KR20220004057A - 리보핵산의 무세포 생산 - Google Patents

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KR20220004057A
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reaction mixture
kinase
mrna
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KR1020217035335A
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오드리 제이. 자루르
드류 에스. 쿤닝햄
제임스 알. 애브셔
라칫 제인
마이클 이. 허드슨
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그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 핵산, 특별하게는 RNA 및 구체적으로는 메신저 RNA(mRNA)의 시험관내 생산에 관한 것이다.

Description

리보핵산의 무세포 생산
관련출원
본 출원은 미국 가출원 제62/826,983호(출원일: 2019년 3월 29일)에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 이의 전문이 본 명세서에 원용된다.
본 발명은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 출원 제PCT/US2018/05535호(출원일: 2018년 10월 11일, 발명의 명칭: "Methods and Compositions for Nucleoside Triphosphate and Ribonucleic Acid Production")에 개시된 방법에 관한 것이다.
기술분야
본 발명은 핵산, 특별하게는 RNA 및 구체적으로는 메신저 RNA(mRNA) 및 구체적으로는 진핵생물 mRNA의 시험관내 생산에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 시약 및 방법은 저비용, 고효율 및 상업적으로 유용한 규모로 mRNA의 시험관내 생산을 가능하게 한다.
리보핵산 (RNA)은 생명체 어디에든 존재하고, 단백질의 조절 및 합성을 위한 DNA로부터의 지시를 운반하는, 세포에서의 정보의 핵심적 메신저로서 작용한다. RNA는 생명공학에서 흥미로운데, 그 이유는 세포에서 mRNA 수준을 합성적으로 조절하는 것이 농업 작물 보호, 항암 치료제, 유전자 요법, 백신, 면역계 조절, 질환 검출 및 동물 건강과 같은 분야에서 응용되기 때문이다. 기능적 단일-가닥(예를 들어, mRNA) 및 이중-가닥 RNA 분자는 살아있는 세포에서 그리고 정제된 재조합 효소 및 정제된 뉴클레오타이드 트라이포스페이트를 사용하여 시험관내에서 생산되었다(예를 들어, 유럽 특허 제1631675호, 미국 특허 출원 공개 제2014/0271559 A1호 및 제PCT/US2018/05535호 참조, 이들의 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨). 그럼에도 불구하고, 광범위한 상업적 응용을 가능하게 하는 규모에서의 RNA 및 구체적으로 mRNA의 생산은 현재 비용이 엄청나게 높다.　더 저렴하고; 더 신속하고; 바람직하게는 제품 안전과 품질에 도움이 되도록 공정을 보다 확실하게 제어할 수 있는 수단으로 특수 시약의 외부 공급업체가 필요 없이, 쉽게 실행할 수 있고; 선행 기술 방법과 대등한 양과 등급의 RNA, 구체적으로 mRNA를 생산하기 위한 방법이 필요하다.
본 명세서에는 상업적으로 유용한 양 및 비용으로 시험관내에서 RNA, 특별하게는 mRNA를 생산하기 위한 시약 및 방법이 제공된다.
하기에 기재된 바와 같이, 일 양상에서, 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(messenger ribonucleic acid: mRNA)을 합성하기 위한 무세포(cell-free) 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 세포 RNA가 실질적으로 해중합(depolymering)되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및 (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제, 및 v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형 및 viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
제2 양상에서, 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제, v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형 및 viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나 또는 (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 상기 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제3 양상에서, 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액 조건을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제4 양상에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소 및 vii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된, 테일이 없는(untailed) RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나; 또는 (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 상기 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 비캡핑된 RNA를 생산하는 단계; 및 (e) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액 조건을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제5 양상에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및 (c) 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형 및 viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
제6 양상에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형; 및 viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나 또는 (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제7 양상에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소 및 vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고; 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액 조건을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제8 양상에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된, 테일이 없는 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (d) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나; 또는 (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 상기 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 비캡핑된 RNA를 생산하는 단계; 및 (e) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액 조건을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 청구범위와 함께 하기 상세한 설명으로부터 보다 완전하게 이해될 것이다. 청구범위의 범주는 청구범위에서의 설명에 의해서 정의되며, 본 설명에 제시된 특징 및 이점의 구체적인 논의에 의해서 정의되지 않는다는 것이 주목된다.
도 1. mRNA를 생산하기 위한 방법. 1A) 캡핑 시약을 통해 DNA 주형 및 캡핑에 암호화된 PolyA 테일; B) 캡핑 시약을 통한 PolyA 테일 및 캡핑의 효소적 첨가; C) 캡핑 효소를 통해 DNA 주형 및 캡핑에 암호화된 PolyA 테일; 및 (d) 캡핑 효소를 통한 PolyA 테일 및 캡핑의 효소적 첨가.
도 2. RNA 생산을 위한 생합성 경로. 출발 물질로서 세포 RNA를 사용하여 NTP 및 하류 RNA를 생산하기 위한 생합성 경로가 도시되어 있다. 이 경로에서, 리보뉴클레아제를 사용하여 세포 RNA를 NMP 또는 NDP로 분해시킨다(도 2b).
도 3. RNA 생성물 1. RNA 중합효소를 포함하는 반응에서 생산된 RNA 생성물 및 해중합(- NMP)에 의해서 생산된 NMP 또는 정제된 NMP(+ NMP, 각각 4mM)의 아가로스겔을 도시한다. 약어: - 2log: 2-log DNA 래더(뉴 잉글랜드 바이오랩스사(New England Biolabs)), NMP: 5'-NMP, RNA Pol의 동일몰 혼합물: 열안정성 T7 RNA 중합효소, 주형 1: 선형 DNA 주형, 주형 2: 플라스미드 DNA 주형.
도 4. RNA 생성물 2. RNA 중합효소를 포함하는 반응에서 생산된 RNA 생성물 정제된 RNA의 해중합에 의해서 생산된 NMP의 아가로스겔을 도시한다. 음성 대조군으로서, 반응을 RNA 중합효소의 부재 하에서 수행하였다. 약어: - 2log: 2-log DNA 래더(뉴 잉글랜드 바이오랩스사), NMP: 5'-뉴클레오사이드 모노포스페이트의 동일몰 혼합물, RNA Pol: 열안정성 T7 RNA 중합효소, 주형 1: 선형 DNA 주형, 주형 2: 플라스미드 DNA 주형.
도 5. RNA 생성물 3. 37℃에서 야생형 중합효소(W) 또는 열안정성 중합효소 돌연변이체(T)를 사용하여 무세포 RNA(CFR) 합성에 의해서 생산된 RNA 생성물의 아가로스겔이 도시된다. 약어: - 2log: 2-log DNA 래더 (뉴 잉글랜드 바이오랩스사), W: 야생형 T7 RNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스사), T: 열안정성 T7 RNA 중합효소, 주형 1: 선형 DNA 주형, 주형 2: 플라스미드 DNA 주형.
도 6. 시간 경과에 따라서 생산된 뉴클레오타이드. 정제된 RNase R 또는 뉴클레아제 P1을 사용하여 다양한 RNA 공급원의 해중합 동안 시간 경과에 따라서 생산된 산-용해성 뉴클레오타이드(mM)의 그래프. 산-용해성 뉴클레오타이드를 UV 흡광도에 의해서 측정하였다.
도 7. 뉴클레아제 P1에 의해서 생산된 입수 가능한 NMP. 뉴클레아제 P1을 사용하여 이. 콜라이(E. coli) 또는 효모로부터의 RNA의 해중합 동안 시간 경과에 따라서 생산된 입수 가능한 5'-NMP의 백분율의 그래프를 도시한다. 입수 가능한 5'-NMP의 백분율을 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)에 의해서 결정하였다.
도 8. 상이한 용해물 온도의 분석. 이. 콜라이로부터의 용해물의 상이한 온도에 걸친 RNA 해중합에 대한 뉴클레오믹(Nucleomic) 프로파일. 20개 분석물의 누적 농도를 도시한다. 뉴클레오사이드를 백색 얼룩 패턴으로 도시하고, 최소로 생산된다. 50℃에 대한 데이터를 수집하였지만, 도시하지 않는다.
도 9. NTP의 무세포 합성의 분석. NTP의 무세포 합성이 48℃에서 1시간 인큐베이션이 제공된 후에 뉴클레오타이드 공급원에도 불구하고 유사한 NTP 역가를 초래한 것을 나타낸 그래프. 뉴클레오타이드의 각각의 공급원(세포 RNA, 정제된 NMP 또는 정제된 NDP)의 경우, 대략 4mM의 각각의 뉴클레오타이드를 제공하기에 충분한 기질의 양을 반응에 첨가하였다. 예를 들어, NDP를 갖는 반응은 각각의 ADP, CDP, GDP 및 UDP를 4mM 포함하였다.
도 10. CFR mRNA형질주입ed HeLa 세포에서 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현. 시험관내 전사에 의해서 생산된 mRNA를 대조군으로서 제공한다. 형광 현미경 영상을 도시한다.
도 11. 상이한 미번역 영역(UTR)을 갖는 mRNA로부터 초래한 GFP 발현의 정량. 상대 형광 단위(RFU)를 나타낸다. UTR 공급원 유전자: HSD, 5' 하이드록시스테롤 데하이드로게나제, 3' 알부민; COX, 5' 시토크롬 옥시다제, 3' 알부민; HBG, 5', 3' 인간 β-글로빈; XBG, 5', 3' 제노프스(Xenopus) β-글로빈.
도 12. mRNA의 모세관 겔 전기영동. 관심 mRNA 종을 나타내는 총 핵산의 각각의 샘플에서의 백분율과 함께, 시험관내 전사(IVT) 및 CFR에 의해서 생산된 mRNA에 대한 모세관 겔 전기영동 결과를 도시한다.
도 13. CFR 또는 IVT-생산된 RNA에서 mRNA. 면역블롯을 도시한다. Ref, 상업적으로 입수 가능한 참조 mRNA.
도 14. mRNA 제제의 엔도톡신 분석. ㎖당 엔도톡신 단위(EU)를 나타낸다.
도 15. 역상 이온쌍 고성능 액체 크로마토그래피 후 mRNA의 수율 및 조성. 관심 mRNA 종을 나타내는 핵산의 백분율(상단) 및 전체 순도(샘플 중의 핵산 % Х 관심 종인 % 핵산, 하단)과 함께, 핵산, 단백질, 염, 미반응 NMP 및 다른 건조 고체의 크로마토그램 및 질량 백분율의 분석을 샘플에 대해서 나타낸다.
도 16. CFR mRNA를 사용하여 HeLa 추출물에서 헤마글루티틴(HA)의 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)-정량화 생산. 농도를 ng/㎖로 나타낸다. HBG(5', 3' 인간 β-글로빈) 및 XBG(5', 3' 제노프스 β-글로빈)는 상이한 UTR을 나타낸다. 조 샘플 및 HPLC-정제된 샘플 둘 다를 나타낸다.
도 17. CFR mRNA를 사용한 HeLa 추출물에서 HA의 생산의 웨스턴 블롯. 시험관내 전사를 통해서 생산된 mRNA로부터의 생산에 대한 비교를 나타낸다. 화살표는 HA 단백질의 예측 크기(63kDa)를 강조한다.
도 18. CFR mRNA를 사용한 HeLa 추출물에서 파이어플라이 루시퍼라제 발현의 루미네선스 정량화. HBG(5', 3' 인간 β-글로빈) 및 XBG (5', 3' 제노프스 β-글로빈)는 상이한 UTR을 나타낸다. -mRNA, RNA 없음(음성 대조군).
도 19. CFR mRNA를 사용한 HeLa 세포에서 파이어플라이 루시퍼라제 발현의 루미네선스 정량화. HBG(1) 및 HBG(2)는 제시된 바와 같이, 리포펙타민의 높은 수준 및 낮은 수준을 나타낸다. 다수의 시간 지점을 나타낸다.
도 20. CFR mRNA를 사용한 마우스에서 루시퍼라제 발현의 생체내 영상화 시스템(IVIS) 영상. LNP, 지질 나노입자. GenVoy, 상업적인 제형. 화살표는 루시퍼라제의 발현을 나타내는 루미네선스의 영역을 강조한다.
도 21. CFR mRNA를 사용한 생체내에서 루시퍼라제 발현의 루미네선스 정량화. 투여 후 0 내지 72시간의 측정을 IVT mRNA로부터의 결과에 대해서 나타낸다(표지 참조).
도 22. ARCA 캡핑을 갖는 뉴클레오사이드-변형된 mRNA. (A) CFR-생산된 mRNA 대 IVT 생산된 mRNA의 순도; (B) 뉴클레오사이드 변형 및 캡핑의 정량화(GLB - 그린라이트 바이오사; IVT - 시험관내 전사).
도 23. 마우스에서 표적 유전자 발현. D-루시페린의 주사 후 5, 24, 48 및 72시간에 표적 유전자 발현. 유전자 발현은 BALB/c 마우스(n=10/군, IM)에 0.2㎍ 용량(좌측) 및 1㎍ 용량으로 mRNA 소유권이 있는 지질 나노입자 제형을 제형화함으로써 달성되었다.
도 24. 마우스에서의 혈청 면역. 30㎍ 및 3㎍ 용량의 혈구응집소 mRNA로 처리된 마우스로부터의 역가 대 불활성화 H1N1로 처리된 양성 대조군 마우스로부터의 역가. 원은 후속 시험감염 연구를 위해서 선택된 마우스를 나타낸다.
도 25. 체중 변화. HA mRNA(30㎍) 또는 불활성화 H1N1이 투여된 마우스는 인플루엔자-연관 체중 손실로부터 보호된 반면, 미처리 마우스(원) 및 FLuc mRNA로 처리된 마우스(30㎍; 사각형)는 체중 감소를 나타내었다.
도 26. RNA 생산. (A) 비캡핑된 IVT-생산된 mRNA(참조군)의 전기영동도(electropherogram); (B) 세포 RNA-유래된 뉴클레오타이드를 사용한 CFR-생산된 mRNA의 전기영동도; 및 (C) 정제된 뉴클레오사이드 모노포스페이트의 동일몰량의 혼합물(각각 5mM)을 사용한 비캡핑된 CFR-생산된 mRNA의 전기영동도.
도 27. CFR-생산된 mRNA 및 polyA 테일 길이. 0, 50, 100 또는 150개 뉴클레오타이드 길이의 polyA 테일을 갖는 CFR-생산된 mRNA의 오버레이 전기영동도.
본 명세서에는 RNA 및 구체적으로는 메신저 RNA(mRNA) 및 보다 구체적으로는 진핵생물 mRNA의 무세포 생산(생합성)을 위한 방법, 조성물, 세포, 작제물 및 시스템이 제공된다. 하기에 추가로 구체적으로 언급된 바와 같은 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 RNA를 위한 빌딩 블록을 공급하기 위해서 저비용의 규모 확대 가능한 출발 물질(또는 "바이오매스")을 사용하여 무세포 RNA(CFR)를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 하기에 추가로 구체적으로 언급된 바와 같은 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 하기 일반적으로 기재된 개시된 방법의 단계를 포함한다.
세포 RNA의 뉴클레오사이드 모노포스페이트로의 전환
RNA의 뉴클레오사이드 모노포스페이트 "빌딩 블록"을 생산하기 위해서, 세포(내인성) RNA를 무세포 반응 혼합물에서 세포 RNA(특히 리보솜 또는 rRNA; 메신저 또는 mRNA; 및 트랜스퍼 RNA 또는 tRNA를 포함함)를 이의 구성성분 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP)로 해중합시키는 1종 이상의 효소와 인큐베이션시킨다. 특정 실시형태에서, RNA 해중합 효소는 세포 RNA를 5'-NMP로 해중합시키는 리보뉴클레아제(예를 들어, 뉴클레아제 P1, RNase R)이다. RNA의 공급원으로서의 세포는 뉴클레아제를 발현하도록 조작될 수 있거나, 또는 뉴클레아제는 분리된 세포에 의해서 생산되고, 반응에 도입될 수 있다. 예를 들어, 효모로부터의 세포 RNA는 페니실리엄 시트리넘(Penicillium citrinum)에 의해서 생산된 뉴클레아제 P1에 의해서 해중합될 수 있다. 뉴클레아제 P1은 단일-가닥 RNA 및 DNA를 RNA로 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트로 가수분해시키는 아연-의존성 단일-뉴클레아제이다. 이 효소는 염기 특이성이 없다.
그 후(즉, 세포 RNA가 해중합된 경우), 뉴클레아제는 일부 실시형태에서 (예를 들어, 물리적 분리, 예컨대, 여과, 침전, 포획 및/또는 크로마토그래피에 의해서) 제거되거나 또는 (예를 들어, 온도, pH, 염, 세제, 알코올 또는 다른 용매 및/또는 화학 저해제에 의해서) 불활성화된다. 본 명세서에 기재된 RNA 합성 방법을 시험관내 전사(IVT)의 RNA 합성 방법과 대조하기 위해서, 본 명세서에 기재된 RNA 합성 방법을 "무세포" RNA 합성으로 나타낸다. IVT 방법은 또한 기술적으로 무세포이지만, 이 방법은 삼인산화된 뉴클레오타이드 기질의 직접 추가에 의존하므로, 추가 에너지가 필요하지 않다. 용어 "무세포"는 대조적으로 삼인산화될 필요가 없는 뉴클레오타이드 기질(예를 들어, 5'-뉴클레오사이드 모노포스페이트 및/또는 뉴클레오사이드 다이포스페이트)을 허용하는 RNA 합성 방법을 나타내기 위해서 사용되는데, 그 이유는 이 방법이 키나제 효소(또는 효소) 및 에너지 공급원(예를 들어, 포스페이트 공여자, 예컨대, 폴리포스페이트 또는 헥사메타포스페이트)를 제공하여 더 낮은 인산화도의 뉴클레오타이드를 각각의 삼인산화된 형태로 전환시키기 때문이다.
세포 RNA의 뉴클레오사이드 다이포스페이트로의 전환
다른 실시형태에서, 세포 RNA를 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP)로 해중합시킨다. 대안적인 실시형태에서, RNA 해중합 효소는 포스페이트의 존재 하에서 세포 RNA를 NDP로 해중합시키는 리보뉴클레아제(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 포스포릴라제(PNPase))이다. RNA의 공급원으로서의 세포를 세포-특이적 뉴클레아제를 발현하도록 조작할 수 있거나, 또는 뉴클레아제를 분리된 세포에 의해서 생산하고, 반응에 도입할 수 있다. 그 후(즉, 세포 RNA가 해중합된 경우), 뉴클레아제를 일부 실시형태에서 (예를 들어, 물리적 분리, 예컨대, 여과, 침전, 포획 및/또는 크로마토그래피에 의해서) 제거하거나 또는 (예를 들어, 온도, pH, 염, 세제, 알코올 또는 다른 용매 및/또는 화학 저해제에 의해서) 불활성화시킨다.
뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산
해중합 후, 무세포 반응 혼합물을 복수의 키나제 효소(뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제 포함) 또는 키나제 효소의 혼합물을 사용하여 NMP 또는 NDP의 NTP(뉴클레오사이드 트라이포스페이트)로의 인산화를 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시키는데, 일부 실시형태에서 키나제 효소는 혼합물 중의 개별 NMP(즉, AMP, GMP, CMP 및 UMP), 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제(NDK) 및 폴리포스페이트 키나제(PPK) 각각을 인산화시키는 데 특이적이다. 해중합 반응이 NDP를 생산하는 경우(예를 들어, PNPase를 사용하는 경우), 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제(NDK), 폴리포스페이트 키나제(PPK) 및 선택적으로, 1종 이상의 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제로 이루어져서 NDK 및 PPK를 사용한 가역적인 반응을 통해서 생성된 임의의 NMP를 구조할 것이다. 키나제는 발효물에서(예를 들어, 이. 콜라이 세포에서) 높은 역가로 생산될 수 있다. 이어서 세포를 (예를 들어, 고압 균질화를 사용하여) 용해시켜 키나제를 함유하는 세포 추출물을 생성시킬 수 있다. 이어서 세포 추출물에 존재하는 바람직하지 않은 효소 활성(특히, 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소 및/또는 가수분해효소)을, 키나제 활성을 불활성화시키지 않으면서, 예를 들어, 가열에 의해서, 키나제-함유 세포 추출물로부터 제거하고(즉, 제거하거나 불활성화시키고); 열을 사용하여 이러한 바람직하지 않은 효소 활성을 불활성화시키는 특정 실시형태에서 키나제는 이의 열안정성 변이체여서 키나제 활성을 함유하는 제제를 초래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 바람직하지 않은 효소 활성을 (예를 들어, 물리적 분리, 예컨대, 여과, 침전, 포획 및/또는 크로마토그래피에 의해서) 제거하거나 또는 (예를 들어, 온도, pH, 염, 세제, 알코올 또는 다른 용매 및/또는 화학 저해제에 의해서) 불활성화시킨다. 이어서 NMP 또는 NDP를 에너지 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트, 예컨대, 헥사메타포스페이트)의 존재 하에서 제제와 인큐베이션시켜 무세포 반응 혼합물에서 NTP를 생산한다. 최소한, PPK 및 에너지 공급원이 NMP 또는 NDP를 NTP로 전환시키는 데 필요하다. 선택적으로, 개별 NMP 각각에 특이적인 NDK 및 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제를 포함시킨다.
RNA로의 중합
상기에 기재된 바와 같이 생산된 NTP를 RNA 중합효소(예를 들어, 박테리오파지 T7 RNA 중합효소) 및 조작된 주형(예를 들어, DNA 주형, 조작된 세포에 의해서 발현되고 무세포 반응 혼합물의 세포 성분으로서 포함되거나 또는 무세포 반응 혼합물에 추후에 첨가됨)을 사용하여 RNA(동일한 반응 혼합물로 또는 개별 반응 혼합물로)로 순차적으로 또는 동시에 중합시킬 수 있다. 진핵생물 mRNA를 생산하기 위한 일부 실시형태에서, DNA 주형을 제공하고, 여기서 주형에 암호화된 서열의 3' 말단은 폴리아데닐레이트 서열이 뒤따라서, 생성된 RNA는 진핵생물 mRNA의 특징인 폴리아데닐레이트(polyA) 테일을 함유한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 테일이 없는은 "polyA 테일이 결여된 RNA"를 기재하는 데 사용된다. 대안적으로, 주형에 암호화된 서열의 3' 말단에 위치된 폴리아데닐레이트 서열을 암호화하지 않는 DNA 주형에서, polyA 중합효소를 첨가하고, ATP의 존재 하에서 인큐베이션시킴으로써 polyA 테일을 효소적으로 첨가할 수 있다. ATP는 직접 첨가될 수 있거나, 또는 폴리포스페이트 키나제 및 폴리포스페이트를 사용하여 AMP 및/또는 ADP를 인산화시킴으로써 생산될 수 있다. 진핵생물 mRNA 생산은 하기에 보다 상세하게 제시된 바와 같이, 당업계에 공지된 캡핑 효소 또는 캡핑 시약을 사용하여 달성될 수 있는 5' 캡의 첨가를 추가로 수반한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 비캡핑된은 캡이 결어된 RNA를 의미한다.
