 90 95
Val Ser Ala Val Ala Arg Leu Pro Gly Val Arg Ala Trp Val Asn Arg
100 105 110
Arg Leu Lys Glu Val Pro Pro Pro Phe Val Ala Glu Gly Arg Asp Met
115 120 125
Gly Thr Ala Val Phe Pro Glu Ala Ala His Lys Phe Tyr Leu Thr Ala
130 135 140
Ser Pro Glu Val Arg Ala Trp Arg Arg Ala Arg Glu Arg Pro Gln Ala
145 150 155 160
Tyr Glu Glu Val Leu Arg Asp Leu Leu Arg Arg Asp Glu Arg Asp Lys
165 170 175
Ala Gln Ser Ala Pro Ala Pro Asp Ala Leu Val Leu Asp Thr Gly Gly
180 185 190
Met Thr Leu Asp Glu Val Val Ala Trp Val Leu Ala His Ile Arg Arg
195 200 205
<210> 14
<211> 225
<212> PRT
<213> 强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400> 14
Met Arg Ile Val Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asn
1 5 10 15
Pro Asp Ile Asp Phe Ile Lys Glu Ile Ala Tyr Gln Leu Thr Lys Val
20 25 30
Ser Glu Asp His Glu Val Ala Val Val Val Gly Gly Gly Lys Leu Ala
35 40 45
Arg Lys Tyr Ile Glu Val Ala Glu Lys Phe Asn Ser Ser Glu Thr Phe
50 55 60
Lys Asp Phe Ile Gly Ile Gln Ile Thr Arg Ala Asn Ala Met Leu Leu
65 70 75 80
Ile Ala Ala Leu Arg Glu Lys Ala Tyr Pro Val Val Val Glu Asp Phe
85 90 95
Trp Glu Ala Trp Lys Ala Val Gln Leu Lys Lys Ile Pro Val Met Gly
100 105 110
Gly Thr His Pro Gly His Thr Thr Asp Ala Val Ala Ala Leu Leu Ala
115 120 125
Glu Phe Leu Lys Ala Asp Leu Leu Val Val Ile Thr Asn Val Asp Gly
130 135 140
Val Tyr Thr Ala Asp Pro Lys Lys Asp Pro Thr Ala Lys Lys Ile Lys
145 150 155 160
Lys Met Lys Pro Glu Glu Leu Leu Glu Ile Val Gly Lys Gly Ile Glu
165 170 175
Lys Ala Gly Ser Ser Ser Val Ile Asp Pro Leu Ala Ala Lys Ile Ile
180 185 190
Ala Arg Ser Gly Ile Lys Thr Ile Val Ile Gly Lys Glu Asp Ala Lys
195 200 205
Asp Leu Phe Arg Val Ile Lys Gly Asp His Asn Gly Thr Thr Ile Glu
210 215 220
Pro
225
<210> 15
<211> 207
<212> PRT
<213> 海栖热袍菌(Thermotoga maritima)
<400> 15
Met Lys Gly Gln Leu Phe Val Ile Cys Gly Pro Ser Gly Ala Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ser Ile Ile Lys Glu Val Leu Lys Arg Leu Asp Asn Val Val Phe
20 25 30
Ser Val Ser Cys Thr Thr Arg Pro Lys Arg Pro His Glu Glu Asp Gly
35 40 45
Lys Asp Tyr Phe Phe Ile Thr Glu Glu Glu Phe Leu Lys Arg Val Glu
50 55 60
Arg Gly Glu Phe Leu Glu Trp Ala Arg Val His Gly His Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Leu Arg Ser Phe Val Glu Ser His Ile Asn Glu Gly Lys Asp Val
85 90 95
Val Leu Asp Ile Asp Val Gln Gly Ala Leu Ser Val Lys Lys Lys Tyr
100 105 110
Ser Asn Thr Val Phe Ile Tyr Val Ala Pro Pro Ser Tyr Ala Asp Leu
115 120 125
Arg Glu Arg Ile Leu Lys Arg Gly Thr Glu Lys Glu Ala Asp Val Leu
130 135 140
Val Arg Leu Glu Asn Ala Lys Trp Glu Leu Met Phe Met Asp Glu Phe
145 150 155 160
Asp Tyr Ile Val Val Asn Glu Asn Leu Glu Asp Ala Val Glu Met Val
165 170 175
Val Ser Ile Val Arg Ser Glu Arg Ala Lys Val Thr Arg Asn Gln Asp
180 185 190
Lys Ile Glu Arg Phe Lys Met Glu Val Lys Gly Trp Lys Lys Leu
195 200 205
<210> 16
<211> 142
<212> PRT
<213> 风产液菌(Aquifex aeolicus)
<400> 16
Met Ala Val Glu Arg Thr Leu Ile Ile Val Lys Pro Asp Ala Met Glu
1 5 10 15