합성될 RNA
하기에 기재된 바와 같이, 일 실시형태에서, 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및 (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형, viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
제2 실시형태에서, 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) 테일이 없는 RNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형 및 viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나 또는 (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 상기 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제3 실시형태에서, 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액 조건을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제4 실시형태에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;　(b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된, 테일이 없는(untailed) RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나; 또는 (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 상기 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 비캡핑된 RNA를 생산하는 단계; 및 (e) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액 조건을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제5 실시형태에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및 (c) 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형, viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
제6 실시형태에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) 테일이 없는 RNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형; 및 viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나 또는 (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제7 실시형태에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소 및 vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고; 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액 조건을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
제8 실시형태에서 본 개시내용은 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법을 특징으로 하며, (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;　(b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; (c) 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제 및 v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된, 테일이 없는 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 viii) i적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; (d) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나; 또는 (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 상기 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 비캡핑된 RNA를 생산하는 단계; 및 (e) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액 조건을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계를 포함한다.
추가 실시형태에서, 상기에 기재된 각각의 실시형태에 대해서, 동시에 대신에 (c)의 나머지 단계 이전에 단계 (c) (i) 내지 (c) (v)를 수행하여 뉴클레오타이드 트라이포스페이트를 생산할 수 있다.
상기에 기재된 실시형태에서, 제2 반응 혼합물은 제2 반응 혼합물을 혼합하거나 언급된 성분을 제1 반응 혼합물에 첨가하여 제2 반응 혼합물을 생성시킴으로써 달성될 수 있다.
추가로, 상기에 기재된 바와 같이, 각각의 실시형태의 단계 (a) 및 (b)에 기재된 바와 같은 세포 RNA의 해중합 이외의 방법에 의해서 생산된 뉴클레오타이드(예를 들어, 발효 공정, 화학 공정 또는 화학효소 공정으로부터 유래된 뉴클레오타이드)를 또한 단계 (c)에서 뉴클레오타이드로서 사용함으로써, 각각의 실시형태의 단계 (a) 및 단계 (b)에 대한 필요성을 제거할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드는 NMP, NDP, NTP 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 뉴클레오타이드는 비변형된 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드, 또는 이들의 혼합물 중 1종 이상으로 이루어질 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드는 1종 이상의 비변형된 NMP 및 1종 이상의 변형된 NTP 또는 비변형된 AMP, CMP 및 GMP(슈도UTP를 가짐) 또는 비변형된 AMP, GMP, 슈도UTP 및 5-메틸 CTP로 추가로 이루어질 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드를 세포-유래된 뉴클레오타이드에 첨가하여 부분적으로 변형된 생성된 mRNA를 달성할 수 있다. 이와 일관되게, 이러한 뉴클레오타이드의 사용은 본 명세서에서 실시형태에 기재된 바와 같은 mRNA를 생산할 수 있다.
일 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 DNA 주형에 암호화된 세포 RNA를 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA를 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, 뉴클레아제 P1)와 배합하고, 그 반응을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5' NMP 제제 및 효소 제제를 생산하는 단계, (d) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물 및 mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 주형에 암호화된 서열의 3' 말단에 위치된 폴리아데닐레이트 서열을 함유하는 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 비캡핑된 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계 및 (e) 완충액을 교환하고, 메틸 공여자(예를 들어, S-아데노실메티오닌)와 함께, 단계 (c)에서 생산된 1종 이상의 캡핑 효소 제제를 단계 (d)의 반응 혼합물에 첨가하고, GTP의 존재 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 단계 (d)에서 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 에너지 및 포스페이트 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 에너지 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다. 선택적으로, RNA 합성 후 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리한다.
추가 실시형태에서, 방법은 polyA 테일이 효소적으로 첨가되는 세포 RNA를 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, PolyA 중합효소, 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA를 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, 뉴클레아제 P1)와 배합하고, 그 반응을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5' NMP 제제 및 효소 제제를 생산하는 단계, (d) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물 및 mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 비캡핑된, 테일이 없는 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (e) 무세포 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리하는 단계; (f) polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 polyA 테일을 효소에 의해 첨가하여 비캡핑된 RNA를 생산하는 단계 및 (g) 완충액을 교환하고, 메틸 공여자(예를 들어, S-아데노실메티오닌)와 함께, 단계 (c)에서 생산된 1종 이상의 캡핑 효소 제제를 단계 (f)의 반응 혼합물에 첨가하고, GTP의 존재 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 DNA 주형에 암호화된 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 세포 RNA, 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 세포 RNA와 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, 뉴클레아제 P1)를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 배합하고, 세포 용해물을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5' NMP 제제 및 효소 제제를 생산하는 단계, (d) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물, 캡핑 시약, mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 주형에 암호화된 서열의 3' 말단에 위치된 폴리아데닐레이트 서열을 함유하는 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다. 선택적으로, RNA 합성 후 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 효소에 의해서 첨가되는 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 세포 RNA, 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, polyA 중합효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 세포 RNA와 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, 뉴클레아제 P1)를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 배합하고, 세포 용해물을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 키나제, RNA 중합효소 및 polyA 중합효소를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5' NMP 제제 및 효소 제제를 생산하는 단계, (d) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물, 테일이 없는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형 및 캡핑 시약을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 테일이 없는 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (e) 무세포 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리하는 단계; 및 (f) polyA 테일을 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 효소에 의해서 첨가하여, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 주형에 암호화된 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 포함하는 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 주형에 암호화된 서열의 3' 말단에 위치된 폴리아데닐레이트 서열을 함유하는 DNA 주형, 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA를 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, 뉴클레아제 P1)와 배합하고, 그 반응을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'-NMP 제제, 효소 제제 및 DNA 주형 제제를 생산하는 단계, (d) DNA 주형을 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 암호화된 polyA 테일에 대한 3'를 직접적으로 절단하는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시켜, 선형화된 DNA 주형의 제제를 생산하고, 그 다음 제한 엔도뉴클레아제를 불활성화시키거나 제거하는 단계, (e) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물 및 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 비캡핑된 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계 및 (e) 완충액을 교환하고, 메틸 공여자(예를 들어, S-아데노실메티오닌)와 함께, 단계 (c)에서 생산된 1종 이상의 캡핑 효소 제제를 단계 (d)의 반응 혼합물에 첨가하고, GTP의 존재 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 효소에 의해서 첨가되는 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 포함하는 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 RNA 합성 방법을 포함하고, 이 방법은 (a) 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, PolyA 중합효소, 테일이 없는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형, 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA를 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, 뉴클레아제 P1)와 배합하고, 그 반응을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'-NMP 제제, 효소 제제 및 DNA 주형 제제를 생산하고, DNA 주형을 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 암호화된 테일이 없는 RNA에 대한 3'를 직접적으로 절단하는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시켜, 선형화된 DNA 주형의 제제를 생산하고, 그 다음 제한 엔도뉴클레아제를 불활성화시키거나 제거하는 단계, (d) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물 및 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 비캡핑된, 테일이 없는 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계; (e) 무세포 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리하는 단계; (f) polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 polyA 테일을 효소에 의해 첨가하여 비캡핑된 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (g) 완충액을 교환하고, 메틸 공여자(예를 들어, S-아데노실메티오닌)와 함께, 단계 (c)에서 생산된 1종 이상의 캡핑 효소 제제를 단계 (f)의 반응 혼합물에 첨가하고, GTP의 존재 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 주형에 암호화된 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 세포 RNA, 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 주형에 암호화된 서열의 3' 말단에 위치된 폴리아데닐레이트 서열을 함유하는 DNA 주형을 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 세포 RNA와 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, 뉴클레아제 P1)를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 배합하고, 세포 용해물을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 키나제 RNA 중합효소 및 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'-NMP 제제, 효소 제제 및 DNA 주형 제제를 생산하는 단계, (d) DNA 주형을 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 암호화된 polyA 테일에 대한 3'를 직접적으로 절단하는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시켜, 선형화된 DNA 주형의 제제를 생산하고, 그 다음 제한 엔도뉴클레아제를 불활성화시키거나 제거하는 단계, (e) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물, 캡핑 시약 및 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계를 포함한다. 선택적으로, RNA 합성 후 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 효소에 의해서 첨가되는 DNA 주형을 포함하는 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 RNA 합성 방법을 포함하고, 이 방법은 (a) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA, 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, PolyA 중합효소, 테일이 없는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 세포 RNA를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, 뉴클레아제 P1)와 배합하고, 세포 용해물을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'-NMP 제제, 효소 제제 및 DNA 주형 제제를 생산하는 단계, (d) DNA 주형을 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 암호화된 테일이 없는 RNA에 대한 3'를 직접적으로 절단하는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시켜, 선형화된 DNA 주형의 제제를 생산하고, 그 다음 제한 엔도뉴클레아제를 불활성화시키거나 제거하는 단계, (e) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물, 캡핑 시약 및 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 테일이 없는 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계 및 (f) 무세포 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리하는 단계; (g) polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 인큐베이션시킴으로써 polyA 테일을 효소에 의해서 첨가하여, mRNA를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 DNA 주형에 암호화된 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA를 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, PNPase)와 배합하고, 그 반응을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, NDP 제제 및 효소 제제를 생산하는 단계, (d) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물 및 mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 주형에 암호화된 서열의 3' 말단에 위치된 폴리아데닐레이트 서열을 함유하는 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 비캡핑된 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (e) 완충액을 교환하고, 메틸 공여자(예를 들어, S-아데노실메티오닌)와 함께, 단계 (c)에서 생산된 1종 이상의 캡핑 효소 제제를 단계 (d)의 반응 혼합물에 첨가하고, GTP의 존재 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 선택적으로, RNA 합성 후 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 효소에 의해서 첨가되는 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 포함하는 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, PolyA 중합효소, 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA를 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, PNPase)와 배합하고, 그 반응을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'NDP 제제 및 효소 제제를 생산하는 단계, (d) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물을 및 테일이 없는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 비캡핑된, 테일이 없는 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계 및 (e) 무세포 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리하는 단계; (f) polyA 중합효소를 첨가하고, ATP의 존재 하에서 인큐베이션시킴으로써 polyA 테일을 효소에 의해 첨가하여 비캡핑된 RNA를 생산하는 단계, (g) 완충액을 교환하고, 메틸 공여자(예를 들어, S-아데노실메티오닌)와 함께, 단계 (c)에서 생산된 1종 이상의 캡핑 효소 제제를 단계 (f)의 반응 혼합물에 첨가하고, GTP의 존재 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 DNA 주형에 암호화된 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 세포 RNA, 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 세포 RNA와 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, PNPase)를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 배합하고, 세포 용해물을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'-NDP 제제 및 효소 제제를 생산하는 단계, (d) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물 및 mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 주형에 암호화된 서열의 3' 말단에 위치된 폴리아데닐레이트 서열을 함유하는 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계를 포함한다. 선택적으로, RNA 합성 후 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 효소에 의해서 첨가되는 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 포함하는 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 세포 RNA, 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, polyA 중합효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 세포 RNA와 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, PNPase)를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 배합하고, 세포 용해물을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 키나제, RNA 중합효소 및 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'-NMP 제제 및 효소 제제를 생산하는 단계, (d) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물, 캡핑 시약 및 테일이 없는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 테일이 없는 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (e) 무세포 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리하는 단계; (f) polyA 중합효소를 첨가하고, ATP의 존재 하에서 인큐베이션시킴으로써 polyA 테일을 효소에 의해서 첨가하여, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 DNA 주형에 암호화된 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 주형에 암호화된 서열의 3' 말단에 위치된 폴리아데닐레이트 서열을 함유하는 DNA 주형, 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA를 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, PNPase)와 배합하고, 그 반응을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'NDP 제제, 효소 제제 및 DNA 주형 제제를 생산하는 단계, (d) DNA 주형을 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 암호화된 polyA 테일에 대한 3'를 직접적으로 절단하는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시켜, 선형화된 DNA 주형의 제제를 생산하고, 그 다음 제한 엔도뉴클레아제를 불활성화시키거나 제거하는 단계, (e) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물 및 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 비캡핑된 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계 및 (f) 완충액을 교환하고, 메틸 공여자(예를 들어, S-아데노실메티오닌)와 함께, 단계 (c)에서 생산된 1종 이상의 캡핑 효소 제제를 단계 (e)의 반응 혼합물에 첨가하고, GTP의 존재 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 선택적으로, RNA 합성 후 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 DNA 주형에 암호화된 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, PolyA 중합효소, 테일이 없는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형 및 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA를 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, PNPase)와 배합하고, 그 반응을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'NDP 제제, 효소 제제 및 DNA 주형 제제를 생산하는 단계, (d) DNA 주형을 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 암호화된 테일이 없는 RNA에 대한 3'를 직접적으로 절단하는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시켜, 선형화된 DNA 주형의 제제를 생산하고, 그 다음 제한 엔도뉴클레아제를 불활성화시키거나 제거하는 단계, (e) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물 및 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 비캡핑된, 테일이 없는 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계 및 (f) 무세포 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리하는 단계; (g) polyA 중합효소를 첨가하고, ATP의 존재 하에서 인큐베이션시킴으로써 polyA 테일을 효소에 의해 첨가하여 비캡핑된 RNA를 생산하는 단계, (h) 완충액을 교환하고, 메틸 공여자(예를 들어, S-아데노실메티오닌)와 함께, 단계 (c)에서 생산된 1종 이상의 캡핑 효소 제제를 단계 (e)의 반응 혼합물에 첨가하고, GTP의 존재 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, RNA 합성 방법은 (a) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA, 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 주형에 암호화된 서열의 3' 말단에 위치된 폴리아데닐레이트 서열을 함유하는 DNA 주형을 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 세포 RNA와 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, PNPase)를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 배합하고, 세포 용해물을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 키나제 RNA 중합효소 및 1종 이상의 캡핑 효소를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5 NDP 제제, 효소 제제 및 DNA 주형 제제를 생산하는 단계, (d) DNA 주형을 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 암호화된 polyA 테일에 대한 3'를 직접적으로 절단하는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시켜, 선형화된 DNA 주형의 제제를 생산하고, 그 다음 제한 엔도뉴클레아제를 불활성화시키거나 제거하는 단계, (e) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물, 캡핑 시약 및 DNA 주형을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, mRNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, RNA 합성 후 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
추가 실시형태에서, 방법은 poly-A 테일이 효소에 의해서 첨가되는 DNA 주형을 포함하는 세포 용해물을 사용하여 무세포 RNA 합성으로 진행된다. 방법은 (a) 하나 이상의 반응으로 세포 RNA, 키나제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 키나제, 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP) 키나제, 폴리포스페이트 키나제), RNA 중합효소, PolyA 중합효소, 테일이 없는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 포함하는 세포의 하나 이상의 배양물을 용해시켜, 하나 이상의 세포 용해물을 생산하는 단계, (b) 세포 RNA를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, PNPase)와 배합하고, 세포 용해물을 RNA의 해중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계, (c) (i) 단계 (b)에서 생산된 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 무세포 반응 혼합물 및 (ii) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 단계 (a)에서 생산된 하나 이상의 세포 용해물을 바람직하지 않은 효소 활성을 제거하거나 불활성화시키는 1종 이상의 처리제로 처리하여, 5'NDP 제제, 효소 제제 및 DNA 주형 제제를 생산하는 단계, (d) DNA 주형을 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 암호화된 테일이 없는 RNA에 대한 3'를 직접적으로 절단하는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시켜, 선형화된 DNA 주형의 제제를 생산하고, 그 다음 제한 엔도뉴클레아제를 불활성화시키거나 제거하는 단계, (e) 키나제 및 RNA 중합효소를 포함하는 무세포 반응 혼합물에 단계 (c 내지 d)에서 생산된 하나 이상의 제제를 배합하고, 에너지 및 포스페이트 공급원(예를 들어, 폴리포스페이트)의 존재 하에서 무세포 반응 혼합물 및 캡핑 시약을 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건 하에서 인큐베이션시켜, 테일이 없는 RNA를 포함하는 무세포 반응 혼합물을 생산하는 단계 및 (g) 무세포 반응 혼합물을 데옥시리보뉴클레아제로 처리하는 단계; (h) polyA 중합효소를 첨가하고, ATP의 존재 하에서 인큐베이션시킴으로써 polyA 테일을 효소에 의해서 첨가하여, mRNA를 생산하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제, 포스페이트의 공급원, DNA 주형 및 RNA 중합효소를 포함한다. 추가 양상에서, 무세포 반응 혼합물은 NMP, 키나제 및 포스페이트 공급원을 포함한다. 이어서 반응 혼합물을 DNA 주형 및 RNA 중합효소와 혼합한다.
mRNA를 합성하는 추가 실시형태는 상기에 논의된 바와 같이 각각 NMP 또는 NDP로 해중합된 세포 RNA로부터 생산된 비캡핑된 mRNA 중 임의의 것에 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함시키는 것을 포함한다. 추가의 다른 실시형태에서, 그 다음 이전 실시형태 중 임의의 것에 의해서 생산된 비캡핑된 mRNA를 캡핑 효소(들)를 사용하여 캡핑시켜 캡핑된 mRNA를 생산한다. 추가의 다른 실시형태에서, 그 다음 각각 NMP 또는 NDP로 해중합된 세포 RNA로부터 생산된 비캡핑된 mRNA를 캡핑 효소(들)를 사용하여 캡핑시켜 캡핑된 mRNA를 생산한다. 추가의 다른 실시형태에서, 이전 실시형태 중 임의의 것의 RNA-중합효소-함유 단계는 또한 cap 유사체를 포함하여, 비캡핑된 RNA 대신 캡핑된 mRNA를 생산하고 후속 효소적 캡핑 단계(들)에 대한 필요성을 제거한다.
상기에 논의된 바와 같이, RNA 최종 생성물의 예는 바람직하게는 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 최종 생성물(생합성된 RNA)의 농도는 적어도 1g/ℓ 내지 50g/ℓ이다. 예를 들어, RNA 최종 생성물의 농도는 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50g/ℓ 또는 그 초과일 수 있다. 다수의 실시형태에서, RNA 최종 생성물의 농도는 적어도 1g/ℓ이다. 단일 배취는 최대 10,000ℓ 또는 이를 초과할 수 있다.
무세포 생산
"무세포 생산"은 살아있는 세포를 사용하지 않고 생체분자 또는 화학적 화합물의 합성을 위한 생물학적 과정의 사용이다. 먼저, 이러한 방법에서, 세포를 용해시켜, 세포 용해물을 생성시킨다. 둘 다 효소를 함유하는 비정제된(조) 분획 또는 부분적으로 정제된 분획을 목적하는 생성물의 생산을 위해 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법에서 사용되는 효소는 세포 용해물에 첨가될 수 있는 정제된 효소이다. 비제한적인 예로서, 세포를 배양하고, 수거하고, 고압 균질화 또는 다른 세포 용해 방법(예를 들어, 화학적 세포 용해)에 의해 용해시킨다. 무세포 반응은 배취식 또는 공급-배취 방식으로 수행될 수 있다. 일부 예에서, 효소적 경로는 반응기의 작업 부피를 충전하고, 세포내 환경에서보다 더 희석될 수 있다. 그러나, 막 회합된 촉매를 비롯한 실질적으로 모든 세포성 촉매가 제공된다.
본 명세서에 기재된 실시형태 중 많은 것이 특정 효소를 포함하는 "배양된 세포를 용해시키는 것"을 지칭하지만, 이 어구는 단일 배양물(예를 들어, RNA를 합성하는 데 필요한 모든 효소를 함유함)로부터 얻어진 세포의 클론 집단을 용해시키는 것뿐만 아니라 각각 상이한 세포 배양물(예를 들어, 각각 RNA 및/또는 세포 RNA 기질을 합성하는 데 필요한 1종 이상의 효소를 함유함)로부터 얻어진 세포의 1종 초과의 클론 집단을 용해시키는 것을 포괄하는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 특정 키나제를 발현하는 세포(예를 들어, 조작된 세포)의 집단을 함께 배양하고, 이를 사용하여 1종의 세포 용해물을 생산할 수 있고, 상이한 키나제를 발현하는 세포(예를 들어, 조작된 세포)의 또 다른 집단을 함께 배양하고, 이를 사용하여 또 다른 세포 용해물을 생산할 수 있다. 그 후, 각각 상이한 키나제를 포함하는 이들 2종 이상의 세포 용해물을 본 개시내용의 무세포 mRNA 생합성 방법에 사용하기 위해 배합할 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 효소 활성이 유지되는 것이 바람직한 효소, 예컨대, 키나제의 존재 하에서, 열을 사용하여 바람직하지 않은 효소 활성을 불활성화시키는 경우, 이러한 효소, 예컨대, 키나제의 열안정성 변이체가 이롭게 사용된다.
바이오매스 리보핵산의 뉴클레오사이드 모노포스페이트로의 해중합
본 개시내용은 일련의 효소적 반응을 포함하는 무세포 공정을 통해서 바이오매스로부터의 RNA(예를 들어, 내인성 세포 RNA)를 바람직한 합성 mRNA로 전환시키는 것에 기초한다. 먼저, 세포 RNA로부터 유래된, 반응 혼합물에 존재하는 RNA(예를 들어, 내인성 RNA)를 뉴클레아제에 의해 이의 구성요소 단량체로 전환시킨다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 그리고 당업계에 이해되는 바와 같이, 용어 "바이오매스"는 세포 물질의 전체 물질을 의미하도록 의도되고, 탄수화물, DNA, 지질, 단백질, RNA 및 이들의 단편을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 선택적으로, RNA는 단량체로 전환되기 전에 조 정제될 수 있다. 바이오매스로부터의 RNA(예를 들어, 내인성 RNA)는 전형적으로 리보솜 RNA(rRNA), 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), 다른 RNA 또는 이들의 조합물을 포함한다. 적절한 뉴클레아제, 예를 들어, 5'-뉴클레오사이드 모노포스페이트(5'-NMP)를 생산하는 뉴클레아제를 사용한 RNA의 해중합 또는 분해는 간단히 "단량체"로도 지칭되는 5'-NMP의 풀을 초래한다. 뉴클레오사이드 다이포스페이트로 전환되고, 뉴클레오사이드 트라이포스페이트로 추가로 전환되는 이들 단량체는 mRNA의 하류 중합/합성을 위한 출발 물질로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 단량체는 변형된 골격 계통을 갖거나 대안적인 염기, 즉, 티오에이트이고, 전문화된 뉴클레아제로 해중합되고, 전문화된 키나제로 인산화된다. NTP의 상업적인 양의 생산은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 출원 제PCT/US2018/05535호(발명의 명칭: "Methods and Compositions for Nucleoside Triphosphate and Ribonucleic Acid Production")에 기재된 바와 같이 고려된다.
mRNA를 합성하는 데 요구되는 RNA(예를 들어, 내인성 RNA)의 양은 예를 들어, 특정 mRNA의 바람직한 길이 및 수율뿐만 아니라 세포의 RNA(예를 들어, 이. 콜라이 세포 또는 효모 세포로부터의 내인성 RNA)의 뉴클레오타이드 조성에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 조성에 따라 달라질 수 있다. 전형적으로, 박테리아 세포에 대해, 예를 들어, RNA(예를 들어, 내인성 RNA) 함량은 총 세포 질량의 5 내지 50%의 범위인 반면, 진핵생물 세포의 경우에 그 양은 약 20%이다. 출발 물질의 질량 백분율은 예를 들어, 하기 방정식을 사용하여 계산될 수 있다:(RNA의 킬로그램(kg)/건조 세포 중량의 킬로그램)×100%.
내인성 RNA는 화학적 또는 효소적 수단에 의해 이의 구성요소 단량체로 해중합되거나 분해될 수 있다. 그러나, RNA의 화학적 가수분해는 전형적으로 2'- 및 3'-NMP를 생성시키는데, 이는 RNA로 중합될 수 없어서, 효소 분해 방법보다 덜 이롭다. 따라서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 방법, 조성물 및 시스템은 주로 내인성 RNA의 해중합을 위한 효소를 사용한다. "RNA를 해중합시키는 효소"는 RNA 분자에서 2개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합의 가수분해를 촉매한다. 따라서, "RNA를 해중합시키는 효소"는 RNA(세포 RNA)를 이의 단량체 형태, 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 또는 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP)로 전환시킨다. 효소에 따라, RNA의 효소적 해중합은 3'-NMP, 5'-NMP, 3'-NMP와 5'-NMP의 조합물 또는 5'-NDP를 산출할 수 있다. 3'-NTP(3'-NDP로부터 전환되며, 이는 3'-NMP로부터 전환됨)를 중합시키는 것이 가능하지 않기 때문에, 5'-NMP(이는 그 후 5'-NDP로, 그 후 5'-NTP로 전환됨) 또는 5'-NDP(이는 그 후 5'-NTP로 전환됨)를 산출하는 효소, 예컨대, 뉴클레아제 P1 또는 PNPase가 바람직하다. 일부 실시형태에서, 3'-NMP를 산출하는 효소는 조작된 세포의 게놈 DNA로부터 제거되어 RNA 생산의 효율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합에 사용되는 효소는 뉴클레아제 P1이다. 일부 실시형태에서, 사용되는 뉴클레아제 P1의 농도는 0.1 내지 3.0㎎/㎖(예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0㎎/㎖)이다. 일부 실시형태에서, 사용되는 뉴클레아제 P1의 농도는 1 내지 3㎎/㎖이다.
RNA를 해중합시키는 효소의 예는 비제한적으로 리보뉴클레아제(RNase R, 예를 들어, RNase R)를 비롯한 뉴클레아제(예를 들어, 뉴클레아제 P1)를 포함한다. 뉴클레아제는 보다 작은 성분(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트라고도 지칭되는 단량체 또는 올리고뉴클레오타이드)으로의 핵산의 분해를 촉매한다. 포스포다이에스터라제는 포스포다이에스터 결합의 분해를 촉매한다. RNA를 해중합시키는 이들 효소는 전장 유전자에 의해 또는 유전자 융합물(예를 들어, 2종의 상이한 효소 활성을 암호화하는 적어도 2종의 상이한 유전자(또는 유전자의 단편)를 포함하는 DNA)에 의해 암호화될 수 있다.
RNase는 세포에서 RNA 성숙 및 턴 오버를 조절하는 기능을 한다. 각각의 RNase는 특이적 기질 선호도를 갖는다. 따라서, 일부 실시형태에서, 상이한 RNase의 조합물 또는 상이한 뉴클레아제의 조합물은 일반적으로 바이오매스-유래된 RNA(예를 들어, 내인성 RNA)를 해중합시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 또는 1 내지 10종의 상이한 뉴클레아제가 RNA를 해중합시키는 데 조합으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종, 적어도 8종, 적어도 9종, 또는 적 어도 10종의 상이한 뉴클레아제가 RNA를 해중합시키는 데 조합으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 바와 같이 사용하기 위한 뉴클레아제의 비제한적 예를 표 1에 포함시킨다. 일부 실시형태에서, 사용되는 뉴클레아제는 뉴클레아제 P1이다.
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RNA를 해중합시키는 효소(예를 들어, RNase)는 숙주 세포에 대해 내인성(숙주-유래됨)일 수 있거나, 이들은 숙주 세포 내로 외인적으로 도입된 조작된 핵산(예를 들어, 에피솜 벡터 상에 있거나, 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨)에 의해 암호화될 수 있다. 대안적으로, 효소를 상업적으로 공급된 단리된 단백질을 포함하는 단리된 단백질로서 반응에 첨가할 수 있다. 다른 대안으로서, 효소를 내인적으로 생산하는 세포 또는 효소를 생산하도록 조작된 세포로부터 부분적으로 정제된 효소를 포함하는, 부분적으로 정제된 효소를 반응에 사용할 수 있다.
무세포 반응 혼합물에서 세포 RNA를 인큐베이션시키기 위해서, RNA의 해중합을 초래하는 조건은 당업계에 공지되어 있거나, 예를 들어, pH, 온도, 시간의 길이 및 세포 용해물의 염 농도뿐만 아니라 임의의 외인성 보조인자를 비롯한 특정 뉴클레아제(예를 들어, 뉴클레아제 P1) 활성을 위한 최적 조건을 고려하여, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이러한 반응 조건에 대한 예는 이전에 기재된 것을 포함한다(예를 들어, 문헌[Wong et al., 1983, J. Am. Chem. Soc. 105: 115-117], 유럽 특허 제EP1587947B1호 또는 문헌[Cheng and Deutscher, 2002, J Biol Chem. 277:21624-21629] 참고).
일부 실시형태에서, 금속 이온(예를 들어, Zn2+, Mg2+)이 해중합 반응으로부터 고갈된다. 일부 실시형태에서, 금속 이온(예를 들어, Zn2+, Mg2+)의 농도는 8mM 이하(예를 들어, 8mM 미만, 7mM 미만, 6mM 미만, 5mM 미만, 4mM 미만, 3mM 미만, 2mM 미만, 1mM 미만, 0.5mM 미만, 0.1mM 미만 및 0.05mM 미만)이다. 일부 실시형태에서, 금속 이온(예를 들어, Zn2+, Mg2+)의 농도는 0.1mM 내지 8mM, 0.1mM 내지 7mM 또는 0.1mM 내지 5mM이다.　 일부 실시형태에서, 금속 이온은 Zn2+이다.
RNA 해중합 반응 동안의 세포 용해물의 pH는 3 내지 8의 값을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물의 pH 값은 3 내지 8, 4 내지 8, 5 내지 8, 6 내지 8, 7 내지 8, 3 내지 7, 4 내지 7, 5 내지 7, 6 내지 7, 3 내지 6, 4 내지 6, 5 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4 또는 4 내지 5이다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물의 pH 값은 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 또는 8.0이다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물의 pH 값은 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 또는 5.5이다. 일부 이로운 실시형태에서, pH는 5.8이다. 세포 용해물의 pH는 필요에 따라 조정될 수 있다.
RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물의 온도는 15℃ 내지 99℃이다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물의 온도는 15 내지 95℃, 15 내지 90℃, 15 내지 80℃, 15 내지 70℃, 15 내지 60℃, 15 내지 50℃, 15 내지 40℃ 15 내지 30℃, 25 내지 95℃, 25 내지 90℃, 25 내지 80℃, 25 내지 70℃, 25 내지 60℃, 25 내지 50℃, 25 내지 40℃, 25 내지 30℃, 30 내지 95℃, 30 내지 90℃, 30 내지 80℃, 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 95℃, 40 내지 90℃, 40 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 40 내지 50℃, 50 내지 95℃, 50 내지 90℃, 50 내지 80℃, 50 내지 70℃, 50 내지 60℃, 60 내지 95℃, 60 내지 90℃, 60 내지 80℃ 또는 60 내지 70℃이다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물의 온도는 70℃이다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물의 온도는 15℃, 25℃, 32℃, 37℃, 40℃, 42℃, 45℃, 50℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃ 또는 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃ 또는 99℃이다.
일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 무세포 반응 혼합물은 24시간 동안 70℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 반응 혼합물은 5 내지 30분 동안 70℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 반응 혼합물은 5 내지 5.5의 pH를 갖고, 15분 동안 70℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 반응 혼합물은 RNA가 NDP 또는 RNA가 5'-NMP로 65%를 초과하게 전환되는 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA는 (또는 적어도) 50mM/hr, 100mM/hr 또는 200mM/hr의 속도로 NDP 또는 5'-NMP로 전환된다. 다른 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 반응 혼합물은 더 높은 온도(예를 들어, 50℃ 내지 70℃)에서 인큐베이션된다.
RNA 해중합 반응을 달성하기 위해서 생산되는 세포 용해물은 5분(min) 내지 72시간(hr) 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물은 5 내지 10분, 5 내지 15분, 5 내지 20분, 5 내지 30분 또는 5분 내지 48시간 동안 인큐베이션된다. 예를 들어, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물은 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 45분, 1시간, 2시간. 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 동안 인큐베이션될 수 있다 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물은 24시간 동안 37℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물은 5 내지 10분 동안 70℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물은 5 내지 5.5의 pH를 갖고, 15분 동안 70℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물은 RNA가 5'-NMP로 65%를 초과하게 전환되는 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA는 (또는 적어도) 50mM/hr, 100mM/hr 또는 200mM/hr의 속도로 5'-NMP로 전환된다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 효소 응집을 방지하기 위해서, 염을 세포 용해물에 첨가한다. 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨 또는 이들의 조합물을 세포 용해물에 첨가할 수 있다. RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물 중의 염의 농도는 5mM 내지 1M일 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 해중합 반응 동안 세포 용해물 중의 염의 농도는 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 50mM, 100mM, 150mM, 200mM, 250mM, 500mM, 750mM 또는 1M일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물은 40 내지 60mM의 인산칼륨, 1 내지 5mM의 MnCl2 및/또는 10 내지 50mM의 MgCl2(예를 들어, 20mM MgCl2)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 완충액은 예를 들어, 특정 pH 값 및/또는 염 농도를 달성하기 위해서 세포 용해물에 첨가된다. 완충액의 예는 비제한적으로 인산염 완충액, Tris 완충액, MOPS 완충액, HEPES 완충액, 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 말레이트 완충액, MES 완충액, 히스티딘 완충액, PIPES 완충액, 비스-tris 완충액 및 에탄올아민 완충액을 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제 P1을 사용하여 바이오매스를 해중합시킨다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제 P1을 후속 단계 이전에 반응으로부터 여과한다.
RNA의 해중합은 5'-AMP, 5'-UMP, 5'-CMP 및 5'-GMP를 포함하는 5'-NMP의 생산을 초래할 수 있다. RNA의 해중합은 임의의 미리 결정된 비율의 NMP를 초래하지 않지만, 세포 RNA의 조성에 좌우될 것이라고 이해되어야 한다.
일부 실시형태에서, PNPase를 사용하여 바이오매스를 해중합시킨다. 일부 실시형태에서, PNPase를 후속 단계 이전에 반응으로부터 불활성화되거나 제거된다.
인산염의 존재 하에서의 RNA의 해중합은 5'-ADP, 5'-UDP, 5'-CDP 및 5'-GDP를 포함하는 5'-NDP의 생산을 초래할 수 있다. RNA의 해중합은 임의의 미리 결정된 비율의 NDP를 초래하지 않지만, 세포 RNA의 조성에 좌우될 것이라고 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, NDP를 제조하기 위한 PNPase의 사용은 인산염의 사용을 요구한다.
일부 실시형태에서, 용해 시 세포 중의 내인성 RNA 중 50 내지 98%는 5'-NMP 또는 5'-NDP로 전환된다(해중합된다). 예를 들어, 50 내지 95%, 50 내지 90%, 50 내지 85%, 50 내지 80%, 75 내지 98%, 75 내지 95%, 75 내지 90%, 75 내지 85% 또는 75 내지 80%의 RNA는 5'-NMP로 전환된다(해중합된다). 일부 실시형태에서, 용해 시 세포 중의 내인성 RNA 중 65 내지 70%는 5'-NMP 또는 5'NDP로 전환된다(해중합된다). 더 낮은 수율이 또한 허용 가능하다.
RNA 해중합 효소의 제거 또는 불활성화
내인성 및/또는 외인성 뉴클레아제에 의한 바이오매스로부터의 RNA(예를 들어, 내인성 RNA)의 이의 단량체 구성요소(예를 들어, NMP 또는 NDP)로의 전환 후, RNA 생합성에 유해한 효과를 가질 수 있는 뉴클레아제 및 포스파타제를 비롯한 몇몇 효소가 반응 혼합물 또는 세포 용해물에 잔류할 수 있다. 예를 들어, 해중합을 위해서 사용되는 뉴클레아제(예를 들어, 뉴클레아제 P1)는 바이오매스의 해중합 후 활성을 유지할 수 있다. 또 다른 예로서, 세포 RNA 공급원은 다수의 천연 포스파타제를 함유하는데, 이들 중 다수는 NTP, NDP 및 NMP를 탈인산화시킨다. RNA 해중합 후 세포 RNA로부터 유래된 NMP의 탈인산화는 비-인산화된 뉴클레오사이드의 축적을 초래하고, 유용한 NMP 기질의 손실을 초래하여, 합성 RNA 수율을 감소시킬 수 있다.
바람직하지 않은 효소 활성의 제거 또는 불활성화
세포로부터 유래된 물질(예를 들어, 세포 용해물(들) 또는 세포 용해물(들)로부터 얻은 효소 제제)을 포함하는 반응 혼합물의 경우, 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 바람직하지 않은 천연 효소 활성을 없애거나, 제거하거나 불활성화시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하지 않은 천연 효소 활성은 예를 들어, 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소 및 가수분해효소를 포함한다. NMP로의 RNA 해중합 후 NDP 또는 NTP의 탈인산화는 NMP가 NDP 및 NTP로 인산화되고, 그 다음 NMP 또는 뉴클레오사이드 출발 지점으로 탈인산화되는 동안 무익(futile) 에너지 주기(합성 RNA의 낮은 수율을 생산하는 에너지 주기)를 초래할 수 있다. 무익 주기는 단위 에너지 입력물(예를 들어, 폴리포스페이트, ATP 또는 고에너지 인산염의 다른 공급원)당 RNA 생성물 수율을 감소시킨다.
다수의 방법을 사용하여 바람직하지 않은 효소 활성을 없애거나, 제거하거나 불활성화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 게놈으로부터의 유해한 효소를 암호화하는 유전자를 제거함으로써 바람직하지 않은 효소 활성을 제거한다. 본 명세서에서 제공된 바와 같은 RNA의 생합성에 유해한 효소는 조작 동안 숙주 세포 게놈으로부터 결실될 수 있되, 단 그 효소는 숙주 세포(예를 들어, 박테리아 세포) 생존 및/또는 성장에 필수적이지 않다. 효소 또는 효소 활성의 결실은 예를 들어, 숙주 세포 게놈에서 그 효소를 암호화하는 유전자를 결실시키거나 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 효소는 숙주 세포가 특정 효소의 발현 및/또는 활성 없이 생존할 수 없는 경우 "숙주 세포 생존에 필수적"이다. 유사하게, 효소는 숙주 세포가 특정 효소의 발현 및/또는 활성 없이 분화 및/또는 성장할 수 없는 경우 "숙주 세포 성장에 필수적"이다.
RNA의 생합성에 유해한 효소가 숙주 세포의 생존 및/또는 성장에 필수적인 경우 다른 방법을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소 활성은 열 비활성화에 의해 제거된다. 일부 실시형태에서, 효소 활성은 pH 변화에 의해 제거된다. 일부 실시형태에서, 효소 활성은 염 농도의 변화에 의해 제거된다. 일부 실시형태에서, 효소 활성은 알코올 또는 또 다른 유기 용매로의 처리에 의해 제거된다. 일부 실시형태에서, 효소 활성은 세제 처리에 의해 제거된다. 일부 실시형태에서, 효소 활성은 화학 저해제의 사용을 통해서 제거된다. 일부 실시형태에서, 효소 활성은 여과, 침전 및 포획 방법 및/또는 크로마토그래피를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 물리적 분리에 의해 제거된다. 일부 실시형태에서, 사용된 일부 크로마토그래피는 고정화 금속 크로마토그래피이다. 일부 실시형태에서, 포획 방법은 헥사히스티딘 태그를 갖기 위해서 효소를 필요로 한다. 상기 접근법 중 임의의 것의 조합을 또한 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 천연 효소 활성은 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 국소화(예를 들어, 주변세포질 표적화) 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거된다. 다른 실시형태에서, 천연 효소 활성은 온도, pH, 염, 세제, 알코올 또는 다른 용매 및/또는 화학 저해제를 통해 불활성화된다. 추가의 다른 실시형태에서, 천연 효소 활성은 물리적 분리, 예컨대, 침전, 여과, 포획 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거된다.
바람직하지 않은(예를 들어, 천연) 효소 활성(들)은 유전자, 조건부 또는 분리 접근법을 사용하여 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 접근법을 사용하여 바람직하지 않은 효소 활성을 제거한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 세포는 바람직하지 않은 효소 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형된다. 바람직하지 않은 효소 활성(들)을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 사용될 수 있는 유전자 접근법의 예는 분비, 유전자 넉아웃 및 프로테아제 표적화를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 조건부 접근법을 사용하여 바람직하지 않은 효소 활성을 제거한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 바람직하지 않은 효소가 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 반응 혼합물에 남아있고, 선택적으로 불활성화된다. 바람직하지 않은 효소 활성을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 사용될 수 있는 조건부 접근법의 예는 온도, pH, 염, 세제, 알코올 또는 다른 용매 및/또는 화학 저해제의 변화를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 분리/정제 접근법을 사용하여 바람직하지 않은 효소 활성을 제거한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 바람직하지 않은 효소는 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 반응 혼합물로부터 물리적으로 분리된다. 바람직하지 않은 효소 활성을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 사용될 수 있는 분리 접근법의 예는 물리적 분리, 예컨대, 여과, 침전, 포획 및/또는 크로마토그래피를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서, 경로 효소를 발현하는 세포 또는 세포의 용해물로부터 제조된 효소는 NTP 및/또는 RNA의 생산을 위한 반응 혼합물에 사용된다. 이러한 세포 또는 세포 용해물에서, NTP 및/또는 RNA 생산에 유해한 효과를 가질 수 있는 효소가 존재한다. 이러한 효소의 비제한적인 예는 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소 및/또는 가수분해효소, 예컨대, 이. 콜라이 세포에 의해 발현되는 것을 포함한다. 포스파타제는 뉴클레오타이드 인산화/탈인산화의 무익 주기로 인해서 NTP 생산을 감소시키는 포스페이트기(예를 들어, NMP를 뉴클레오사이드로 전환, NDP를 NMP로 전환 또는 NTP를 NDP로 전환)를 제거한다. 뉴클레아제는 핵산을 단량체 또는 올리고머로 절단하여 RNA 생성물 분해(예를 들어, RNase에 의한) 및/또는 DNA 주형 분해(예를 들어, DNase에 의한)로 이어진다. 프로테아제는 단백질을 아미노산 또는 펩타이드로 절단하며, 이것이 경로 효소를 분해한다. 데아미나제는 아미노기를 제거하는데, 이것은 경로 중간체를 유용하지 않은 기질(예를 들어, 크산틴 및 하이포크산틴)로 전환시킴으로써 NTP 농도를 감소시키고 RNA 생성물(예를 들어, C에서 U로)의 돌연변이를 유발할 수 있다. 가수분해효소(예를 들어, 뉴클레오사이드 가수분해효소 또는 뉴클레오타이드 가수분해효소)는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 염기 및 당 모이어티로 절단하여 뉴클레오타이드의 비가역적 분해로 인해 NTP 농도를 감소시킨다. 산화환원효소는 한 분자(산화제)에서 다른 분자(환원제)로의 전자 전달을 촉매한다. 산화 및/또는 환원 반응은 예를 들어, DNA 및/또는 RNA의 핵염기를 손상시켜, 전사 및/또는 번역의 오류 또는 단백질 또는 효소의 손상으로 이어지고, 이것은 기능 손실로 이어질 수 있다.
따라서, 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 반응 혼합물에서 이러한 천연 효소 활성 또는 다른 바람직하지 않은 효소 활성을 없애거나, 제거하거나, 비활성화시키는 것이 다수의 실시형태에서 유리하다.
숙주 세포의 게놈으로부터 열 불활성화, 결실 또는 물리적으로 제거될 수 있는 효소의 예는 비제한적으로 뉴클레아제(예를 들어, RNase III, RNase I, RNase R, 뉴클레아제 P1, PNPase, RNase II 및 RNase T), 포스파타제(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스파타제, 뉴클레오사이드 다이포스파타제, 뉴클레오사이드 트라이포스파타제) 및 RNA를 해중합시키거나 뉴클레오타이드를 탈인산화시키는 다른 효소를 포함한다. RNA를 해중합시키는 효소는 RNA 분자를 절단하거나 부분적으로 가수분해시키거나 완전히 가수분해시킬 수 있는 임의의 효소를 포함한다.
효소를 불활성화시키는 기술의 예는 조건부 접근법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 반응 혼합물은 선택적으로 불활성화되는 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소는 효소를 제거 조건(예를 들어, 고온 또는 저온, 산성 또는 염기성 pH 값, 고염 또는 저염, 세제 및/또는 유기 용매)에 노출시킴으로써 선택적으로 불활성화된다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 효소 활성은 침전 또는 크로마토그래피에 의해 제거된다.
"열 불활성화"는 내인성 뉴클레아제, 포스파타제 또는 다른 효소를 불활성화(또는 적어도 부분적으로 불활성화)시키기에 충분한 온도로 무세포 반응 혼합물을 가열시키는 과정을 지칭한다. 일반적으로, 열 불활성화 과정은 유해한 효소의 변성(언폴딩)을 포함한다. 내인성 세포 단백질이 변성되는 온도는 유기체마다 달라진다. 예를 들어, 이. 콜라이에서, 내인성 세포 효소는 일반적으로 41℃ 초과의 온도에서 변성된다. 변성 온도는 다른 유기체의 경우 41℃보다 높거나 낮을 수 있다. 본 명세서에 제공된 바와 같은 반응 혼합물의 효소는 55℃ 내지 95℃ 또는 그 초과의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물의 효소는 55 내지 90℃, 55 내지 80℃, 55 내지 70℃ 55 내지 60℃, 60 내지 95℃, 60 내지 90℃, 60 내지 80℃, 60 내지 70℃, 70 내지 95℃, 70 내지 90℃ 또는 70 내지 80℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 무세포 반응 혼합물에서 효소는 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 85℃, 90℃ 또는 95℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물의 효소는 55 내지 95℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물의 효소는 70℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물의 효소는 60℃의 온도에서 열 불활성화될 수 있다. 유해한 효소의 화학적 저해제를 도입하는 것이 또한 가능할 수 있다. 이러한 저해제는 소듐 오쏘바나데이트(단백질 포스포티로실 포스파타제의 저해제), 소듐 플루오라이드(포스포세릴 및 포스포트레오닐 포스파타제의 저해제), 피로인산나트륨(포스파타제 저해제), 인산나트륨 및/또는 인산칼륨을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
바람직하지 않은 효소의 열 불활성화를 달성하기 위해 무세포 반응 혼합물이 승온에서 배양되는 시간 기간은 예를 들어, 무세포 반응 혼합물의 부피 및 바이오매스가 제조된 유기체에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물은 55℃ 내지 99℃의 온도에서 0.5분(min) 내지 24시간(hr) 동안 인큐베이션된다. 예를 들어, 무세포 반응 혼합물은 55℃ 내지 99℃의 온도에서 0.5분, 1분, 2분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분 또는 1시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물은 55℃ 내지 99℃의 온도에서 30분, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42 또는 48시간 동안 인큐베이션된다.