Lys Gly Ala Leu Gly Lys Ile Leu Asp Arg Phe Ile Gln Glu Gly Phe
20 25 30
Gln Ile Lys Ala Leu Lys Met Phe Arg Phe Thr Pro Glu Lys Ala Gly
35 40 45
Glu Phe Tyr Tyr Val His Arg Glu Arg Pro Phe Phe Gln Glu Leu Val
50 55 60
Glu Phe Met Ser Ser Gly Pro Val Val Ala Ala Val Leu Glu Gly Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ile Lys Arg Val Arg Glu Ile Ile Gly Pro Thr Asp Ser Glu
85 90 95
Glu Ala Arg Lys Val Ala Pro Asn Ser Ile Arg Ala Gln Phe Gly Thr
100 105 110
Asp Lys Gly Lys Asn Ala Ile His Ala Ser Asp Ser Pro Glu Ser Ala
115 120 125
Gln Tyr Glu Ile Cys Phe Ile Phe Ser Gly Leu Glu Ile Val
130 135 140
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<223> 最初转录的序列
<400> 17
gggagaccag gaatt 15

Claims (101)

1.一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：
(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；和
(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和
(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶、v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生mRNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码具有polyA尾的mRNA的DNA模板、viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中，任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶。
2.一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：
(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；和
(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和
(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体，和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶、v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码mRNA的DNA模板和viii)一种或多种加帽试剂；并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及
d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生mRNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物
或
(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生mRNA。
3.一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：
(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；和
(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和
(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体，和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶、v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码具有poly A尾的mRNA的DNA模板，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及
(d)从来自步骤(c)的所述反应混合物交换缓冲液并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
4.一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：
(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含5’核苷一磷酸；和
(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和
(c)将包含核苷一磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体，和任选地ii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iii)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、iv)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶、v)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽、未加尾RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码mRNA的DNA模板，并且进一步其中，任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及
d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生未加帽RNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物；