일부 실시형태에서, 효소는 60 내지 80℃의 온도에서 10 내지 20분 동안 열 불활성화된다. 일부 실시형태에서, 효소는 70℃의 온도에서 15분 동안 열 불활성화된다.
일부 실시형태에서, 내인성 RNA를 해중합시키는 효소는 효소를 열에 더 민감하게 만드는 하나 이상의 변형(예를 들어, 돌연변이)을 포함한다. 이러한 효소를 "열-민감성 효소"라고 지칭한다. 열-민감성 효소는 이들의 야생형 대응물보다 더 낮은 온도에서 변성 및 불활성화되고, 그리고/또는 열-민감성 효소의 활성을 감소시키는 데 필요한 시간 기간은 야생형 대응물보다 더 짧다.
열 불활성화된 효소는 일부 경우에서는 어느 정도 활성을 유지할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 열-불활성화된 효소의 활성 수준은 열-불활성화되지 않은 동일한 효소의 활성 수준의 50% 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서 열 불활성화된 효소의 활성 수준은 열 불활성화되지 않은 동일한 효소의 활성 수준의 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 또는 0.1% 미만이다.
따라서, 효소의 활성이 완전히 제거되거나 감소될 수 있다. 효소의 변성(열 불활성화) 형태가 이의 천연 형태의 효소에 의해 촉매되는 반응을 더 이상 촉매하지 않는 경우 효소는 완전히 불활성화된 것으로 간주된다. 열-불활성화된 변성된 효소는, 열-불활성화된 효소의 활성이 가열되지 않은 효소(즉, 이의 천연 환경에서)의 활성에 비해 적어도 50%만큼 감소되는 경우 "불활성화된" 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 열-불활성화된 효소의 활성은 가열되지 않은 효소의 활성에 비해 50 내지 100%만큼 감소된다. 예를 들어, 열-불활성화된 효소의 활성은 가열되지 않은 효소의 활성에 비해 50 내지 90%, 50 내지 85%, 50 내지 80%, 50 내지 75%, 50 내지 70%, 50 내지 65%, 50 내지 60% 또는 50 내지 55%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 열-불활성화된 효소의 활성은 가열되지 않은 효소의 활성에 비해 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%만큼 감소된다.
일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소를 일시적으로 또는 비가역적으로 불활성화시키는 산 또는 염기(pH 변화)에 노출된다. "산 또는 염기 불활성화"는 바람직하지 않은 효소(들)를 불활성화(또는 적어도 부분적으로 불활성화)시키기에 충분한 pH로 반응 혼합물을 조정하는 과정을 지칭한다. 일반적으로 산 또는 염기 불활성화 과정은 효소(들)의 변성(언폴딩)을 포함한다. 효소가 변성되는 pH는 유기체마다 달라진다. 예를 들어, 이. 콜라이에서 천연 효소는 일반적으로 pH 7.5 초과 또는 6.5 이하에서 변성된다. 변성 pH는 다른 유기체에 대한 변성 pH보다 높거나 낮을 수 있다. 본 명세서에 제공된 바와 같이 반응 혼합물의 효소는 pH 7.5 내지 14 또는 그 초과에서 염기 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물의 효소는 8 내지 14, 8.5 내지 14, 9 내지 14, 9.5 내지 14, 10 내지 14, 10.5 내지 14, 11 내지 14, 11.5 내지 14, 12 내지 14, 12.5 내지 14, 13 내지 14 또는 13.5 내지 14의 pH에서 염기 불활성화된다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물의 효소는 7.5 내지 13.5, 7.5 내지 13, 7.5 내지 12.5, 7.5 내지 12, 7.5 내지 11.5, 7.5 내지 11, 7.5 내지 10.5, 7.5 내지 10, 7.5 내지 9.5, 7.5 내지 9, 7.5 내지 8.5 또는 7.5 내지 8의 pH에서 염기 불활성화된다. 예를 들어, 무세포 반응 혼합물의 효소는 대략 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5 또는 14의 pH에서 염기 불활성화될 수 있다. 본 명세서에 제공된 바와 같이 무세포 반응 혼합물의 효소는 pH 6.5 내지 0 또는 그 미만에서 염기 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물의 효소는 6.5 내지 0.5, 6.5 내지 1, 6.5 내지 1.5, 6.5 내지 2, 6.5 내지 2.5, 6.5 내지 3, 6.5 내지 3.5, 6.5 내지 4, 6.5 내지 4.5, 6.5 내지 5 또는 6.5 내지 6의 pH에서 산 불활성화된다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물의 효소는 6 내지 0, 5.5 내지 0, 5 내지 0, 4.5 내지 0, 4 내지 0, 3.5 내지 0, 3 내지 0, 2.5 내지 0, 2 내지 0, 1.5 내지 0, 1 내지 0 또는 0.5 내지 0의 pH에서 산 불활성화된다. 예를 들어, 무세포 반응 혼합물의 효소는 대략6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5 또는 0의 pH에서 산 불활성화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물은 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소를 일시적으로 또는 비가역적으로 불활성화시키는 고염 또는 저염(염 농도의 변화)에 노출된다. "염 불활성화"는 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 무세포 반응 혼합물을 효소를 불활성화(또는 부분적으로 불활성화)시키기에 충분한 염 농도로 조정하는 과정을 지칭한다. 일반적으로 염 불활성화 과정은 효소의 변성(언폴딩)을 포함한다. 효소가 변성되는 염 농도는 유기체마다 달라진다. 예를 들어, 이. 콜라이에서, 천연 효소는 일반적으로 600mM 초과의 염 농도에서 변성된다. 변성 염 농도는 다른 유기체에 대한 변성 염 농도보다 높거나 낮을 수 있다. 염은 음이온과 양이온의 조합물이다. 본 명세서에 제시된 바와 같은 무세포 반응 혼합물에서 바람직하지 않은 효소 활성의 염 불활성화에 사용될 수 있는 양이온의 비제한적 예는 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 암모늄을 포함한다. 본 명세서에 제시된 바와 같은 무세포 반응 혼합물에서 바람직하지 않은 효소 활성의 염 불활성화에 사용될 수 있는 음이온의 비제한적 예는 아세테이트, 클로라이드, 설페이트 및 포스페이트를 포함한다. 본 명세서에 제공된 바와 같은 무세포 반응 혼합물의 효소는 600 내지 1000mM 이상의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 무세포 반응 혼합물의 효소는 700 내지 1000mM, 750 내지 1000mM, 800 내지 1000mM, 850 내지 1000mM, 900 내지 1000mM, 950 내지 1000mM의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 무세포 반응 혼합물의 효소는 600 내지 950mM, 600 내지 900mM, 600 내지 850mM, 600 내지 800mM, 600 내지 750mM, 600 내지 700mM 또는 600 내지 650mM의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 무세포 반응 혼합물의 효소는 대략 600mM, 650mM, 700mM, 750mM, 800mM, 850mM, 900mM, 950mM 또는 1000mM의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 본 명세서에 제공된 바와 같은 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 무세포 반응 혼합물의 효소는 400 내지 1mM 또는 그 미만의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 무세포 반응 혼합물의 효소는 350 내지 1mM, 300 내지 1mM, 250 내지 1mM, 200 내지 1mM, 150 내지 1mM, 100 내지 1mM 또는 50 내지 1mM의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 무세포 반응 혼합물의 효소는 400 내지 50mM, 400 내지 100mM, 400 내지 150mM, 400 내지 200mM, 400 내지 250mM, 400 내지 300mM 또는 400 내지 350mM의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 무세포 반응 혼합물의 효소는 대략 400mM, 350mM, 300mM, 250mM, 200mM, 150mM, 100mM, 50mM 또는 1mM의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유기 용매를 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 반응 혼합물에 첨가하여 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소를 불활성화시킨다. 유기 용매의 비제한적인 예는 에탄올, 메탄올, 에터, 다이옥산, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 아세토나이트릴, 다이메틸 설폭사이드 및 톨루엔을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세제를 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 반응 혼합물에 첨가하여 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소를 불활성화시킨다. 세제의 비제한적인 예는 소듐 도데실 설페이트(SDS), 에틸 트라이메틸암모늄 브로마이드(ETMAB), 라우릴 트라이메틸 암모늄 브로마이드(LTAB) 및 라우릴 트라이메틸암모늄 클로라이드(LTAC)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 화학적 저해제를 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 반응 혼합물에 첨가하여 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소를 불활성화시킨다. 화학적 저해제의 비제한적인 예는 소듐 오쏘바나데이트(단백질 포스포티로실 포스파타제의 저해제), 소듐 플루오라이드(포스포세릴 및 포스포트레오닐 포스파타제의 저해제), 피로인산나트륨(포스파타제 저해제), 인산나트륨 및/또는 인산칼륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 저해제는 화학적 저해제 라이브러리로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 조건부 접근법 중 임의의 것의 경우, 세포 용해물 또는 무세포 반응 혼합물에 존재하는 경로 효소 중 임의의 것이 또한 제거 조건(예를 들어, 고온 또는 저온, 산성 또는 염기성 pH 값, 고염 또는 저염, 세제 및/또는 유기 용매)에 노출될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 경로 효소(예를 들어, 폴리포스페이트 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제 및/또는 중합효소)는 제거 조건을 견딜 수 있다. 효소는 제거 조건에 노출된 후 효소가 (불활성화 조건에 노출되기 전의 효소 활성에 비해) 적어도 10%(예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%)의 효소 활성을 유지하는 경우 제거 조건을 견디는 것으로 간주된다.
예를 들어, 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 무세포 반응 혼합물의 천연 효소가 열-불활성화(예를 들어, 적어도 55℃ 또는 55 내지 95℃의 온도에, 적어도 30초 또는 30초 내지 60분 노출)되는 경우, 그 경로 효소는 열안정적인 효소일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 뉴클레오사이드 키나제, 포스포리보실트랜스퍼라제, 뉴클레오사이드 포스포릴라제, 리보키나제, 포스포펜토무타제 및 중합효소 중 적어도 1종은 이의 열안정성 변이체이다. 효소(예를 들어, 키나제 또는 중합효소)는 효소가 (a) 천연 효소를 변성시키는 고온(즉, 42℃)에 일시적으로 노출된 후에도 활성을 유지하거나 (b) 천연 효소가 낮은 속도로 기능하는 중간 내지 높은 온도에 일시적으로 노출된 후 높은 속도로 기능하는 경우 열 안정적이라고 간주된다. 열안정성 효소는 공지되어 있고, 사용을 위한 열안정성 효소의 비제한적인 예는 본 명세서에 제공되어 있다. 제거 조건을 견딜 수 있는 경로 효소의 비제한적인 예가 또한 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 천연 효소는 반응 혼합물로부터 물리적으로 제거된다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소는 무세포 반응 혼합물로부터 침전된다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소는 반응 혼합물로부터 여과(예를 들어, 크기 기준)된다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소는 포획 및/또는 크로마토그래피(예를 들어, 고정상에 대한 차동 친화도에 의해서)를 통해서 반응 혼합물로부터 제거된다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소는 친화도 크로마토그래피를 통해 반응 혼합물로부터 제거된다. 친화도 크로마토그래피의 예는 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 금속 결합 크로마토그래피(예를 들어, 니켈 크로마토그래피), 렉틴 크로마토그래피 및 GST 크로마토그래피를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소는 이온 교환 크로마토그래피를 통해 반응 혼합물로부터 제거된다. 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)의 예는 다이에틸아미노에틸(DEAE) 크로마토그래피, 4차 아미노에틸(QAE) 크로마토그래피 및 4차 아민(Q) 크로마토그래피를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 양이온 교환 크로마토그래피의 예는 카복시메틸(CM) 크로마토그래피, 설포에틸(SE) 크로마토그래피, 설포프로필(SP) 크로마토그래피, 포스페이트(P) 크로마토그래피 및 설포네이트(S) 크로마토그래피를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 활성을 나타내는 효소는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 통해 반응 혼합물로부터 제거된다. 소수성 상호작용 크로마토그래피의 예는, 페닐 세파로스 크로마토그래피, 부틸 세파로스 크로마토그래피, 옥틸 세파로스 크로마토그래피, 캡토 페닐 크로마토그래피, 토이펄(Toyopearl) 부틸 크로마토그래피, 토이펄 페닐 크로마토그래피, 토이펄 헥실 크로마토그래피, 토이펄 에터 크로마토그래피 및 토이펄 PPG 크로마토그래피를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 상기에 설명한 화학물질 중 임의의 것이 대안적으로 경로 효소를 고정하거나 포획하는 데 사용될 수 있다.
아연 의존성 효소인 페니실리엄 시트리넘으로부터의 뉴클레아제 P1은 RNA에서 3'-5'-포스포다이에스터 결합 및 염기 특이성이 없는 3'-포스페이트에 의해서 말단화된 모노- 및 올리고뉴클레오타이드 내의 열 변성된 DNA 및 3'-포스포모노에스터 결합 둘 다를 가수분해시킨다. 뉴클레아제 P1은 단일-가닥 DNA 및 RNA를 리보뉴클레오사이드 5'-모노포스페이트의 수준으로 완전히 가수분해시킬 수 있다.
이. 콜라이 RNase I은 온전한 박테리아 세포의 원형질막 주변 공간에 위치하며, rRNA, mRNA 및 tRNA를 포함한 광범위한 RNA 분자의 해중합을 촉매한다. 생리 조건 하에서, 이 효소의 주변 세포질 국소화는 효소가 세포 내에서 RNA 안정성에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 의미하지만; 박테리아 세포 용해물에서 주변 세포질과 세포질을 혼합하면 RNase I이 세포 RNA에 접근할 수 있다. 세포 용해물에서 RNase I의 존재는 RNA 분해를 통해 합성 RNA의 수율을 감소시킬 수 있다. RNase I 또는 RNase I을 암호화하는 유전자인 rna는 세포 생존에 필수적이지 않으므로, 일부 실시형태에서, rna는 조작된 숙주 세포에서 결실되거나 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 반응 혼합물 중의 RNase I은 내인성 RNA의 해중합 후에 열 활성화된다.
이. 콜라이 RNase R 및 RNase T는 dsRNA, rRNA, tRNA 및 mRNA뿐만 아니라 구조화되지 않은 작은 RNA 분자의 해중합을 촉매한다. 효소 및 효소를 암호화하는 유전자 rnr 및 rnt 각각은 박테리아 세포 생존에 필수적이지 않으므로, 일부 실시형태에서, rnr 및/또는 rnt는 조작된 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이 세포)에서 결실되거나 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물 중의 RNase R 및/또는 RNase T는 내인성 RNA의 해중합 후에 열 불활성화될 수 있다.
이. 콜라이 RNaseE 및 PNPase는 세포에서 mRNA 턴오버를 담당하는 데그라다솜(degradasome)의 성분이다. RNase E는 PNPase 및 RNase II와 함께 기능하여 세포 mRNA 풀을 턴오버시킨다고 생각된다. RNase E, rne를 암호화하는 유전자의 파괴는 이. 콜라이에서 치명적이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물 중의 RNase E는 내인성 RNA의 해중합 후에 열 불활성화될 수 있다. PNPase 또는 PNPase를 암호화하는 유전자 pnp는 세포 생존에 필수적이지 않으므로, 일부 실시형태에서, 조작된 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이 숙주 세포)에서 pnp가 결실되거나 돌연변이될 수 있다. 다른 실시형태에서, 반응 혼합물 중의 PNPase는 내인성 RNA의 해중합 후에 열 활성화된다.
이. 콜라이 RNase II는 3'에서 5' 방향으로 mRNA와 tRNA를 모두 해중합시킨다. RNase II 또는 RNase II를 암호화하는 유전자인 rnb는 세포 생존에 필수적이지 않으므로, 일부 실시형태에서, rnb는 조작된 숙주 세포에서 결실되거나 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 반응 혼합물 중의 RNase II는 내인성 RNA의 해중합 후에 열 활성화된다.
pnp 또는 rnb는 숙주 세포 생존에 필수적이지 않지만, 둘 다 동시에 파괴되면 치명적일 수 있다. 따라서 일부 실시형태에서, PNPase 및 RNase II 둘 다가 모두 열 활성화된다.
뉴클레오사이드 모노포스페이트 또는 뉴클레오사이드 다이포스페이트의 뉴클레오사이드 트라이포스페이트로의 인산화
세포 RNA가 성분 단량체로 전환되고, RNA를 해중합시키는 뉴클레아제(들) 및 바람직하지 않은 효소 활성의 제거 또는 비활성화 후, 생성된 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP) 또는 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP)를 인산화시키고, 그 다음 그것을 중합시켜 목적하는 합성 RNA, 예컨대, 단일-가닥 mRNA를 형성한다. 이 과정은 에너지 의존적이며, 따라서 예를 들어, 포스포엔올피루베이트, ATP 또는 폴리포스페이트와 같은 고에너지 포스페이트 공급원, 전형적으로 에너지원이 필요하다.
일부 실시형태에서, 에너지원은 세포 용해물에 직접 첨가되는 ATP이다. 다른 실시형태에서, ATP 재생 시스템을 사용하여 에너지원을 제공한다. 예를 들어, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 키나제를 사용하여 ATP를 생산할 수 있다. 다른 예는 ATP를 생산하기 위해 아세틸-포스페이트 및 아세테이트 키나제를 사용하는 것; ATP를 생산하기 위해 포스포-크레아틴 및 크레아틴 키나제를 사용하는 것; 및 ATP를 생산하기 위해 포스포엔올피루베이트 및 피루베이트 키나제를 사용하는 것을 포함한다. 다른 ATP(또는 기타 에너지) 재생 시스템을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 에너지원의 적어도 하나의 성분이 세포 용해물, 세포 용해물 혼합물, 또는 무세포 반응 혼합물에 첨가된다. 에너지원의 "성분"은 에너지(예를 들어, ATP)를 생산하는 데 필요한 기질(들) 및 효소(들)를 포함한다. 이들 성분의 비제한적인 예는 폴리포스페이트 키나제를 갖는 폴리포스페이트, 아세테이트 키나제를 갖는 아세틸-포스페이트, 크레아틴 키나제를 갖는 포스포-크레아틴 및 피루베이트 키나제를 갖는 포스포엔올피루베이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 키나제는 데이노코커스 게오써말리스 폴리포스페이트 키나제 2(DgPPK2)이다. 일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 키나제는 서열번호 1로 표시되는 키나제이다.
키나제는 ATP와 같은 고에너지 포스페이트-공여 분자에서 특정 기질/분자로 포스페이트기의 전달을 촉매하는 효소이다. 이 과정은 기질이 고에너지 ATP 분자로부터 공여된 포스페이트기를 얻는 인산화라고 지칭된다. 이러한 트랜스에스터화는 인산화된 기질 및 ADP를 생산한다. 본 개시내용의 키나제는 일부 실시형태에서 NMP를 NDP로 그리고 NDP를 NTP로 전환시킨다. 뉴클레오타이드-특이적(AMP, GMP, CMP, UMP) 및 범특이적(NDP) 전달 효소 둘 다가 본 발명에서 사용하기 위해 고려된다.
일부 실시형태에서, 키나제는 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제이며, ATP에서 NMP로 고에너지 포스페이트의 전달을 촉매하여, ADP와 NDP를 생산한다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물은 다음 4가지 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제 중 하나 이상(또는 모두)을 포함한다: 우리딜레이트 키나제, 시티딜레이트 키나제, 구아닐레이트 키나제 및 아데닐레이트 키나제. 예시적인 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제를 하기 표 2 내지 표 5에 열거한다. 효소의 열안정성 변이체가 본 개시내용에 포함된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제 중 하나 이상은 열안정성이다. 바람직한 실시형태에서, 모든 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제는 열안정성이다. 일부 실시형태에서, 열안정성 키나제는 NTP 또는 RNA 생산 반응에 사용하기 전에 열-불활성화되는 바람직하지 않은 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 우리딜레이트 키나제는 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus)로부터 기원하거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 우리딜레이트 키나제는 서열번호 14로 표시되는 키나제이다. 일부 실시형태에서, 시티딜레이트 키나제는 써머스 써모필레스(Thermus thermophiles)로부터 기원하거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 시티딜레이트 키나제는 서열번호 13으로 표시되는 키나제이다. 일부 실시형태에서, 구아닐레이트 키나제는 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 기원하거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 구아닐레이트 키나제는 서열번호 15로 표시되는 키나제이다. 일부 실시형태에서, 아데닐레이트 키나제는 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus)로부터 기원한다. 일부 실시형태에서, 아데닐레이트 키나제는 서열번호 12로 표시되는 키나제이다.
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일부 실시형태에서, 키나제는 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제인데, 이것은 포스포릴기를 NDP에 전달하여, NTP를 생성한다. 포스포릴길기의 공여자는 비제한적으로 ATP, 폴리포스페이트 중합체 또는 포스포엔올피루베이트일 수 있다. NDP를 NTP로 전환시키는 키나제의 비제한적인 예는 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제, 폴리포스페이트 키나제 및 피루베이트 키나제를 포함한다. 상기 효소의 열안정성 변이체가 본 개시내용에 포함된다. 일부 실시형태에서, NDP 키나제(들)는 아퀴펙스 애올리커스로부터 얻어진다.
일부 실시형태에서, NMP에서 NTP로의 인산화는 폴리포스페이트 키나제(PPK)를 통해 고에너지 포스페이트가 폴리포스페이트로부터 ADP로 전달되는 폴리포스페이트-의존성 키나제 경로를 통해 일어난다. 일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 키나제는 폴리포스페이트 키나제 1(PPK1) 패밀리에 속하며, 폴리포스페이트로부터 ADP로 고에너지 포스페이트를 전달하여 ATP를 형성한다. 그 다음 이러한 ATP는 NMP 키나제에서 NMP를 동족 리보뉴클레오타이드 다이포스페이트(NDP)로 전환시키는 데 사용된다. NMP 키나제는 AMP 키나제, UMP 키나제, GMP 키나제, 및/또는 CMP 키나제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 또한, ATP는 NDP를 NTP로 변환시키기 위해 뉴클레오타이드 다이포스페이트 키나제에 의해 연속적으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 사용된 폴리포스페이트 키나제는 폴리포스페이트 키나제 2(PPK2) 패밀리 키나제이다. 일부 특정 실시형태에서, 폴리포스페이트 키나제는 클래스 I PPK2 패밀리에 속하며, 이것은 폴리포스페이트로부터 NDP로 고에너지 포스페이트를 전달하여 NTP를 형성한다. 시스템에서 생산된 ATP는 NMP를 NDP로 변환시키는 고에너지 포스페이트 공여자로 사용된다. 일부 특정 실시형태에서, 폴리포스페이트 키나제는 클래스 III PPK2 패밀리에 속하며, 이것은 폴리포스페이트로부터 NMP 및 NDP로 고에너지 포스페이트를 전달하여 NTP를 형성한다. 일부 실시형태에서, 클래스 III PPK2는 단독으로 사용되어 NMP로부터 NTP를 생산한다. 다른 실시형태에서, 클래스 III PPK2는 다른 키나제와 조합하여 사용된다. 클래스 III PPK2는 ADP, AMP 및 폴리포스페이트로부터 ATP를 생산하는데, 이것은 그 다음 NMP 및 NDP 키나제에 의해 사용되어 NMP를 NTP로 전환시킨다. 예시적인 폴리포스페이트 키나제를 표 6에 열거한다.