或
(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生未加帽RNA；以及
e)从来自步骤(c)的所述反应混合物交换缓冲液并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在(c)的其余步骤之前而不是同时进行步骤(c)(i)-(c)(v)以产生核苷酸三磷酸。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述加帽试剂是二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸加帽试剂。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞RNA是源自生物质。
8.如权利要求1-4中任一项所述的步骤(a)的方法，其中使RNA解聚为5’核苷一磷酸的所述酶是核酸酶P1。
9.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤(c)的所述第二反应混合物包含从产生所述PPK、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述脱氧核糖核酸(DNA)模板和/或所述RNA聚合酶的细胞获得的酶制剂。
10.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种胞苷一磷酸激酶来自嗜热栖热菌。
11.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种尿苷一磷酸激酶来自强烈火球菌。
12.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种鸟苷一磷酸激酶来自海栖热袍菌。
13.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种核苷二磷酸激酶来自风产液菌。
14.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述至少一种聚磷酸盐激酶是来自地热奇异球菌的III类聚磷酸盐激酶2。
15.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述磷酸供体是六偏磷酸盐。
16.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶是噬菌体T7 RNA聚合酶或其突变体。
17.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述DNA模板包含：i)编码所得mRNA的开放阅读框(ORF)的序列；和/或ii)转录启动子，iii)编码所得mRNA的5’非翻译区(5’UTR)的序列，iv)编码所得mRNA的3’非翻译区(3’UTR)的序列，以及任选地，限制性核酸内切酶的识别位点。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述DNA模板还包含编码一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)元件的序列。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述DNA模板是通过聚合酶链反应产生。
20.如权利要求17或18所述的方法，其中所述DNA模板在质粒上编码。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述质粒含有编码一种或多种mRNA的一种或多种DNA模板。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中使用限制性核酸内切酶使所述质粒DNA线性化。
23.如权利要求22所述的方法，其中使用IIS型限制性核酸内切酶使所述质粒DNA线性化。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中在线性化之前或之后纯化所述质粒DNA和/或限制性核酸内切酶。
25.如权利要求2或4所述的方法，其中所述poly(A)聚合酶是热稳定的。
26.如权利要求3或4所述的方法，其中步骤3d或4e的所述一种或多种加帽酶具有磷酸酶活性、甲基转移酶活性和/或鸟苷酰基转移酶活性。
27.如权利要求3或4所述的方法，其中所述甲基供体是S-腺苷甲硫氨酸。
28.如权利要求3或4所述的方法，其中所述一种或多种加帽酶是源自牛痘病毒和/或蓝舌病毒。
29.如权利要求3或4所述的方法，其中所述一种或多种加帽酶具有磷酸酶活性。
30.如权利要求3或4所述的方法，其中所述一种或多种加帽酶具有甲基转移酶活性。
31.如权利要求3或4所述的方法，其中所述一种或多种加帽酶具有鸟苷酰基转移酶活性。
32.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中包含PPK、任选的NMP激酶、任选的NDP激酶、任选地包含限制性核酸内切酶识别位点的脱氧核糖核酸(DNA)模板、RNA聚合酶、polyA聚合酶和/或加帽酶的所述第二反应混合物由一种或多种细胞裂解物制备，其中当存在于所述细胞裂解物中时，不需要的酶活性被消除、灭活或部分灭活。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述不需要的酶活性通过物理分离消除或通过热处理灭活或部分灭活。
34.如权利要求33所述的方法，其中使所述酶灭活或部分灭活的温度介于70℃与95℃之间。
35.如权利要求33所述的方法，其中使所述酶灭活或部分灭活的温度等于或大于55℃。
36.如权利要求32所述的方法，其中所述第二反应混合物包含通过色谱法从细胞裂解物纯化的一种或多种酶。
37.如权利要求32所述的方法，其中使用色谱法使所述加帽酶与不需要的酶活性分离。
38.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过过滤、提取、沉淀或色谱法来纯化所述mRNA。
39.如权利要求38所述的方法，其中通过氯化锂沉淀进一步纯化所述mRNA。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中通过高效液相色谱法进一步纯化所述mRNA。
41.一种mRNA，所述mRNA通过权利要求1-40中任一项所述的方法产生。
42.一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：
(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；