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일부 실시형태에서, CMP, UMP, GMP, NDP 및 PPK 키나제의 일부 또는 전부는 반응 후에 열 불활성화된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서 제공되는 무세포 반응 혼합물에 사용되는 PPK2 효소는 열안정성일 수 있다. 예를 들어, PPK2 효소는 폴리포스페이트 중합보다 ATP 합성을 선호하고, ADP 및 AMP 둘 모두를 ATP로 전환시키는 열안정성 클래스 III PPK2 효소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 키나제는 데이노코커스 게오써말리스로부터 기원하거나 이로부터 유래된 클래스 III PPK2 효소이다. 일부 실시형태에서, 폴리포스페이트 키나제는 서열번호 1로 표시되는 키나제이다. 일부 실시형태에서, PPK2 효소는 헥사메타포스페이트와 같은 폴리포스페이트를 예를 들어, 10 내지 800mM/시간(예를 들어, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 또는 800mM/시간)의 범위의 속도로 ATP로 전환시키는 데 사용된다.
본 개시내용은 또한 융합 효소를 포함한다. 융합 효소는 다수의 활성을 나타낼 수 있으며, 각각은 상이한 효소의 활성에 상응한다. 예를 들어, 독립적인 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제 및 독립적인 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제를 사용하는 대신, 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제 활성 및 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제 활성 둘 다를 갖는 융합 효소(또는 임의의 다른 효소)를 사용할 수 있다.
본 개시내용은 또한 효소의 변이체(예를 들어, "PPK2 변이체")뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 효소 중 임의의 하나 이상의 용도를 구현한다는 것을 이해해야 한다. 변이체 효소는 참조 효소와 어느 정도의 서열 동일성을 공유할 수 있다. 용어 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정되는 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 동일성은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, "알고리즘")에 의해 처리되는 갭 정렬(존재하는 경우)이 있는 둘 이상의 서열 중 더 작은 것 간의 동일한 일치 비율을 측정한다. 관련 분자의 동일성은 공지된 방법으로 쉽게 계산될 수 있다. 그것이 아미노산 또는 핵산 서열에 적용될 때 "퍼센트(%) 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요할 경우 갭을 도입한 후, 최대 퍼센트 동일성을 달성하는 제2 서열의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에서의 잔기와 동일한 후보 아미노산 또는 핵산 서열에서의 잔기(아미노산 잔기 또는 핵산 잔기)의 백분율로서 정의된다. 동일성은 퍼센트 동일성의 계산에 의존하지만, 계산에 도입된 갭 및 페널티로 인해 값에 있어서 상이할 수 있다. 특정 서열의 변이체는 본 명세서에 기재되고, 당업자에게 공지된 서열 정렬 프로그램 및 파라미터에 의해 결정되는 경우, 특정 참조 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 가질 수 있다.
2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 동일성을 결정하는 기술은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 성문화되어 있다. 2개의 서열 사이의 상동성을 측정하기 위한 예시적인 컴퓨터 소프트웨어는 GCG 프로그램 패키지(문헌[Devereu et al., 1984, Nucleic Acids Research 1: 387, 1984)], BLAST 수위트(문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389]) 및 FASTA(문헌[Altschul et al., 1990, J. Molec. Biol. 215: 403, 1990])을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 다른 기술은 스미쓰-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘(문헌[Smith et al., 1981, J. Mol. Biol. 147: 195]); 니들만-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(문헌[Needleman, S. B. et al., 1970, J. Mol. Biol. 48: 443]); 및 Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm(FOGSAA)(문헌[Chakraborty et al., 2013, Sci Rep. 3: 1746, 2013])을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
DNA 주형
일부 실시형태에서, 반응은 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 제조될 mRNA를 암호화하는 DNA 주형을 포함한다. mRNA를 암호화하는 DNA 주형은 (예를 들어, 플라스미드 상의 또는 게놈 DNA에 통합된) 조작된 세포로부터 유래될 수 있거나 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해서 생산된다. 일부 실시형태에서, DNA 주형은 RNA의 생합성 동안(예를 들어, 열 불활성화 단계 이후에) 무세포 반응 혼합물에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물에서 DNA 주형 농도는 0.005 내지 1.0g/ℓ이다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물에서 DNA 주형 농도는 0.005g/ℓ, 0.01g/ℓ, 0.1g/ℓ, 0.5g/ℓ 또는 1.0g/ℓ이다.
DNA 주형은 프로모터, 선택적으로 유도성 프로모터를 포함한다. DNA 주형은 또한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적하는 RNA 생성물(오픈 리딩 프레임 또는 ORF)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 선택적으로, DNA 주형은 전사 종결자를 포함한다.
프로모터 또는 종결자는 자연 발생 서열 또는 조작된 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 자연 발생 서열이다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 조작된 서열이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 전사 활성을 향상시키도록 조작된다. 일부 실시형태에서, 종결자는 자연 발생 서열이다. 다른 실시형태에서, 종결자는 조작된 서열이다. DNA 주형은 일부 경우에 mRNA의 전사를 선택적으로 촉진하는 전사 프로모터를 갖도록 조작될 수 있다.
mRNA는 암호 서열의 한쪽 또는 양쪽에 비번역 영역(UTR)을 함유할 수 있다. 5' 쪽에 위치하면 5' UTR(또는 리더 서열)이라고 하고, 3' 쪽에 위치하면 3' UTR(또는 트레일러 서열)이라고 한다. UTR은 본 명세서에 기재된 기능에 제한되지 않고 다양한 생물학적 기능을 가질 수 있다. 5' UTR은 번역을 조절하는 2차 구조를 형성할 수 있으며, 일부 경우에 그 자체로 번역될 수 있다. 5' UTR은 유리하게는 리보솜이 결합하여 mRNA의 번역을 개시하도록 하는 리보솜에 의해 인식되는 서열을 포함한다. 일부 5' UTR은 단백질과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 일부 5' UTR 서열은 mRNA 국지화 및 외수송 신호 및 세포 기전과 연결되어 있다. 메신저 RNA의 3'-미번역 영역(3' UTR)의 서열 및 구조는 이들의 안정성, 국지화 및 발현을 제어할 수 있다. 3' UTR 조절 요소는 microRNA(miRNA), 이의 관련 머시너리 및 RNA-결합 단백질(RBP)을 포함하는 광범위한 트랜스-작용 인자에 의해 인식된다. 차례로, 이러한 인자는 3' UTR에 의해서 암호화된 조절 프로그램을 실행하기 위한 일반적인 기계론적 전략을 촉발한다.
일부 실시형태에서 5'UTR은 5'UTR의 5' 단부에 위치된 초기 전사된 서열(ITS)을 포함할 수 있으며, 이는 전사 개시 효율을 개선하여 전사 반응(예를 들어, 무세포 반응)으로부터 RNA 생성물 수율을 최대화할 수 있다. ITS는 약 6 내지 15개 뉴클레오타이드의 짧은 서열이다. ITS는 존재하는 경우 전사의 초기 단계(시작 및 프로모터 제거를 통한 연장 단계로의 전환)에서 중요한 역할을 하며, 주어진 프로모터로부터의 전사의 전체 속도 및 수율에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, ITS는 자연 발생 ITS, 예를 들어, T7 클래스 III 프로모터의 하류에서 발견되는 공통 ITS이다. 일부 실시형태에서, 공통 T7 클래스 III 프로모터 ITS는 6개 뉴클레오타이드 길이(GGGAGA)이다. 일부 실시형태에서, ITS는 합성 ITS, 예를 들어, GGGAGACCAGGAATT(서열번호 17)이다. 일부 실시형태에서, ITS는 합성 ITS의 6 내지 15개 뉴클레오타이드("절두된 ITS"), 예를 들어, GGGAGACCAGGAATT(서열번호 17)이다.
일부 실시형태에서, DNA 주형에 의해 암호화된 전사된 RNA는 하나 이상의 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함한다. UTR은 mRNA의 번역 수준 및 처리를 최적화하기 위해 mRNA 암호 서열과 전략적으로 또는 경험적으로 일치될 수 있으며; 즉, 이것은 mRNA의 모듈 성분이다. DNA 주형은 mRNA 5' UTR 서열, mRNA 3'UTR 서열을 암호화하는 DNA를 함유할 수 있으며, 둘 다는 mRNA의 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 DNA에 측접할 수 있거나 측접할 수 없다. 이러한 방법에 사용되는 UTR 서열은 여러 종 및 유전자에서 유래할 수 있으며, 5' 및 3' 서열은 둘 다 존재하는 경우 동일한 종 또는 유전자에서 유래할 필요가 없다. UTR 서열은 특정 2차 구조, 결합 부위 또는 다른 요소를 함유하도록 조작될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 UTR은 표 7에 열거된 UTR을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
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본 개시내용은 생성된 mRNA의 3' 단부에서 mRNA에 대한 폴리아데닐레이트 "테일" 서열을 암호화하는 DNA 주형을 고려한다. 일부 실시형태에서, 폴리아데닐레이트 테일은 50 내지 250개 뉴클레오타이드 길이이다. 본 개시내용은 또한 폴리아데닐레이트 테일이 암호화되지 않은 DNA 주형을 고려한다. 선택적으로, DNA 주형은 폴리아데닐화 신호를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리아데닐화 신호는 폴리아데닐화 중합효소에 의해서 판독된다. 선택적으로, DNA 주형은 생성된 mRNA의 3' 단부에서 리보자임 서열을 암호화하여, 리보자임은 폴리아데닐레이트 테일에 대해 3'에 위치된다.
일부 실시형태에서, DNA 주형은 선형이다. DNA 주형을 중합효소 연쇄 반응을 통해 생성될 수 있다. DNA 주형은 원형 플라스미드, 선형화된 원형 플라스미드 또는 선형 플라스미드를 포함하는 카세트 또는 플라스미드에 포함될 수 있다. 사용된 플라스미드는 높은-카피 또는 중간-카피 복제 기점을 갖는 pUC-패밀리 또는 pET-패밀리를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 것일 수 있다.
DNA 주형은 제한 엔도뉴클레아제(제한 효소로도 알려짐) 절단 부위를 포함할 수 있다. DNA 주형이 부위를 함유하는 제한 엔도뉴클레아제는 타입 IIS 다양성 제한 엔도뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제한 효소는 뭉툭한 방식으로 절단되거나 5' 오버행을 초래한다. 일부 실시형태에서, 제한 엔도뉴클레아제는 T7 중합효소의 바람직하지 않은 않는 전사 활성을 피하기 위해 3' 오버행 없이 절단된다. 일부 실시형태에서, 제한 엔도뉴클레아제는 절단 부위에 대한 5' 단부에 대한 서열 요건을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 제한 엔도뉴클레아제 부위는 제한 효소가 폴리아데닐레이트 테일-생성 서열 뒤에서 절단되도록 위치된다. 일부 실시형태에서, 제한 엔도뉴클레아제 부위는 제한 효소가 폴리아데닐레이트 테일-생성 서열 뒤에서 절단되도록 위치되고, 마지막 아데닌 염기 뒤에는 어떠한 추가 뉴클레오타이드도 첨가되지 않는다. 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 원형 플라스미드를 갖는 실시형태에서, 원형 플라스미드를 해당 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 그것을 선형화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제한 효소는 배양물 중의 세포에 의해 생산된다. 일부 실시형태에서, 제한 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제를 생산하는 세포로부터 유래된 세포 용해물로부터 제조된다. 일부 실시형태에서, 플라스미드 DNA 및 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 주형이 선형화되는 조건에서 함께 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 플라스미드 DNA 및/또는 제한 엔도뉴클레아제는 선형화 전 또는 후에 정제된다. 원형 플라스미드는 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 다른 주형 형식(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 화학적 합성, 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 생성된 선형 DNA 주형)이 사용될 수 있지만, DNA 주형은 일반적으로 플라스미드와 같은 벡터에 제공된다.
일부 실시형태에서, 하나 초과의 DNA 주형이 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시형태에서, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 DNA 주형이 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 mRNA 서열이 단일 주형에 암호화된다.
일부 실시형태에서, DNA 주형을 함유하는 용해물은 중합 단계 전에 열 불활성화 단계로 처리된다.
뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 리보핵산으로의 중합
상기에 개시된 바와 같이 NTP가 생산되고, 하나 또는 복수의 DNA 주형이 제공된 후, 예를 들어 DNA-의존성 RNA 중합효소를 사용하여 NTP를 RNA(예를 들어, ssRNA)로 중합함으로써 mRNA의 생합성이 달성된다. 방법의 이 단계에서, DNA 주형은 관심 RNA로 전사된다.
ATP는 PPK의 존재 하에서 정제된 AMP 또는 ADP와 포스페이트 공여자를 사용하여 생산될 수 있다. 또 다른 양상에서 ATP는 PPK의 존재 하에서 세포 RNA 및 포스페이트 공여자로부터 유래된 AMP 또는 ADP를 사용하여 생산될 수 있다.
유사하게, GTP는 반응에 직접 첨가될 수 있거나 1종 이상의 키나제의 존재 하에 정제된 GMP 또는 GDP와 포스페이트 공여자를 사용하여 GTP를 생산할 수 있다. 추가의 또 다른 양상에서, GTP는 1종 이상의 키나제의 존재 하에서 세포 RNA로부터 유래된 GMP 또는 GDP 및 포스페이트 공여자로부터 생산될 수 있다.
RNA 중합은 NTP, 전사 프로모터를 포함하는 DNA 주형 및 전사 프로모터를 인식하고 전사를 시작하는 중합효소(RNA 중합효소)가 필요하다. 전형적으로, 본 명세서에 제공된 바와 같이 사용하기 위한 중합효소는 동족 전사 프로모터에 대해 고도로 선택적이고, 충실도가 높으며, 고효율인 단일 소단위 중합효소이다. 이러한 중합효소의 예는 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 RNA 중합효소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소는 T7 파지 프로모터에 매우 특이적인 DNA-의존성 RNA 중합효소이다. 이러한 99kD 효소는 T7 프로모터의 제어 하에 DNA 주형으로부터 RNA 합성을 촉매한다. 박테리오파지 T3 RNA 중합효소는 T3 파지 프로모터에 매우 특이적인 DNA-의존성 RNA 중합효소이다. 이러한 99kD 효소는 T3 프로모터의 제어 하에 DNA 주형으로부터 RNA 합성을 촉매한다. 박테리오파지 SP6 RNA 중합효소는 SP6 파지 프로모터에 매우 특이적인 DNA-의존성 RNA 중합효소이다. 이러한 98.5kD 중합효소는 SP6 프로모터의 제어 하에 DNA 주형으로부터 RNA 합성을 촉매한다. T7, T3, SP6 중합효소 각각은 37 내지 40℃에서 최적으로 활성이다. 일부 실시형태에서, T7, T3 및 SP6 중합효소의 열안정성 변이체가 사용된다. 열안정성 변이체 중합효소는 전형적으로 40℃ 초과(또는 약 40 내지 60℃)의 온도에서 최적으로 활성이다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 열안정성이 아니다. 일부 실시형태에서, T7 중합효소가 사용된다. 일부 실시형태에서, 방법에 사용된 T7 중합효소는 중합 반응에 사용하기 전에 침전 및 원심분리에 의해 정제되거나 부분적으로 정제된다. 일부 실시형태에서, 침전 및 원심분리에 의해 정제되거나 부분적으로 정제된 T7 중합효소는 중합 반응에 사용하기 전에 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되거나 부분적으로 정제된다.
Figure pct00016
본 명세서에 개시된 바와 같이, "RNA의 생합성을 위한 조건"으로도 지칭되는 "뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 생산 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 중합을 초래하는 조건"은 예를 들어, pH, 온도, 시간 길이 및 세포 용해물의 염 농도뿐만 아니라 외인성 보조인자를 포함한 중합효소 활성을 위한 최적 조건을 고려하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
RNA 생합성 동안 무세포 반응 혼합물의 pH는 3.0 내지 8.0의 값을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물의 pH 값은 3 내지 8, 4 내지 8, 5 내지 8, 6 내지 8, 7 내지 8, 3 내지 7, 4 내지 7, 5 내지 7, 6 내지 7, 3 내지 6, 4 내지 6, 5 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4 또는 4 내지 5이다. 일부 실시형태에서, 무세포 반응 혼합물의 pH 값은 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 또는 8.0이다. 이로운 실시형태에서, RNA의 생합성 동안 무세포 반응 혼합물의 pH 값은 7.0 내지 7.5이다.
RNA 생합성 동안 무세포 반응 혼합물의 온도는 15℃ 내지 95℃일 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 생합성 동안 무세포 반응 혼합물의 온도는 30 내지 60℃, 30 내지 50℃, 40 내지 60℃, 40 내지 50℃, 50 내지 70℃, 50 내지 60℃이다. 일부 실시형태에서, RNA 생합성 동안 무세포 반응 혼합물의 온도는 30℃, 32℃, 37℃, 40℃, 42℃, 45℃, 50℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃ 또는 60℃이다. 이로운 실시형태에서, RNA 생합성 동안 무세포 반응 혼합물의 온도는 37 내지 55℃이다.
RNA 생합성 동안 무세포 반응 혼합물은 15분(min) 내지 72시간(hr) 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 생합성 동안 무세포 반응 혼합물은 30분 내지 48시간동안 인큐베이션된다. 예를 들어, RNA 생합성 동안 무세포 반응 혼합물은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 이로운 실시형태에서, RNA 생합성 동안 무세포 반응 혼합물은 1 내지 4시간 동안 인큐베이션된다.
일부 중합효소 활성은 금속 이온의 존재를 요구할 수 있다. 따라서 일부 금속 이온이 세포 용해물에 첨가된다. 금속 이온의 비제한적인 예는Mg2+, Li+, Na+, K+, Ni2+, Ca2+, Cu2+ 및 Mn2+를 포함한다. 다른 금속 이온을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1종 초과의 금속 이온을 사용될 수 있다. 세포 용해물 중의 금속 이온의 농도는 0.1mM 내지 100mM 또는 10mM 내지 50mM일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물 중의 금속 이온 농도는 0.1, 0.2, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100mM이다. Mg2+가 반응에서 바람직한 금속 이온이다.
열안정성 효소
본 개시내용의 무세포 RNA 생합성 방법의 한 가지 이점은 예를 들어, 내인성 RNA를 합성 mRNA로 전환시키는 데 필요한 모든 효소가 단일 조작된 세포에서 발현될 수 있다는 것이다(그러나 반드시 그럴 필요는 없다). 예를 들어, 조작된 세포의 클론 집단을 목적하는 세포 밀도로 배양하고, 세포를 용해시키고, 내인성 RNA가 단량체 형태로 해중합되는 조건(예를 들어, 55 내지 99℃의 온도)에서 인큐베이션시키고, 내인성 뉴클레아제 및 포스파타아제를 불활성화시키기에 충분한 온도(예를 들어, 55 내지 99℃에 적용하고, ssRNA의 중합을 초래하는 조건(예를 들어, 55 내지 99℃에서 인큐베이션시킨다. 최종 생성물 합성 RNA로 진행시키기 위해서, NMP에서 NDP로의 전환에 필요한 효소(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제 및/또는 폴리포스페이트 키나제), NDP에서 NTP로의 전환에 필요한 효소(예를 들어, 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제 및/또는 폴리포스페이트 키나제) 및 NTP에서 RNA로의 전환에 필요한 효소(예를 들어, 중합효소)는 내인성 뉴클레아제(및/또는 외인성 뉴클레아제) 및 포스파타제의 열 불활성화 동안 변성을 피하기 위해 열안정성일 수 있다. 열안정성은 상대적으로 높은 온도에서 변성에 저항하는 효소의 품질을 나타낸다. 예를 들어, 효소가 42℃의 온도에서 변성(불활성화)되는 경우, 유사한 활성(예를 들어, 키나제 활성)을 갖는 효소가 42℃에서 변성되지 않으면 "열안정성"으로 간주된다.
효소(예를 들어, 키나제 또는 중합효소)는 효소가 (a) 다른 천연 효소를 변성시키는 고온에 일시적으로 노출된 후에도 활성을 유지하거나 (b) 천연 효소가 낮은 속도로 기능하는 중간 내지 높은 온도에 일시적으로 노출된 후 높은 속도로 기능하는 경우 열 안정성이라고 간주된다.
일부 실시형태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시켰을 비교적 높은 온도(예를 들어, 이. 콜라이로부터 얻은 키나제의 경우 41℃보다 더 높음, 다수의 RNA 중합효소의 경우 37℃보다 더 높음)에 일시적으로 노출된 후 50% 초과의 활성을 보유한다. 일부 실시형태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시켰을 비교적 높은 온도에 일시적으로 노출된 후 50 내지 100%의 활성을 보유한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시켰을 비교적 높은 온도에 일시적으로 노출된 후 50 내지 90%, 50 내지 85%, 50 내지 80%, 50 내지 75%, 50 내지 70%, 50 내지 65%, 50 내지 60% 또는 50 내지 55%의 활성을 보유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 변성시켰을 비교적 높은 온도에 일시적으로 노출된 후 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 활성을 보유한다.
일부 실시형태에서, 중간 내지 높은 온도(예를 들어, 42 내지 80℃)에 일시적으로 노출된 후 열안정성 효소의 활성은 유사한(비-열안정성) 천연 효소의 활성을 초과한다(예를 들어, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 초과).
열안정성 키나제의 활성은, 예를 들어, 키나제가 인산화시킬 수 있는 NMP 또는 NDP의 양에 의해서 측정될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 비교적 높은 온도(예를 들어, 42℃)에서 열안정성 키나제는 37℃에서 유사한 전환을 완결하기 위해서 필요한 동일한 양의 시간 내에, NMP의 50% 초과를 NDP로 전환시키거나 또는 NDP의 50% 초과를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시형태에서, 비교적 높은 온도(예를 들어, 42℃)에서 열안정성 키나제는 37℃에서 유사한 전환을 완결하기 위해서 필요한 동일한 양의 시간 내에, NMP의 60% 초과를 NDP로 전환시키거나 또는 NDP의 60% 초과를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시형태에서, 비교적 높은 온도(예를 들어, 42℃)에서 열안정성 키나제는 37℃에서 유사한 전환을 완결하기 위해서 필요한 동일한 양의 시간 내에, NMP의 70% 초과를 NDP로 전환시키거나 또는 NDP의 70% 초과를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시형태에서, 비교적 높은 온도(예를 들어, 42℃)에서 열안정성 키나제는 37℃에서 유사한 전환을 완결하기 위해서 필요한 동일한 양의 시간 내에, NMP의 80% 초과를 NDP로 전환시키거나 또는 NDP의 80% 초과를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시형태에서, 비교적 높은 온도(예를 들어, 42℃)에서 열안정성 키나제는 37℃에서 유사한 전환을 완결하기 위해서 필요한 동일한 양의 시간 내에, NMP의 90% 초과를 NDP로 전환시키거나 또는 NDP의 90% 초과를 NTP로 전환시킨다.
열안정성 중합효소의 활성은 예를 들어, 충실도(fidelity) 및 중합 동력학(예를 들어, 중합 속도)에 기초하여 평가된다. 따라서, 예를 들어, 열안정성 T7 중합효소의 1 단위는 30분 동안 37℃를 초과하는 온도(예를 들어, 50℃)에서 산 불용성 물질에 10 n㏖의 NTP를 혼입할 수 있다.
열안정성 효소(예를 들어, 키나제 또는 중합효소)는 42℃ 내지 99℃ 또는 더 높은 온도에서 활성을 보유할 수 있다(반응을 촉매할 수 있다). 일부 실시형태에서, 열안정성 효소는 42 내지 95℃, 42 내지 90℃, 42 내지 85℃, 42 내지 80℃, 42 내지 70℃, 42 내지 60℃, 42 내지 50℃, 50 내지 80℃, 50 내지 70℃, 50 내지 60℃, 60 내지 80℃, 60 내지 70℃ 또는 70 내지 80℃의 온도에서 활성을 유지한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃ 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃ 89℃ 또는 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃ 또는 99℃의 온도에서 활성을 유지할 수 있다. 열안정성 효소는 비교적 고온에서 15분 내지 48시간 동안 또는 더 긴 시간 동안 활성을 유지할 수 있다. 예를 들어, 열안정성 효소는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42 또는 48시간 동안 비교적 높은 온도에서 활성을 유지할 수 있다.
열안정성 RNA 중합효소는 야생형 효소를 변형시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 변형(예를 들어, 돌연변이)은 공지되어 있다. 예를 들어, 변이체 열안정성 T7 RNA 중합효소는 하기 점 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다: V426L, A702V, V795I, S430P, F849I, S633I, F880Y, C510R 및 S767G(EP2377928 및 EP1261696A1, 각각 참조에 의해 본 명세서에 포함됨). 다른 변이체 및 재조합 열안정성 중합효소가 본 개시내용에 포함된다. 야생형 T7 RNA 중합효소가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 열안정성 T7 중합효소를 사용하여 mRNA를 생산한다. 예를 들어, 1 내지 2%의 총 단백질의 농도를 갖는 열안정성 T7 중합효소(예를 들어, 40 내지 60℃의 온도에서 인큐베이션됨)를 사용하여 2g/ℓ/hr 초과의 속도(또는 예를 들어, 2g/ℓ/hr 내지 10g/ℓ/hr)로 mRNA를 합성할 수 있다. 또 다른 예로서, 3 내지 5%의 총 단백질의 농도를 갖는 열안정성 T7 중합효소(예를 들어, 40 내지 60℃의 온도에서 인큐베이션됨)를 사용하여 10g/ℓ/hr 초과의 속도(또는 예를 들어, 10g/ℓ/hr 내지 20g/ℓ/hr)로 mRNA를 합성할 수 있다.
본 개시내용의 다수의 실시형태가 열안정성 효소의 사용을 기술하지만, 다른 효소가 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 개시내용의 많은 부분이 열안정성 효소의 사용을 기재하지만, 다른 효소가 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 일부 실시형태에서, 정제된 중합효소는 열-불활성화된 세포 용해물에 외인성으로 첨가되어, 예를 들어, 열안정성 효소(들)의 임의의 감소 또는 손실을 보상할 수 있다.
폴리아데닐레이트 테일의 효소적 첨가
일부 실시형태에서, 폴리아데닐레이트 테일은 폴리뉴클레오타이드 아데닐릴트랜스퍼라제라고도 불리는 polyA 중합효소, EC 2.7.7.19를 사용하여 효소적으로 첨가된다. 이 효소는 기질로서 RNA 및 ATP를 사용하고, RNA의 3' 단부에 A 뉴클레오타이드의 첨가를 촉매한다. 일부 실시형태에서, RNA 중합효소가 예를 들어, 열 불활성화를 통해서 불활성화된 후에 polyA 중합효소를 사용한 폴리아데닐화는 RNA 합성 후에 별개의 단계에서 수행된다. 일부 실시형태에서, polyA 중합효소는 아데노신 모노포스페이트(AMP) 및 폴리포스페이트와 함께, 이 단계에서 첨가된다. 일부 실시형태에서, 첨가된 AMP는 정제되었다. 일부 실시형태에서, AMP는 NMP의 혼합물의 일부로서 또는 세포 용해물로서 제공된다.
조작된 세포
본 개시내용의 조작된 세포는 RNA를 생합성하는 데 요구되는 효소 활성 중 적어도 1종, 대부분 또는 전부를 포함한다. "조작된 세포"는 적어도 1종의 조작된(예를 들어, 재조합 또는 합성) 핵산을 포함하거나, 그렇지 않다면 이들이 이들의 자연 발생 대응물과 구조적으로 그리고/또는 기능적으로 구별되도록 변형된 세포이다. 따라서, 조작된 핵산을 함유하는 세포는 "조작된 세포"로 간주된다.
본 개시내용의 조작된 세포는 일부 실시형태에서, RNA, RNA를 해중합시키는 효소, 키나제 및/또는 중합효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 DNA 주형을 더 포함한다.
조작된 세포는 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커를 발현한다. 선택 가능한 마커는 전형적으로 세포의 형질주입 후(또는 외래 핵산을 세포 내로 도입하는데 사용되는 다른 절차 후) 조작된 핵산을 흡수하는 세포를 선택하는 데 사용된다. 따라서, 생성물을 암호화하는 핵산은 또한 선택 가능한 마커를 암호화할 수 있다. 선택 가능한 마커의 예는 비제한적으로 항생제에 대한 내성 또는 민감성을 증가시키거나 감소시키는 단백질 (예를 들어, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자) 또는 다른 화합물을 암호화하는 유전자를 포함한다. 선택 가능한 마커의 추가의 예는 비제한적으로 세포가 다른 필수적인 영양분이 결핍된 배지에서 성장하는 것을 가능하게 하는 단백질(영양요구성 마커)을 암호화하는 유전자를 포함한다. 다른 선택 가능한 마커는 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
조작된 세포는, 핵산(예를 들어, 조작된 핵산)에 의해 암호화된 생성물이 세포에서 생성되는 경우, 생성물을 "발현한다". 유전자 발현은 핵산의 형태의 유전적 지시가 생성물, 예컨대 단백질(예를 들어, 효소)을 합성하는 데 사용되는 과정을 지칭함이 당업계에 공지되어 있다.
조작된 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 박테리아 세 포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 또는 다른 유형의 세포이다. 예는 효모, 이. 콜라이 또는 비브리오 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이들 세포는 상업적으로 공급될 수 있다. 이들 세포는 표준 고 생산성 방법을 사용하여 배양물에서 성장될 수 있다.
본 개시내용의 조작된 박테리아 세포는 비제한적으로 조작된 에쉐리키아 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 지모모나스(Zymomonas) 종, 아세토박터 종, 시트로박터 종, 시네코시스티스 (Synechocystis) 종, 리조비움 종, 클로스트리디엄(Clostridium) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종, 잔토모나스 종, 락토바실러스 종, 락토코커스(Lactococcus) 종, 바실러스(Bacillus) 종, 알칼리게네스 종, 슈도모나스 종, 아에로모나스 종, 아조토박터 종, 코마모나스 종, 마이코박테리움(Mycobacterium) 종, 로도코쿠스(Rhodococcus) 종, 글루코노박터(Gluconobacter) 종, 랄스토니아(Ralstonia) 종, 악시디티오바실러스(Acidithiobacillus) 종, 미크로루나투스(Microlunatus) 종, 게오박터(Geobacter) 종, 게오바실러스(Geobacillus) 종, 아르트로박터(Arthrobacter) 종, 플라보박테리움(Flavobacterium) 종, 세라티아(Serratia) 종, 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora) 종, 써무스(Thermus) 종, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 종, 크로모박테리움 (Chromobacterium) 종, 시노리조비움(Sinorhizobium) 종, 사카로폴리스포라 종, 아그로박테리움 종 및 판토에아 종을 포함한다.
본 개시내용의 조작된 효모 세포는 비제한적으로 조작된 사카로마이세스종, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia) 및 피치아(Pichia)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 조작된 에쉐리키아 콜라이 세포, 바실러스 섭틸리스 세포, 슈도모나스 푸티다 세포, 사카로마이세스 세레비지애 세포 또는 락토바실러스 섭틸리스 브레비스 세포이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 조작된 에쉐리키아 콜라이 세포이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "로부터"는 유전자 및 유전자 생성물이 그 종에서 암호화되고, 자연적으로 생산된다는 것을 의미하고, 이 용어는 특히 이종 종, 특히 박테리아, 효모 또는 다른 재조합 숙주에서 이러한 종 및 재조합 생산으로부터의 단리를 포함하도록 의도된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 무세포 RNA-생합성 방법은 단일 조작된 세포에서 발현될 수 있다(그러나 반드시 그럴 필요는 없다). 예를 들어, 조작된 세포의 클론 집단을 목적하는 세포 밀도로 배양하고, 세포를 용해시키고, 내인성 RNA가 단량체 형태로 해중합되는 조건(예를 들어, 30 내지 37℃의 온도)에서 인큐베이션시키고, 내인성 뉴클레아제 및 포스파타아제를 불활성화시키기에 충분한 온도(예를 들어, 40 내지 99℃에 적용하고, ssRNA의 중합을 초래하는 조건(예를 들어, 30 내지 50℃에서 인큐베이션시킨다. 최종 생성물 합성 RNA로 진행시키기 위해서, NMP에서 NDP로의 전환에 필요한 효소(예를 들어, 뉴클레오사이드 모노포스페이트 키나제 및/또는 폴리포스페이트 키나제), NDP에서 NTP로의 전환에 필요한 효소(예를 들어, 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제 및/또는 폴리포스페이트 키나제) 및 NTP에서 RNA로의 전환에 필요한 효소(예를 들어, 중합효소)는 내인성 뉴클레아제(및/또는 외인성 뉴클레아제) 및 포스파타제의 열 불활성화 동안 변성을 피하기 위해 열안정성일 수 있다. 열안정성은 상대적으로 높은 온도에서 변성에 저항하는 효소의 품질을 나타낸다. 예를 들어, 효소가 42℃의 온도에서 변성(불활성화)되는 경우, 유사한 활성(예를 들어, 키나제 활성)을 갖는 효소가 42℃에서 변성되지 않으면 "열안정성"으로 간주된다.
조작된 핵산
용어 "핵산"은 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 지칭하고, 일부 경우에는, 포스포다이에스터 결합(예를 들어, 포스포다이에스터 "골격")을 함유할 수 있다. 핵산(예를 들어, 핵산의 성분 또는 일부)은 자연 발생일 수 있거나 또는 조작될 수 있다. "자연 발생" 핵산은 인간 개입의 부재 하에 자연에 존재하는 세포 내에 존재한다. "조작된 핵산"은 재조합 핵산 및 합성 핵산을 포함한다. "재조합 핵산"은 (예를 들어, 동일한 종 또는 상이한 종으로부터의) 핵산 분자를 연결함으로써 작제되고, 전형적으로, 살아있는 세포에서 복제될 수 있는 분자를 지칭한다. "합성 핵산"은 생물학적으로 합성되거나, 화학적으로 합성되거나, 다른 수단에 의해서 합성되거나 증폭된 분자를 지칭한다. 합성 핵산은 화학적으로 변형되거나 달리 변형되지만 자연 발생 핵산 분자와 염기쌍을 이룰 수 있는 핵산을 포함한다. 재조합 핵산 및 합성 핵산은 또한 상기 중 어느 것으로부터 발생한 분자를 포함한다. 조작된 핵산은 자연 발생인 핵산의 부분을 함유할 수 있지만, 전체로서, 조작된 핵산은 자연 발생하지 않으며, 인간 개입을 요구한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 생성물을 암호화하는 핵산은 재조합 핵산 또는 합성 핵산이다. 다른 실시형태에서, 생성물을 암호화하는 핵산은 자연 발생이다.
본 명세서에서 제공된 바와 같은 RNA를 암호화하는 조작된 핵산은 핵산의 나머지의 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산의 제어 영역인 "프로모터"에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 발현을 유도하거나, 그것이 조절하는 핵산의 전사를 유도한다.
프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 암호 절편의 상류에 위치한 5' 비-암호 서열을 단리함으로써 얻어질 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 회합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, 암호 핵산 서열은 이의 자연 환경에서 암호화된 서열과 통상적으로 회합되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에 위치될 수 있다. 이러한 프로모터는 다른 유전자의 프로모터; 임의의 다른 세포로부터 단리된 프로모터; 및 "자연 발생"이 아닌 합성 프로모터 또는 인핸서, 예컨대, 예를 들어, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 당업계에 공지된 유전자 조작의 방법을 통해 발현을 변경시킨 돌연변이를 함유하는 것을 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 외에도, 서열은 재조합 클로닝 및/또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 비롯한 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
프로모터는, 그것이 그 핵산의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기("유도하기") 위해 그것이 조절하는 핵산에 관하여 정확한 기능적 위치 및 배향으로 존재하는 경우, "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주된다.
본 개시내용의 조작된 핵산은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 함유할 수 있다. "구성적 프로모터"는 세포에서 일정하게 활성인 프로모터를 지칭한다. "유도성 프로모터"는 유도자 또는 유도제의 존재 하에서, 그에 의해 영향을 받거나, 그에 의해 접촉되거나, 억제를 유발하는 인자의 부재 하에서 활성화되는 경우, 전사적 활성을 개시하거나 향상시키는 프로모터를 지칭한다. 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 유도성 프로모터는 본 명세서에 기재되거나, 당업자에게 공지된 임의의 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 예는 비제한적으로 화학적으로/생화학적으로-조절된 및 물리적으로-조절된 프로모터, 예컨대, 알코올-조절된 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 발병기전-조절된 프로모터, 온도/열-유도성, 포스페이트-조절된(예를 들어, PhoA) 및 광-조절된 프로모터를 포함한다.
유도자 또는 유도제는 유도성 프로모터로부터의 전사 활성을 조절하는 데 있어서 활성이도록 하는 방식으로 유도성 프로모터와 접촉하는 내인성 또는 통상적으로 외인성 조건(예를 들어, 광), 화합물(예를 들어, 화학적 또는 비-화학적 화합물) 또는 단백질일 수 있다. 따라서, 핵산의 "전사를 조절하는 신호"는 유도성 프로모터에 작용하는 유도자 신호를 지칭한다. 전사를 조절하는 신호는 사용되는 조절 시스템에 따라 전사를 활성화시키거나 불활성화시킬 수 있다. 전사의 활성화는 전사를 유도하는 프로모터에 직접적으로 작용하거나, 프로모터가 전사를 유도하는 것을 방지하는 리프레서의 불활성화에 의해 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다. 반대로, 전사의 비활성화는 전사를 방지하는 프로모터에 직접적으로 작용하거나, 리프레서를 활성화시킨 후, 이것이 프로모터에 작용함으로써 프로모터에 간접적으로 작용하는 것을 포함할 수 있다.
조작된 핵산은 비제한적으로 형질전환, 형질주입(예를 들어, 화학적(예를 들어, 인산칼슘, 양이온성 중합체 또는 리포솜) 또는 비-화학적(예를 들어, 전기천공, 초음파천공, 임페일펙션(impalefection), 광학 형질주입, 수력학적 형질주입)) 및 형질도입(예를 들어, 바이러스 형질도입)을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
자연 발생 세포내 핵산에 의해 암호화된 효소 또는 다른 단백질은 "내인성 효소" 또는 "내인성 단백질"로 지칭될 수 있다.
세포 배양물 및 세포 용해물
전형적으로, 조작된 세포는 배양된다. "배양"은 세포를 제어된 조건 하에서, 전형적으로 이의 자연 환경 외부에서 성장시키는 과정을 지칭한다. 예를 들어, 조작된 세포, 예컨대, 조작된 박테리아 세포는 액체 "배양 배지"라고도 지칭되는 액체 영양분 브로쓰 중의 세포 현탁액으로서 성장될 수 있다.
통상적으로 사용되는 박테리아 에쉐리키아 콜라이 성장 배지의 예는 비제한적으로 다음을 포함한다: LB(Lysogeny Broth) 밀러(Miller) 브로쓰(1% NaCl): 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물 및 1% NaCl; LB(Lysogeny Broth) Lennox Broth(0.5% NaCl): 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물 및 0.5% NaCl; SOB 배지(Super Optimal Broth): 2% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4; SOC 배지(이화성 리프레서를 갖는 Super Optimal broth): SOB + 20mM 글루코스; 2xYT 브로쓰(2x 효모 추출물 및 Tryptone): 1.6% 펩톤, 1% 효모 추출물 및 0.5% NaCl; TB(Terrific Broth) 배지: 1.2% 펩톤, 2.4% 효모 추출물, 72mM KH2PO4, 17mM KH2PO44 및 0.4% 글리세롤; 및 SB(Super Broth)) 배지: 3.2% 펩톤, 2% 효모 추출물 및 0.5% NaCl 및 또는 Korz 배지(문헌[Korz, DJ et al. 1995]. 고 밀도 박테리아 이. 콜라이 성장 배지의 예는 DNAGroTM 배지, ProGroTM 배지, AutoXTM 배지, DetoXTM 배지, InduXTM 배지 및 SecProTM 배지를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 효소 또는 핵산의 발현을 발생시키는 조건 하에서 배양된다. 이러한 배양 조건은 발현될 특정 생성물 및 산의 바람직한 양에 의존할 것이다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 30℃ 내지 40℃의 온도에서 배양된다. 예를 들어, 조작된 세포는 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 또는 40℃의 온도에서 배양될 수 있다. 전형적으로, 조작된 세포, 예컨대 조작된 이. 콜라이 세포는 37℃의 온도에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 12시간 내지 72시간, 또는 그 이상의 시간의 기간 동안 배양된다. 예를 들어, 조작된 세포는 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 또는 72시간의 시간의 기간 동안 배양될 수 있다. 전형적으로, 조작된 세포, 예컨대, 조작된 박테리아 세포는 12 내지 24시간의 시간의 기간 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 37℃의 온도에서 12 내지 24시간 동안 배양된다.
일부 실시형태에서, (예를 들어, 액체 세포 배양 배지 중의) 조작된 세포는 5 내지 200의 600㎚의 파장에서 측정된 광학 밀도(OD600)로 배양된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 또는 200의 OD600으로 배양된다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 1×108(OD<1) 내지 2×1011(OD 약 200)개 살아있는 세포/㎖ 세포 배양 배지의 밀도로 배양된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011 또는 2×1011개 살아있는 세포/㎖의 밀도로 배양된다. (전환 인자: OD 1=8×108개 세포/㎖).
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 생물반응기에서 배양된다. 생물반응기는 단순히 세포가 배양되는 용기, 예컨대 단회-사용(일회용), 오토클레이빙 가능하거나, 멸균 가능할 수 있는 배양 플라스크, 접시, 또는 백을 지칭한다. 생물반응기는 유리로 제조될 수 있거나, 이것은 중합체-기재일 수 있거나, 이는 다른 물질로 제조될 수 있다. 생물반응기의 예는 비제한적으로 교반 탱크(예를 들어, 잘 혼합됨) 생물반응기 및 관상(예를 들어, 플러그 유동) 생물반응기, 에어리프트 생물반응기, 막 교반 탱크, 스핀 필터 교반 탱크, 비브리오믹서, 유동층 반응기 및 막 생물반응기를 포함한다. 생물반응기를 작동하는 방식은 배취식 또는 연속적 과정일 수 있고, 배양될 조작된 세포에 의존할 것이다. 생물반응기는 공급물 및 생성물 스트림이 시스템으로부터 연속적으로 공급되고 배출되는 경우 연속적이다. 배취식 생물반응기는 연속적인 재순환 유동을 가질 수 있지만, 영양분 또는 생성물 수거물의 연속적 공급은 갖지 않는다. 간헐적-수거 및 공급-배취(또는 배취 공급된) 배양을 위해, 세포를 조성에 있어서 배취 배지와 유사한 배지에서 보다 낮은 생존 가능한 세포 밀도로 접종한다. 세포를 영양분이 다소 고갈되고, 세포가 고정적인 성장 단계에 접근할 때까지, 필수적으로 외부 조작 없이 지수적으로 성장시킨다. 이 시점에서, 간헐적 수거 배취-공급 공정의 경우, 세포 및 생성물의 일부를 수거할 수 있고, 제거된 배양 배지를 신선한 배지로 보충한다. 이 과정을 수 회 반복할 수 있다. 재조합 단백질 및 항체의 생산을 위해, 공급-배취 공정이 사용될 수 있다. 세포가 지수적으로 성장하고 있는 반면, 영양분은 고갈되고 있고, 농축된 공급 배지(예를 들어, 10 내지 15배 농축된 기저 배지)는 추가의 영양분을 공급하기 위해 연속적으로 또는 간헐적으로 첨가되며, 이는 세포 농도 및 생산 단계의 길이를 추가로 증가시킨다. 신선한 배지는 배양 배지(브로쓰)의 제거 없이 세포 농도에 비례적으로 첨가될 수 있다. 배지의 첨가를 보충하기 위해, 공급-배취 배양은 생물반응기의 전체 용량보다 훨씬 더 낮은 부피(예를 들어, 최대 부피의 대략 40% 내지 50%)에서 시작된다.
본 개시내용의 일부 방법은 RNA(예를 들어, ssRNA 또는 dsRNA)의 대규모 생산에 관한 것이다. 대규모 생산 방법을 위해, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 5리터(ℓ) 내지 250,000ℓ 또는 그 초과의 부피로 성장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 10ℓ, 100ℓ, 1000ℓ, 10000ℓ 또는 100000ℓ 초과의 (또는 그와 동등한) 부피로 성장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 5ℓ, 10ℓ, 15ℓ, 20ℓ, 25ℓ, 30ℓ, 35ℓ, 40ℓ, 45ℓ, 50ℓ, 100ℓ, 500ℓ, 1000ℓ, 5000ℓ, 10000ℓ, 100000ℓ, 150000ℓ, 200000ℓ, 250000ℓ 또는 그 초과의 부피로 성장된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 5ℓ 내지 10ℓ, 5ℓ 내지 15ℓ, 5ℓ 내지 20ℓ, 5ℓ 내지 25ℓ, 5ℓ 내지 30ℓ, 5ℓ 내지 35ℓ, 5ℓ 내지 40ℓ, 5ℓ 내지 45ℓ, 10ℓ 내지 15ℓ, 10ℓ 내지 20ℓ, 10ℓ 내지 25ℓ, 20ℓ 내지 30ℓ, 10ℓ 내지 35ℓ, 10ℓ 내지 40ℓ, 10ℓ 내지 45ℓ, 10ℓ 내지 50ℓ, 15ℓ 내지 20ℓ, 15ℓ 내지 25ℓ, 15ℓ 내지 30ℓ, 15ℓ 내지 35ℓ, 15ℓ 내지 40ℓ, 15ℓ 내지 45ℓ 또는 15 내지 50ℓ의 부피로 성장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 액체 배양 배지에서 100ℓ 내지 300000ℓ, 100ℓ 내지 200000ℓ 또는 100ℓ 내지 100000ℓ의 부피로 성장될 수 있다.