(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和
(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生mRNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码具有polyA尾的mRNA的DNA模板、viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶。
43.一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：
(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；和
(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和
(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体，和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶、vii)至少一种编码mRNA的DNA模板、viii)一种或多种加帽试剂，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及
d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生mRNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物
或
(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生mRNA。
44.一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：
(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；
(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；
(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶，并且进一步其中在产生未加帽RNA的条件下添加vi)至少一种RNA聚合酶和vii)至少一种编码具有poly A尾的mRNA的DNA模板，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加viii)至少一种脱氧核糖核酸酶；以及
(d)从来自步骤(c)的所述反应混合物交换缓冲液并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
45.一种用于合成真核信使核糖核酸(mRNA)的无细胞反应方法，所述方法包括：
(a)将细胞RNA和一种或多种使RNA解聚的酶在反应混合物中在所述细胞RNA基本上解聚的条件下孵育，其中所得的第一反应混合物包含核苷二磷酸；和
(b)在使所述RNA解聚酶消除或灭活的条件下处理所述反应混合物；和
(c)将包含核苷二磷酸的所述反应混合物与第二反应混合物在产生核苷酸三磷酸的条件下孵育，所述第二反应混合物包含i)至少一种聚磷酸盐(PPK)激酶和磷酸供体；和任选地ii)至少一种核苷二磷酸(NDP)激酶，和任选地iii)至少一种胞苷一磷酸(CMP)激酶、iv)至少一种尿苷一磷酸(UMP)激酶、v)至少一种鸟苷一磷酸(GMP)激酶、vi)，并且进一步其中在产生未加帽、未加尾RNA的条件下添加vii)至少一种RNA聚合酶和viii)至少一种编码mRNA的DNA模板，并且进一步其中任选地在RNA产生后在消化DNA的条件下添加ix)至少一种脱氧核糖核酸酶；
(d)(i)在polyA聚合酶和ATP存在下，在产生未加帽RNA的条件下进一步孵育在步骤(c)中产生的所述反应混合物；
或
(ii)通过灭活或物理分离从步骤(c)的所述反应混合物中除去所述RNA聚合酶，然后通过在polyA聚合酶和ATP存在下进一步孵育所述反应混合物来产生未加帽RNA；以及
e)从来自步骤(c)的所述反应混合物交换缓冲液并在加帽酶、GTP和甲基供体存在下孵育所述反应混合物以产生mRNA。
46.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中在(c)的其余步骤之前而不是同时进行步骤(c)(i)-(c)(v)以产生核苷酸三磷酸。
47.如权利要求42或43所述的方法，其中所述加帽试剂是二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸加帽试剂。
48.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述细胞RNA是源自生物质。
49.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述RNA解聚酶是产生5’核苷二磷酸(NDP)的核糖核酸酶。
50.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中使RNA解聚为5’核苷二磷酸的所述酶是PNPase。
51.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中步骤(c)的所述第二反应混合物包含从产生PPK、NDP激酶、NMP激酶、脱氧核糖核酸(DNA)模板和/或所述RNA聚合酶的细胞获得的酶制剂。
52.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述至少一种胞苷一磷酸激酶来自嗜热栖热菌。
53.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述至少一种尿苷一磷酸激酶来自强烈火球菌。
54.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述至少一种鸟苷一磷酸激酶来自海栖热袍菌。
55.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述至少一种核苷二磷酸激酶来自风产液菌。
56.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述至少一种聚磷酸盐激酶是来自地热奇异球菌的III类聚磷酸盐激酶2。
57.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述磷酸供体是六偏磷酸盐。
58.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶是噬菌体T7 RNA聚合酶或其突变体。
59.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述DNA模板包含：i)编码所得mRNA的开放阅读框(ORF)的序列；和/或ii)转录启动子，iii)编码所得mRNA的5’非翻译区(5’UTR)的序列，iv)编码所得mRNA的开放阅读框(ORF)的序列，v)编码所得mRNA的3’非翻译区(3’UTR)的序列，和/或任选地，限制性核酸内切酶的识别位点。
60.如权利要求59中任一项所述的方法，其中所述DNA模板还包含编码一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)元件的序列。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中所述DNA模板是通过聚合酶链反应产生。
62.如权利要求59或60所述的方法，其中所述DNA模板在质粒上编码。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述质粒含有编码一种或多种mRNA的一种或多种DNA模板。
64.如权利要求62或63所述的方法，其中使用限制性核酸内切酶使所述质粒DNA线性化。
65.如权利要求64所述的方法，其中使用IIS型限制性核酸内切酶使所述质粒DNA线性化。
66.如权利要求64或65所述的方法，其中在线性化之前或之后纯化所述质粒DNA和/或限制性核酸内切酶。
67.如权利要求43或45所述的方法，其中所述poly(A)聚合酶是热稳定的。
68.如权利要求44或45所述的方法，其中步骤44d或45e的所述一种或多种加帽酶具有磷酸酶活性、甲基转移酶活性和/或鸟苷酰基转移酶活性。
69.如权利要求44或45所述的方法，其中所述甲基供体是S-腺苷甲硫氨酸。
70.如权利要求44或45所述的方法，其中所述一种或多种加帽酶是源自牛痘病毒和/或蓝舌病毒。
71.如权利要求44或45所述的方法，其中所述一种或多种加帽酶具有磷酸酶活性。
72.如权利要求44或45所述的方法，其中所述一种或多种加帽酶具有甲基转移酶活性。
73.如权利要求44或45所述的方法，其中所述一种或多种加帽酶具有鸟苷酰基转移酶活性。
74.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中包含所述PPK、任选的所述NMP激酶、任选的所述NDP激酶、任选地包含限制性核酸内切酶识别位点的所述脱氧核糖核酸(DNA)模板、所述RNA聚合酶、所述polyA聚合酶和/或所述加帽酶的所述第二反应混合物由一种或多种细胞裂解物制备，其中当存在于所述细胞裂解物中时，不需要的酶活性被消除、灭活或部分灭活。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述不需要的酶活性通过物理分离消除或通过热处理灭活或部分灭活。
76.如权利要求75所述的方法，其中使所述酶灭活或部分灭活的温度介于70℃与95℃之间。
77.如权利要求75所述的方法，其中使所述酶灭活或部分灭活的温度等于或大于55℃。
78.如权利要求32或74所述的方法，其中所述RNA聚合酶带有六组氨酸标签并通过固定化金属亲和色谱法纯化。
79.如权利要求74所述的方法，其中使用色谱法使所述加帽酶与不需要的酶活性分离。
80.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过过滤、提取、沉淀或色谱法来纯化所述mRNA。
81.如权利要求80所述的方法，其中通过氯化锂沉淀进一步纯化所述mRNA。
82.如权利要求80或81所述的方法，其中通过高效液相色谱法进一步纯化所述mRNA。
83.如权利要求38-40或权利要求80-82中任一项所述的方法，其中使用反相离子对高效液相色谱法进一步纯化所述mRNA。
84.一种mRNA，所述mRNA通过权利要求42-83中任一项所述的方法产生。
85.如权利要求1-40或42-83中任一项所述的方法，其中将通过除步骤(a)和(b)以外的方式产生的核苷酸添加至步骤(c)的所述反应混合物，从而消除对步骤(a)和(b)的需要。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述核苷酸包括NMP、NDP、NTP或它们的混合物。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述核苷酸由一种或多种未修饰的核苷酸、修饰的核苷酸或其混合物组成。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述核苷酸由一种或多种未修饰的NMP和一种或多种修饰的NTP组成，以产生一种或多种未修饰的核苷酸被修饰的核苷酸100％替代的mRNA。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述核苷酸包含未修饰的AMP、CMP和GMP以及假尿苷三磷酸(假UTP)。
90.如权利要求88所述的方法，其中所述核苷酸包含未修饰的AMP和具有假UTP的GMP以及5-甲基胞苷三磷酸(5-甲基CTP)。
91.如权利要求87所述的方法，其中所述核苷酸包含含有未修饰的AMP、CMP、UMP和具有假UTP的GMP和/或5-甲基CTP中的一者或多者的混合物。
92.如权利要求1-91中任一项所述的方法，其中将修饰的核苷酸添加至细胞RNA来源的核苷酸以实现部分修饰的mRNA。
93.如权利要求2、4、43或45步骤(c)或步骤(d)中任一项所述的方法，其中直接添加ATP。
94.如权利要求2、4、43或45步骤(c)或步骤(d)中任一项所述的方法，其中在PPK存在下添加纯化的AMP或ADP加磷酸供体以产生ATP。
95.如权利要求2、4、43或45步骤(c)或步骤(d)中任一项所述的方法，其中在PPK存在下源自细胞RNA的AMP或ADP和磷酸供体以产生ATP。
96.如权利要求3d、4e、44d或45e中任一项所述的方法，其中直接添加所述GTP。
97.如权利要求3d、4e、44d或45e中任一项所述的方法，其中在一种或多种激酶存在下纯化的GMP或GDP加磷酸供体以产生GTP。
98.如权利要求3d、4e、44d或45e中任一项所述的方法，其中在一种或多种激酶存在下源自细胞RNA的GMP或GDP和磷酸供体以产生GTP。
99.如权利要求9或51所述的方法，其中步骤(c)的所述第二反应混合物包含从产生PPK、NDP激酶、NMP激酶、脱氧核糖核酸(DNA)模板和/或所述RNA聚合酶的细胞获得的细胞裂解物。
100.如权利要求7或48所述的方法，其中所述生物质包括酵母。
101.一种mRNA，所述mRNA通过权利要求85-100中任一项所述的方法产生。
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