전형적으로, 조작된 세포의 배양 후에는 세포를 용해시키는 것이 이어진다. "용해시키는"는 세포가 예를 들어, 바이러스, 효소, 기계 또는 삼투 기전에 의해 파괴되는 과정을 지칭한다. "세포 용해물"은 예를 들어, 세포소기관, 막 지질, 단백질, 핵산 및 반전된 막 소포를 비롯한 용해된 세포(예를 들어, 용해된 조작된 세포)의 내용물을 함유하는 유체를 지칭한다. 본 개시내용의 세포 용해물은 본 명세서에서 제공된 바와 같이 조작된 세포의 임의의 집단을 용해시킴으로써 생성될 수 있다.
"용해시키는"으로 지칭되는 세포 용해의 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것은 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 이러한 세포 용해 방법은 비제한적으로 물리적 용해, 예컨대, 균질화를 포함한다.
세포 용해는 주의깊게 제어된 세포 환경을 교란시켜, 비조절된 내인성 프로테아제 및 포스파타제에 의한 단백질 분해 및 변형을 발생시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 프로테아제 저해제 및/또는 포스파타제 저해제는 용해 전에 세포 용해물 또는 세포에 첨가될 수 있거나, 이들 활성은 열 불활성화 또는 유전자 불활성화에 의해 제거될 수 있다.
세포 용해물은 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 영양분과 배합될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 Na2HPO4, KH2PO4, NH4Cl, NaCl, MgSO4 또는 CaCl2와 배합될 수 있다. 다른 영양분의 예는 비제한적으로 황산마그네슘, 염화마그네슘, 오로트산마그네슘, 시트르산마그네슘, 일염기성 인산칼륨, 이염기성 인산칼륨, 삼염기성 인산칼륨, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 삼염기성 인산나트륨, 일염기성 인산암모늄, 이염기성 인산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄 및 수산화암모늄을 포함한다.
세포 용해물은 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 보조인자와 배합될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 아데노신 다이포스페이트(ADP), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+) 또는 효소의 활성에 요구되는 다른 비-단백질 화학 화합물(예를 들어, 유기 이온 및 보조효소)과 배합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 용해물은 RNA 해중합을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물은 ssRNA 또는 dsRNA의 생성을 발생시키는 조건 하에서 인큐베이션된다.
단일 반응에 사용되는 세포 용해물의 부피는 다양할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 용해물의 부피는 0.001 내지 10㎥이다. 예를 들어, 세포 용해물의 부피는 0.001㎥, 0.01㎥, 0.1㎥, 1㎥, 5㎥, 10㎥일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 용해물은 RNA 해중합 전에 추가로 가공된다. 총 세포 RNA는 확립된 기술, 예를 들어, TRIzol 시약 또는 염 또는 침전을 사용하여 배양된 세포로부터 회수될 수 있다.
캡핑
mRNA 캡은 리보솜 소단위의 동원, 리보솜 조립 및 번역의 촉진 및 엑소뉴클레아제 활성으로부터의 mRNA의 보호를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 기능을 제공한다.
캡핑은 다양한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡핑은 1종 이상의 효소를 사용하여 달성된다. 캡핑의 과정은 하기 표 9에 제시된 다양한 효소 활성을 요구한다. 일부 실시형태에서, 하나의 단백질이 4개 모두의 기능을 달성한다. 일부 실시형태에서, 4개의 활성은 2종, 3종 또는 4종의 효소에 의해서 달성된다.
Figure pct00017
캡핑은 RNA 중합 단계 이후에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 중합 반응은 캡핑 전에 비활성화된다. 일부 실시형태에서, 캡핑 효소는 메틸 공여자(예를 들어, S-아데노실메티오닌) 및 폴리포스페이트를 갖는 GTP 또는 GMP와 함께 반응에 첨가된다. 일부 실시형태에서, GMP는 반응에 존재하는 키나제에 의해서 GTP로 전환된다. 메신저 RNA는 다양한 효소를 사용하여 캡핑된다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 메신저 RNA를 캡핑하는데 잠재적으로 사용하기 위한 효소의 비포괄적인 목록이 표 10에 포함되어 있다.
Figure pct00018
Figure pct00019
일부 실시형태에서, mRNA는 캡 유사체를 사용하여 캡핑된다. 캡 유사체는 다이뉴클레오타이드 캡 유사체(예를 들어, 표준 캡 유사체 또는 항-역방향 캡 유사체, ARCA) 또는 3+ 뉴클레오타이드 캡 유사체(예를 들어, TriLink로부터의 CleanCap), 비메틸화된 캡 유사체 또는 메틸화된 캡 유사체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡 유사체는 중합 반응에 첨가된다.
일부 실시형태에서, 1종 이상의 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 서열이 캡 대신에 또는 캡에 더하여 포함된다. 일부 실시형태에서, IRES 서열은 5' UTR 서열에 포함된다. 일부 실시형태에서, IRES는 바이러스 게놈, 예컨대, 뇌심근염 바이러스(EMCV) 또는 크리켓 파랄리시스(Cricket Paralysis) 바이러스 (CrPV)로부터 기원한다. 일부 실시형태에서, IRES는 세포 mRNA, 예컨대, 아폽토시스 프로테아제 활성화 인자(Apaf-1), 미엘린 전사 인자 2(MYT-2) 또는 c-myc로부터 기원한다.
캡핑은 mRNA 합성 과정의 다양한 상이한 단계로 수행될 수 있다. 캡핑은 전사와 동시에(co-transcriptionally) 또는 전사 후에(post-transcriptionally) 일어날 수 있다. 이들 방법은 RNA 합성 후에 그리고 효소적 폴리아데닐화가 수행되는 경우에는 효소적 폴리아데닐화 단계 전 또는 후에 실행될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA는 정제 전에 반응 혼합물에 캡핑된다. 다른 실시형태에서, RNA는 정제된 후에 캡핑된다.
일부 실시형태에서, 보조 효소, 예컨대, 5', 3' 엑소리보뉴클레아제 1(xrn1)을 사용하여 보다 효율적인 캡핑을 달성할 수 있다. Xrn1 처리는 캡핑될 수 없는 GMP로 시작되는 mRNA를 NMP 단량체로 다시 분해하여, 이어서 이것을 다시 사용하여 mRNA를 생산할 수 있다. 이러한 분해는 GTP 또는 GDP로 시작하는 mRNA에 영향을 미치지 않기 때문에, 이것은 캡핑될 수 있는 mRNA의 생산을 증가시킬 것이다. 일부 실시형태에서, 특이적 엑소뉴클레아제를 사용한 일인산화된 mRNA 재순환이 수행된다. CFR 반응에서의 표준 효소에 더하여, 5'-모노포스페이트 특이적 엑소리보뉴클레아제, 예컨대, xrn1이 첨가된다. Xrn1을 사용하여 5' 모노포스페이트를 갖는 mRNA를 분해시켜, NMP를 CFR 반응으로 다시 재순환시킬 수 있다. 그것을 또한 사용하여 CFR에서 생산된 mRNA에서 캡핑 가능하지 않은 mRNA를 분해시킬 수 있다.
하류 가공
본 명세서에 제공된 방법 및 시스템은 일부 실시형태에서, mRNA 생성물을 0.5 내지 10g/ℓ(예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 또는 10g/ℓ)의 농도로 수득한다. 하류 가공은 순도를 중량 기준으로 99%(예를 들어, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99 중량%) RNA만큼 증가시킨다. 하류 가공의 예를 도시하며, 이는 단백질 침전제(예를 들어, 염화리튬)의 첨가로 시작한 후, 디스크-적층 원심분리(DSC)시켜 단백질, 지질 및 일부 DNA를 생성물 스트림으로부터 제거한다. 그 후, 한외여과를 실행하여 염 및 부피를 제거한다. 생성물 스트림에 데한 염화리튬의 첨가는 RNA 생성물의 침전으로 이어지고, 이를 이어서 디스크 적층 원심분리를 사용하여 벌크 액체로부터 분리시켜, 예를 들어, 약 80% 순도의 RNA 생성물 스트림을 수득한다. 추가의 크로마토그래피 연마는 약 99%의 순수한 생성물을 수득한다.
일부 실시형태에서, mRNA 생성물은 염화리튬 침전 프로토콜에 의해서 침전된다. 일부 실시형태에서, mRNA 생성물은 문헌[Weissman et al., 2013, "HPLC purification of in vitro transcribed long RNA." Methods in molecular biology (Clifton, NJ), 969, 43]에 기재된 역상 이온쌍 고성능 액체 크로마토그래피를 통해서 초 정제(ultra purified)된다. 역상 HPLC를 일부 실시형태에서 사용하여 오염 핵산 생성물, 예를 들어, 바람직하지 않은 면역 반응으로 이어질 수 있는 이중-가닥 핵산을, mRNA 제제로부터 제거할 수 있다. 다른 정제 방법을 또한 사용할 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 개시내용의 구체적인 실시형태 및 이의 다양한 사용의 설명이다. 이것은 설명의 목적으로만 제시되며, 어떤 식으로든 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1. 무세포 반응
무세포 RNA 합성 반응을 하기 성분으로부터 조립하였다:
NMP 혼합물: 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트(NMP)를 수득하기 위해 뉴클레아제 P1로 처리된 효모 RNA. 뉴클레아제 P1을 한외여과에 의해서 제거하고, 무세포 반응에 사용하기 전에 혼합물을 중성 pH로 조정하였다.
키나제: 하기 키나제를 발현하는 이. 콜라이 균주를 고-세포 밀도 발효물에서 성장시키고, 고압 균질화에 의해서 용해시켰다:
써머스 써모필러스로부터의 CMP 키나제(Cmk)
피로코커스 푸리오서스로부터의 UMP 키나제(PyrH)
써모토가 마리티마로부터의 GMP 키나제(Gmk)
아퀴펙스 애올리커스로부터의 NDP 키나제(Ndk)
데이노코커스 게오써말리스로부터의 폴리포스페이트 키나제(PPK2)
RNA 중합효소: N-말단 헥사히스티딘 태그를 갖는 열안정성 돌연변이체 T7 RNA 중합효소를 이. 콜라이에서 고-세포 밀도 발효물에서 과발현시켰다. (야생형 T7 RNA 중합효소를 또한 이들 반응에서 성공적으로 사용하였다) 세포를 고압 균질화에 의해서 용해시키고, 단백질을 Fast 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography: FPLC)에 의해서 정제시켰다.
무세포 RNA 합성 반응을 표 11에 따라서 조립하였다. 반응 조립 전에, 키나제 용해물을 인산칼륨 완충액 중에서 동일한 총 단백질 농도로 희석시키고, 배합하였다. 황산마그네슘 및 소듐 헥사메타포스페이트를 첨가하고, 이어서 용해물 혼합물을 열처리하여(15분 동안 70℃) 키나제 용해물로부터 경로외(off-pathway) 효소 활성을 불활성화시켰다.
Figure pct00020
CFR을 48℃에서 60분 동안 인큐베이션시킨 다음, TURBO DNase(써모 피셔사(Thermo Fisher))로 처리하였다. 불용성 파편을 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 표준 기술에 따라 염화리튬 침전에 의해 RNA를 회수하였다.
실시예 2: mRNA의 캡핑
실시예 1에서 생성된 세포 용해물을 백시니아 바이러스 효소를 함유하는 상업용 키트(예를 들어, 백시니아 캡핑 시스템, 뉴 잉글랜드 바이오랩스사)를 사용하여 캡핑 반응을 수행하였다. 반응을 제품 사양에서 권장하는 대로 수행하였다.
실시예 3: 선형 주형의 PCR 생산
오픈 리딩 프레임(ORF) 및 미번역 영역(UTR)을 함유하는 DNA 주형 서열을 선형 dsDNA gBlocks(인터그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈사(Integrated DNA Technologies))로서 합성하고, pCR4-TOPO(써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific))에 클로닝시켰다. polyA 테일을 암호화하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 선형 DNA 주형을 증폭시켰다. PCR 생성물을 AMPure XP SPRI 비드(베크만 컬터사(Beckman Coulter))를 사용하여 정제시켰다. 이 주형 DNA를 실시예 1에 기재된 절차에 사용하였다.
실시예 4: HeLa 세포에서의 GFP 발현
HeLa 세포에 XBG(베타-글로빈, 제노프스 라에비스) UTR 및 이전 실시예에서 기재된 무세포 공정을 통해 생성되거나 염화리튬 침전, 또는 시험관내 전사(IVT)에 의해 조 정제된 5'ITS를 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 mRNA 0.1㎍을 형질주입시켰다. 제조사 지침에 따라 3% MessengerMAX 리포펙타민을 형질주입에 사용하였다. 녹색 형광 단백질 발현을 비교하였다.
결과
CFR은 IVT에 의해 생성된 것과 동등한 녹색 형광 단백질 발현을 나타내었다(도 10). 요약하면, 결과는 무세포 반응 방법이 시험관내 전사(IVT) 방법과 대등함을 입증한다.
실시예 5: 상이한 UTR로의 발현
CFR을 사용하여 GFP를 암호화하는 mRNA를 생성시켰고, HeLa 세포 추출물에서 검정하였다. 4개의 상이한 미번역 영역(UTR)을 갖는 mRNA - 5' 하이드록시스테롤 데하이드로게나제, 3' 알부민(HSD); 5' 시토크롬 옥시다제, 3' 알부민(COX); 5', 5' 인간 β-글로빈(HBG); 5', 3' 제노프스 β-글로빈(XBG), 각각 5'ITS를 가짐 -를 제조하였다. (이 UTR은 표 7에 자세히 설명되어 있음.) 반응의 녹색 형광을 모니터링하여 GFP의 발현을 정량하였다(예를 들어, qPCR 기계 또는 적절한 설정의 형광 마이크로플레이트 판독기에서).
결과
CFR에 의해서 생산된 모든 4개의 UTR을 갖는 mRNA는 활성 GFP 발현을 초래하였다(도 11). XBG, HBG, COX 및 HSD UTR 모두는 GFP 300,000RFU 이상의 발현을 초래하였다.
실시예 6: RNA 정제
CFR 공정으로부터의 mRNA 및 시험관내 전사(IVT)를 통해 생성된 mRNA를 염화리튬 침전을 사용하여 조 정제시켰다. RNA의 상대적 존재비를 BioAnalyzer에서 모세관 겔 전기영동을 사용하여 결정하였다. CFR에 의해 만들어지고, 염화리튬 침전을 통해서만 조 정제되거나 역상 이온쌍 고성능 액체 크로마토그래피(초정제 또는 "연마")로 정제된 후 다음과 같이 염화리튬 침전으로 정제된 mRNA.
HPLC 정제는 문헌[Weissman et al., 2013, "HPLC purification of in vitro transcribed long RNA." Methods in molecular biology (Clifton, NJ), 969, 43]의 프로토콜을 본질적으로 따랐다.
80℃에서 유지되는 RNAep Semi-Prep(에이디에스 바이오테크사(ADS Biotec) 카탈로그 번호#RPC-99-2110) 21.2×100mm를 사용하였다. 사용된 이동상은 하기와 같았다:
A - 0.1 M 테트라에틸암모늄 아세테이트(TEAA), pH 7.0
B - 0.1M TEAA, pH 7.0, 25% 아세토나이트릴
샘플을 칼럼에 주입하고, 3㎖/분의 펌프 속도를 사용하여 하기 구배 프로그램을 사용하여 분리시켰다:
0.0분, 62% A, 38% B
20.0분, 40% A, 60% B
20.01분, 0% A, 100% B
22.00분, 0% A, 100% B
22.01분, 62% A, 38% B
28.0분, 62% A, 38% B.
목적하는 mRNA 종을 함유하는 분획을 풀링시키고, 미리 습윤된 30kDa 컷오프 원심 필터(예를 들어, Amicon UFC903096)를 사용하여 농축시켰다. 농축된 mRNA 샘플을 표준 기술에 따라 LiCl로 침전시켰다.
조 정제된 CFR mRNA 또는 초-정제된 CFR mRNA를 문헌[Karikσ et al., 2011, "Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA." Nucleic Acids Research, 39(21), e142]에 따라서 면역블로팅 기술을 사용하여 dsRNA에 대해서 시험하였다. 조 정제된 CFR mRNA 및 초-정제된 CFR mRNA는 EndoSafe-MCS 시스템(찰스 리버 래보러토리즈사(Charles River Laboratories), 제조사 지침)을 사용하여 엔도톡신에 대해서도 시험하고, IVT를 통해 생성된 조 정제된 mRNA 또는 초-정제된 mRNA와 비교하였다. 조 정제 및 초-정제 생성물을 아래와 같이 질량 기반 순도 분석을 수행하였다.
잔류 단백질을 키트 지침에 따라 바이신코닌산(BCA) 검정 키트(써모 피셔사)에 의해 정량하였다. 잔류 양이온을 문헌[Thomas et al., 2002, "Determination of inorganic cations and ammonium in environmental waters by ion chromatography with a high-capacity cation-exchange column." Journal of Chromatography A, 956(1-2), 181-186]의 방법에 의해서 정량하였다. 잔류 음이온을 문헌[Boyles, 1992, "Method for the analysis of inorganic and organic acid anions in all phases of beer production using gradient ion chromatography." Journal of the American Society of Brewing Chemists, 50(2), 61-63]의 방법에 의해서 정량하였다. 잔류 뉴클레오타이드를 문헌[Edelson et al., 1979, "Ion-exchange separation of nucleic acid constituents by high-performance liquid chromatography." Journal of Chromatography A, 174(2), 409-419; 및 Hartwick et al., 1975, "The performance of microparticle chemically-bonded anion-exchange resins in the analysis of nucleotides." Journal of Chromatography A, 112, 651-662]의 방법에 따라서 정량하였다.
결과
무세포 공정을 통해 제조된 mRNA는 목적하는 mRNA의 70% 미만의 핵산 순도를 나타내지만, 달성된 순도는 시험관내 전사로 달성된 것과 유사하다(IVT; 도 12). HPLC 공정은 dsRNA의 대부분을 제거한다(도 13). 엔도톡신을 제거한다(도 14). HPLC 공정을 사용한 RNA의 후속 "연마"는 관심 mRNA 종을 나타내는 총 핵산의 실질적으로 더 높은 백분율을 초래한다 - 85%. 상업용 RNA 제제는 78%의 관심 종을 함유하였다(도 15).
실시예 7: 인플루엔자 항원의 발현
H1N1 푸에르토리코/8/1934 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소 단백질(HA)을 암호화하는 mRNA(HBG 또는 XBG UTR을 가짐, 각각 5' ITS를 포함함)를 CFR 시스템을 사용하여 생성시켰고, LiCl-침전시키거나 또는 HPLC를 사용하여 초-정제시켰다. ELISA를 사용하여 HeLa 추출물에서 HA를 측정하였다. 마이크로플레이트를 먼저 포획 항체(토끼 항-인플루엔자 A/푸에르토리코/8/1934 혈구응집소 단클론성 항체, 시노 바이올로지컬사(Sino Biological))로 코팅한 다음, 세척하고 차단시켰다. 번역된 HA를 함유하는 HeLa 세포 추출물을 희석시키고, 이어서 플레이트에 적용하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 웰을 검출 항체(호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 토끼 항-인플루엔자 A/푸에르토리코/8/1934, 시노 바이올로지컬사)를 적용하기 전에 세척하였다. 이어서, 호스래디쉬 퍼옥시다제 기질(3', 3', 5', 5'-테트라메틸벤지딘)을 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 650㎚에서의 흡광도를 정량하였다.
CFR-생성된 mRNA를 시험관내 전사(IVT)에 의해 생성된 mRNA와 비교하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 번역된 HA는 또한 친화도-정제된 토끼 항-인플루엔자 A/푸에르토리코/8/1934 다클론성 1차 항체(시노 바이올로지컬사) 및 친화도-정제된 염소 항-토끼 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합 2차 항체(잭슨 이뮤놀로지컬즈사)를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 세포 추출물에서 검출하였다.
결과
HA가 성공적으로 생성되었으며, 샘플을 초-정제한 경우 최종 제제에서 농도가 더 높았다(도 16). 생산은 IVT로 달성한 것과 유사하였다. (도 17).
실시예 8: 루시퍼라제의 무세포 생산
파이어플라이 루시퍼라제를 암호화하는 mRNA(HBG 또는 XBG UTR을 가짐, 각각 5' ITS를 포함함)를 CFR 공정을 사용하여 생성시켰다. 500ng의 캡핑된, DNase 처리된 mRNA(순도에 대해 보정됨)를 정제된 DNA 대신 첨가된 것을 제외하고는, 번역은 키트 지침에 따라 1-Step Human Coupled IVT Kit(써모 피셔사)를 사용하여 HeLa 세포 추출물에서 측정하였다. 파이어플라이 루시퍼라제의 발현을 키트 지침에 따라 Steady-Glo Luciferase Assay System(프로메가사(Promega))을 사용하여 측정하였다. HeLa 추출물과 HeLa 세포 모두에서 파이어플라이 루시퍼라제로부터의 루미네선스를 측정하였고, Promega 키트는 판독값을 제공하였다. HeLa 세포 형질주입을 실시예 4와 같이 수행하였다.
결과
기능성 루시페라아제를 HeLa 추출물(도 18)과 HeLa 세포(도 19) 둘 다에서 생성시켰다. HeLa 추출물에서, XBG에 비해 HBG UTR에서 더 높은 루시퍼라제 발현이 관찰되었다. HeLa 세포에서, HBG UTR을 갖는 루시퍼라제 mRNA는 형질주입 조건에 관계없이 높은 수준의 루시페라제 발현을 생성시켰다(1: 웰당 0.15uL 리포펙타민, 2: 웰당 0.30uL 리포펙타민, 각 경우에 100ng mRNA가 형질주입됨).
실시예 9.: 생체내에서 무세포 RNA-생산된 루시퍼라제의 발현
파이어플라이 루시퍼라제를 암호화하는 mRNA를 IVT 및 CFR 방법 둘 다를 사용하여 생성시켰고, HPLC-정제하고, 캡핑시켰다. mRNA는 HBG UTR 및 5'ITS를 포함하였다. mRNA를 CFR 및 IVT 둘 다에 2개의 제형으로 생성시켰다: "인-하우스" 지질 나노입자(연구자들에 의해 최적화된 문헌 제형) 및 외부 지질 나노입자(상업 파트너 또는 Precision Nanosystems 키트에 의해서 제조). "인-하우스" LNP를 이온화 가능한 지질로서 D-Lin-MC3-DMA 사용하여: Pardi 등 문헌[Pardi et al., 2015, J. Controlled Release, 217, 345-351]에 따라서 제형화하였다. "GenVoy" LNP를 GenVoy-ILM Ionizable Lipid Mix(프리시즌 나노시스템즈사(Precision Nanosystems))를 사용하여 제형화하였다. 두 제형을 제조사 지침에 따라 NanoAssemblr Benchtop 미세유체 혼합기(프리시즌 나노시스템즈사)를 사용하여 생성시켰다.
4가지 처리(2가지 제조 방법, 2가지 제형) 각각을 3마리의 BALB/c 마우스의 실험군에 40, 15 또는 5㎍의 단일 피내 용량으로 투여하였다. 동물에게 D-루시페린 150㎎/kg을 복강내 투여하고, mRNA 투여 6시간 후 생체내 영상화 시스템(IVIS)으로 영상화하여, 72시간에 걸쳐 루미네선스를 측정하였다.
결과
CFR-생산된 mRNA는 루시퍼라제 발현을 유도하는 데 있어서 적어도 IVT만큼 강력하다. 더 이른 시점에서, 내부 제형을 갖는 CFR-생산된 mRNA는 더 높은 루시퍼라제 발현을 산출하였다. 유사한 수준의 발현이 40 및 15㎍ 투여로 달성된다(도 20 및 도 21).
실시예 10: 항-역방향 캡 유사체(ARCA) 캡핑을 갖는 뉴클레오사이드-변형된 mRNA의 생산
합성 반응을 위한 뉴클레오타이드 공급원이 비변형된 뉴클레오사이드 모노포스페이트 아데노신 및 구아노신 및 슈도우리딘, ø 및 5-메틸시티딘, m5C로 이루어진 것을 제외하고는, 실시예 9에 기재된 바와 같이 정제된 CFR을 사용하여 뉴클레오사이드-변형된 mRNA를 생산하였고, HPLC 정제시켰다. 1mM로 첨가된 GMP를 제외하고는, 비변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오사이드를 각각 5mM로 반응에 첨가하였다. 캡 유사체(ARCA)를 4mM로 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 반응물을 DNase 처리하고, LiCl 침전으로 회수하고, HPLC로 정제시켰다. 주형을 응용에서 이미 기재된 바와 같이 PCR에 의해 생성시켰고, 이것은 5' 및 3' 미번역 영역뿐만 아니라 3' polyA 테일이 측접된 관심 유전자(파이어플라이 루시퍼라제)를 함유하였다. 그 다음 mRNA를 순도, 뉴클레오사이드 변형의 혼입, 캡핑 및 마우스에서의 유전자 발현에 대해서 평가하였다.
뉴클레오사이드 변형의 정량은 뉴클레아제, 포스포다이에스터라제 및 포스파타제 효소의 혼합물을 사용하여 샘플을 모노뉴클레오사이드로 분해하고, 모노뉴클레오사이드를 LC-MS를 사용하여 정량함으로써 달성되었다. 변형된 뉴클레오사이드(예를 들어, ø)의 상대 농도를 비변형 것(예를 들어, U)과 비교하였다. 유사하게, m7G 캡의 경우, m7G의 상대 농도를 IVT 기준과 비교하였다.
마우스에서 표적 유전자 발현의 결정은 mRNA를 지질 나노입자 제형으로 제형화한 후 근육내 경로를 통해 BALB/c 마우스(군당 N=10마리 마우스)에 지시된 용량으로 주사함으로써 달성되었다. 그 다음 마우스에게 도 23에 표시된 시간에 D-루시페린을 주사한 후 생체내 영상화(IVIS)를 수행하였다.
결과
CFR-생산된 mRNA 및 IVT에 의해 생산된 동일한 서열의 참조 표준품에서 유사한 순도가 관찰되었다(도 22A). 뉴클레오사이드 변형의 정량 및 CFR-생산 mRNA의 캡핑 및 IVT에 의해 생성된 동일한 서열의 참조 표준품을 도 22B에 도시한다. CFR-생산된 mRNA는 변형된 뉴클레오사이드 및 IVT에 유사한 캡핑으로 유사한 치환 효율을 나타내었다. 도 23은 마우스에서 표적 유전자 발현의 그래프 묘사를 제공한다. 1㎍ 및 0.1㎍ 용량 둘 다에서, CFR-생산된 mRNA는 모든 시점에서 IVT에 유사하게 강력하였다.
실시예 11: 인플루엔자 감염으로부터 마우스를 보호하는 모델 인플루엔자 백신의 생산
모델 인플루엔자 백신을 암호화하는 mRNA는 본 출원의 실시예 9에 기재된 바와 같이 CFR, HPLC-정제 및 지질 나노입자를 사용하여 생산하였다. mRNA는 문헌[Petsch et al., Nat Biotechnol. 2012 (doi:10.1038/nbt.2436)]에 따라서 인플루엔자 A/푸에르토리코/8/1934(H1N1)로부터의 전장 혈구응집소(HA) 단백질 또는 파이어플라이 루시퍼라제(FLuc)를 암호화하였다. mRNA 서열은 5' 및 3' HBG UTR, 5' ITS 및 3' A100 테일을 포함하였다. 주형을 PCR에 의해 생성시켰다. BALB/c 마우스(군당 N=8마리 마우스)를 제시된 용량으로 2회 면역화시켰다(제0일에 1차 면역화 및 제21일에 부스트; 근육내). 불활성화된 H1N1 바이러스가 투여된 마우스를 양성 대조군으로 사용하였다. 처리된 마우스에서 혈청 면역을 정량화하고, 인플루엔자 시험감염으로부터의 보호를 측정하였다. 혈청 면역을 혈구응집반응 저해(hemagglutination inhibition: HAI) 검정에 의해서 마우스에서 결정하였다. 제42일에 꼬리 정맥으로 혈액을 수집하고, HAI 결정을 위해 혈청으로 진행하였다. 인플루엔자 시험감염은 인플루엔자 A/푸에르토리코/8/1934(H1N1)로의 시험감염 후 마우스의 체중 변화에 의해 측정되었다. 마우스에게 제63일에 생 바이러스를 비강내 투여하고, 그 후 10일 동안 체중을 모니터링하였다.
결과
HAI 검정에 의해 측정된 바와 같은 마우스에서의 혈청 면역을 도 24에 도시한다. 두 용량의 HA mRNA로 처리된 마우스는 HA-불활성화 항체를 생성시켰는데, 30μg 용량 군의 역가는 불활성화된 H1N1 대조군의 역가를 초과하였다. 이들 군으로부터의 마우스(도 24에서 동그라미)를 후속 시험감염 연구를 위해 선택하였다.
인플루엔자 A/푸에르토리코/8/1934(H1N1)로 시험감염시킨 후 마우스의 체중을 도 25에 나타낸다. HA mRNA를 투여한 마우스 또는 불활성화된 H1N1 대조군을 투여한 마우스는 인플루엔자 감염과 관련된 체중 감소로부터 보호된 반면, 미처리 마우스 및 FLuc mRNA가 투여된 마우스는 인간 연구 종점(25%의 총 체중 감소)에 도달할 때까지 체중이 감소하였고, 이를 희생시켰다.
이러한 결과는 CFR-생산된 mRNA가 인플루엔자 A/푸에르토리코/8/1934에 대해 효과적인 면역 반응을 생성하고, 따라서 마우스에서 보호 및 특이적 백신으로 작용할 수 있음을 입증한다.
실시예 12: 다양한 뉴클레오타이드 공급원으로부터의 mRNA의 생산
실시예 11에 기재된 인플루엔자 혈구응집소를 암호화하는 mRNA를 세포 RNA-유래 뉴클레오타이드를 사용하거나 정제된 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 사용하여 CFR에 의해 생산하였다. 온도를 37℃로 낮추기 전에 세포 RNA-유래 뉴클레오타이드 혼합물을 48℃에서 1시간 동안 키나제, 마그네슘 및 소듐 헥사메타포스페이트(HMP)과 함께 사전 인큐베이션시킨 것을 제외하고는 본 출원의 실시예 9에 기재된 바와 같이 mRNA를 생성시켰고, 주형 및 중합효소를 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 대조군으로서, 동일한 서열을 통상적인 시험관내 전사(IVT)에 의해 생성시켰다. 반응물을 DNase-처리하고, RNA를 LiCl 침전에 의해 정제시키고, RNA 품질을 BioAnalyzer(애질런트사(Agilent))를 사용하여 전기영동에 의해 평가하였다.
결과
도 26A는 순도에 대한 참조로서 비캡핑된 IVT-생산된 mRNA의 전기영동도이다. 도 26B는 세포 RNA-유래된 뉴클레오타이드를 사용한 비캡핑된 CFR-생산된 mRNA의 전기영동도이다. 도 26C는 각각 5mM의 정제된 뉴클레오사이드 모노포스페이트(AMP, CMP, GMP 및 UMP)의 동일몰량 혼합물을 사용한 비캡핑된 CFR-생산된 mRNA의 전기영동도이다. CFR 반응을 도 26B에서의 것과 유사하게 수행하였다. CFR에 의해서 생산된 mRNA는 뉴클레오타이드 공급원임에도 불구하고, IVT와 유사한 순도를 나타내었다.
실시예 13: 선형화된 플라스미드 주형으로부터의 암호화된 polyA 테일을 갖는 mRNA의 생산
EGFP를 암호화하는 비캡핑된 mRNA를 본 출원 다른 곳에 기재된 바와 같이 CFR에 의해 생성시켰다. pUC 복제 기점, 선택 가능한 마커, T7 프로모터, 5' 및 3' HBG UTR이 측접된 EGFP 유전자, 3' polyA 테일 및 선형화를 위한 고유한 BspQI 부위로 이루어진 최소화된 주형 플라스미드를 작제하였다. 0, 50, 100 또는 150 A 뉴클레오타이드로 이루어진 PolyA 테일을 주형 플라스미드에 암호화하였다. 플라스미드를 이. 콜라이 균주 DH10b에서 배양하고, Plasmid Midi kit(퀴아젠사(Qiagen))로 정제시키고, BspQI(뉴 잉글랜드 바이오랩스사)로 분해시켜 선형화하고, CFR에서 사용하기 전에 페놀/클로로폼 추출로 정제시켰다. mRNA를 합성하고, 염화리튬 침전으로 정제시키고, BioAnalyzer(애질런트사(Agilent))를 사용하여 전기영동으로 분석하였다.
결과
도 27은 0, 50, 100, 또는 150개 뉴클레오타이드 길이인 polyA 테일을 갖는 CFR-생산된 mRNA의 오버레이 전기영동도이다. 각각의 샘플의 주요 피크는 목적하는 크기의 전장 mRNA를 나타내는데, 이는 CFR 시스템이 플라스미드 주형 및 암호화된 polyA 꼬리와 상용성임을 입증한다.
본 발명을 상세하게 그리고 이의 구체적인 양상 및/또는 실시형태를 참고로 기재하며, 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 변형 및 변경이 가능함이 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일부 양상이 특히 유리한 것으로 확인될 수 있지만, 본 발명은 본 발명의 이러한 특정 양상으로 제한되지 않는 것으로 고려된다. 본 명세서에 개시된 백분율은 개시된 값으로부터 ± 10, 20 또는 30%의 양이 달라질 수 있으며, 고려된 발명의 범위 내에 있다.
청구범위에서, 단수 형태는 반대로 지시되거나 맥락으로부터 달리 명백하지 않는 한, 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은, 반대로 지시되거나, 그렇지 않다면 맥락으로부터 명백하지 않다면, 군 구성원의 하나, 하나 초과, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않다면 관련되는 경우, 만족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확하게 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않다면 관련되는 실시형태를 포함한다. 본 발명은 군 구성원의 하나 초과, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않다면 관련되는 실시형태를 포함한다.
더욱이, 본 발명은 열거된 청구범위 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항 및 설명적 용어가 또 다른 청구범위 내로 도입된 모든 변형, 조합 및 순열을 포괄한다. 예를 들어, 또 다른 청구범위에 종속된 임의의 청구범위는 동일한 기초 청구범위에 종속된 임의의 다른 청구범위에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로서, 예를 들어, 마쿠시 군 형식으로 제시되는 경우, 요소의 각각의 하위군이 또한 개시되며, 임의의 요소(들)는 군으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 양상이 특정 요소 및/또는 특색을 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 본 발명 또는 본 발명의 측면의 특정 실시형태는 이러한 요소 및/또는 특색으로 이루어지거나, 본질적으로 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 간략화의 목적을 위해, 그러한 실시형태는 본 명세서에서 글자 그대로 구체적으로 제시되지는 않았다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적이며, 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용하는 것으로 의도됨을 주목하기 바란다. 범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 더욱이, 달리 지시되거나, 맥락 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 달리 명백하지 않다면, 범위로서 표현된 값은 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면, 본 발명의 상이한 실시형태에서 언급된 범위 내의 임의의 구체적인 값 또는 하위-범위를, 범위의 하한의 단위의 1/10까지 가정할 수 있다.
본 출원은 다양한 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 저널 논문 및 다른 간행물을 언급하며, 이들 모두는 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 임의의 포함된 참고문헌 및 본 명세서 사이에 상충되는 것이 있는 경우, 본 명세서가 우선시될 것이다. 또한, 종래 기술 내에 해당되는 본 발명의 임의의 특정 실시형태는 청구범위 중 임의의 하나 이상으로부터 분명하게 배제될 수 있다. 이러한 실시형태는 당업자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이들은 배제가 본 명세서에 분명하게 제시되지 않는 경우라 하더라도 배제될 수 있다. 본 발명의 임의의 특정 실시형태는 종래 기술의 존재와 관련되든 그렇지 않든, 임의의 이유로 임의의 청구범위로부터 배제될 수 있다.
당업자는 통상의 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 구체적인 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 본 명세서에 기재된 본 실시형태의 범위는 상기 설명에 제한되는 것으로 의도되지 않지만, 오히려 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같다. 당업자는 이러한 설명에 대한 다양한 변화 및 변형이 하기 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
서열
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참고문헌
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SEQUENCE LISTING <110> GreenLight Biosciences <120> CELL-FREE PRODUCTION OF RIBONUCLEIC ACID <130> WO/2020/205793 <140> PCT/US2020/025824 <141> 2020-03-30 <150> US 62/826,983 <151> 2019-03-29 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 266 <212> PRT <213> Deinococcus geothermalis <400> 1 Met Gln Leu Asp Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Gln Arg Val Arg Leu 1 5 10 15 Ser Asn Trp Pro Thr Asp Asp Asp Gly Gly Leu Ser Lys Ala Glu Gly 20 25 30 Glu Ala Leu Leu Pro Asp Leu Gln Gln Arg Leu Ala Asn Leu Gln Glu 35 40 45 Arg Leu Tyr Ala Glu Ser Gln Gln Ala Leu Leu Ile Val Leu Gln Ala 50 55 60 Arg Asp Ala Gly Gly Lys Asp Gly Thr Val Lys His Val Ile Gly Ala 65 70 75 80 Phe Asn Pro Ser Gly Val Gln Val Ser Asn Phe Lys Val Pro Thr Glu 85 90 95 Glu Glu Arg Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Ile His Arg Gln Thr Pro 100 105 110 Arg Leu Gly Met Ile Gly Val Phe Asn Arg Ser Gln Tyr Glu Asp Val 115 120 125 Leu Val Thr Arg Val His His Leu Ile Asp Asp Gln Thr Ala Gln Arg 130 135 140 Arg Leu Lys His Ile Cys Ala Phe Glu 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Ser Val Trp Arg Ala Arg Tyr 130 135 140 Asp Gln Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Ala Asp Thr Gly Thr Ile 145 150 155 160 Ile Val Lys Cys Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu Gln Glu Gln Arg 165 170 175 Leu Leu Ala Arg Glu Arg Asp Val Ser Lys Ala Trp Lys Leu Ser Ala 180 185 190 Gly Asp Trp Arg Glu Arg Ala Phe Trp Asp Asp Tyr Met Ala Ala Tyr 195 200 205 Glu Glu Ala Leu Thr Arg Cys Ser Thr Asp Tyr Ala Pro Trp Tyr Ile 210 215 220 Ile Pro Ala Asn Arg Lys Trp Tyr Arg Asp Leu Ala Ile Ser Glu Ala 225 230 235 240 Leu Val Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Trp Arg Arg Ala Leu 245 250 255 Asp Ala Met Ser Arg Ala Arg Arg Ala Glu Leu Glu Ala Phe Arg Ala 260 265 270 Glu Gln His Ala Met Glu Gly Arg Pro Gln Gly Ala Gly Gly Val Ser 275 280 285 Arg Arg 290 <210> 10 <211> 282 <212> PRT <213> Roseiflexus sp <400> 10 Met His Tyr Ala His Thr Val Ile Pro Gly Thr Gln Val Arg Leu Arg 1 5 10 15 Asp Ile Asp Pro Asp Ala Ser Gly Gly Leu Thr Lys Asp Glu Gly Arg 20 25 30 Glu Arg Phe Ala Ser Phe Asn Ala Thr Leu Asp Ala Met Gln Glu Glu 35 40 45 Leu Tyr Ala Ala Gly Val His Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Gly Met 50 55 60 Asp Thr Ala Gly Lys Asp Gly Ala Ile Arg Asn Val Met His Asn Leu 65 70 75 80 Asn Pro Gln Gly Cys Arg Val Glu Ser Phe Lys Val Pro Thr Glu Glu 85 90 95 Glu Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Val His Lys Val Val Pro Arg 100 105 110 Lys Gly Met Val Gly Val Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu 115 120 125 Val Val Arg Val His Ser Leu Val Pro Glu His Val Trp Arg Ala Arg 130 135 140 Tyr Asp Gln Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Thr Asp Thr Gly Thr 145 150 155 160 Ile Ile Val Lys Cys Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu Gln Glu Lys 165 170 175 Arg Leu Leu Ala Arg Glu Gln Asp Val Thr Lys Ala Trp Lys Leu Ser 180 185 190 Ala Gly Asp Trp Arg Glu Arg Glu Arg Trp Asp Glu Tyr Met Ala Ala 195 200 205 Tyr Glu Glu Ala Leu Thr Arg Cys Ser Thr Glu Tyr Ala Pro Trp Tyr 210 215 220 Ile Ile Pro Ala Asn Arg Lys Trp Tyr Arg Asp Leu Ala Ile Ser Glu 225 230 235 240 Val Leu Val Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Trp Gln Arg Ala 245 250 255 Leu Asp Ala Met Ser Gln Ala Arg Leu Ala Glu Leu Lys Ala Phe Arg 260 265 270 His Gln Gln Thr Ala Gly Ala Thr Arg Leu 275 280 <210> 11 <211> 274 <212> PRT <213> Truepera radiovictrix <400> 11 Met Ser Gln Gly Ser Ala Lys Gly Leu Gly Lys Leu Asp Lys Lys Val 1 5 10 15 Tyr Ala Arg Glu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Glu Leu Val Lys Leu Gln 20 25 30 Gly Trp Ile Lys Ala Gln Gly Leu Lys Val Val Val Leu Phe Glu Gly 35 40 45 Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Ser Thr Ile Thr Arg Ile Thr Gln Pro 50 55 60 Leu Asn Pro Arg Val Cys Arg Val Val Ala Leu Gly Ala Pro Thr Glu 65 70 75 80 Arg Glu Arg Thr Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Val His His Leu Pro 85 90 95 Ala Ala Gly Glu Met Val Leu Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala 100 105 110 Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Thr Glu Ala Glu Tyr Arg Glu 115 120 125 Phe Leu His Ala Cys Pro Thr Phe Glu Arg Leu Leu Leu Asp Ala Gly 130 135 140 Ile Ile Leu Ile Lys Tyr Trp Phe Ser Val Ser Ala Ala Glu Gln Glu 145 150 155 160 Arg Arg Met Arg Arg Arg Asn Glu Asn Pro Ala Lys Arg Trp Lys Leu 165 170 175 Ser Pro Met Asp Leu Glu Ala Arg Ala Arg Trp Val Ala Tyr Ser Lys 180 185 190 Ala Lys Asp Ala Met Phe Tyr His Thr Asp Thr Lys Ala Ser Pro Trp 195 200 205 Tyr Val Val Asn Ala Glu Asp Lys Arg Arg Ala His Leu Ser Cys Ile 210 215 220 Ala His Leu Leu Ser Leu Ile Pro Tyr Glu Asp Leu Thr Pro Pro Pro 225 230 235 240 Leu Glu Met Pro Pro Arg Asp Leu Ala Gly Ala Asp Glu Gly Tyr Glu 245 250 255 Arg Pro Asp Lys Ala His Gln Thr Trp Val Pro Asp Tyr Val Pro Pro 260 265 270 Thr Arg <210> 12 <211> 186 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 12 Met Asp Val Gly Gln Ala Val Ile Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly 1 5 10 15 Lys Gly Thr Gln Ala Ser Arg Leu Ala Gln Glu Leu Gly Phe Lys Lys 20 25 30 Leu Ser Thr Gly Asp Ile Leu Arg Asp His Val Ala Arg Gly Thr Pro 35 40 45 Leu Gly Glu Arg Val Arg Pro Ile Met Glu Arg Gly Asp Leu Val Pro 50 55 60 Asp Asp Leu Ile Leu Glu Leu Ile Arg Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val 65 70 75 80 Ile Phe Asp Gly Phe Pro Arg Thr Leu Ala Gln Ala Glu Ala Leu Asp 85 90 95 Arg Leu Leu Ser Glu Thr Gly Thr Arg Leu Leu Gly Val Val Leu Val 100 105 110 Glu Val Pro Glu Glu Glu Leu Val Arg Arg Ile Leu Arg Arg Ala Glu 115 120 125 Leu Glu Gly Arg Ser Asp Asp Asn Glu Glu Thr Val Arg Arg Arg Leu 130 135 140 Glu Val Tyr Arg Glu Lys Thr Glu Pro Leu Val Gly Tyr Tyr Glu Ala 145 150 155 160 Arg Gly Val Leu Lys Arg Val Asp Gly Leu Gly Thr Pro Asp Glu Val 165 170 175 Tyr Ala Arg Ile Arg Ala Ala Leu Gly Ile 180 185 <210> 13 <211> 208 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 13 Met Arg Gly Ile Val Thr Ile Asp Gly Pro Ser Ala Ser Gly Lys Ser 1 5 10 15 Ser Val Ala Arg Arg Val Ala Ala Ala Leu Gly Val Pro Tyr Leu Ser 20 25 30 Ser Gly Leu Leu Tyr Arg Ala Ala Ala Phe Leu Ala Leu Arg Ala Gly 35 40 45 Val Asp Pro Gly Asp Glu Glu Gly Leu Leu Ala Leu Leu Glu Gly Leu 50 55 60 Gly Val Arg Leu Leu Ala Gln Ala Glu Gly Asn Arg Val Leu Ala Asp 65 70 75 80 Gly Glu Asp Leu Thr Ser Phe Leu His Thr Pro Glu Val Asp Arg Val 85 90 95 Val Ser Ala Val Ala Arg Leu Pro Gly Val Arg Ala Trp Val Asn Arg 100 105 110 Arg Leu Lys Glu Val Pro Pro Pro Phe Val Ala Glu Gly Arg Asp Met 115 120 125 Gly Thr Ala Val Phe Pro Glu Ala Ala His Lys Phe Tyr Leu Thr Ala 130 135 140 Ser Pro Glu Val Arg Ala Trp Arg Arg Ala Arg Glu Arg Pro Gln Ala 145 150 155 160 Tyr Glu Glu Val Leu Arg Asp Leu Leu Arg Arg Asp Glu Arg Asp Lys 165 170 175 Ala Gln Ser Ala Pro Ala Pro Asp Ala Leu Val Leu Asp Thr Gly Gly 180 185 190 Met Thr Leu Asp Glu Val Val Ala Trp Val Leu Ala His Ile Arg Arg 195 200 205 <210> 14 <211> 225 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 14 Met Arg Ile Val Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asn 1 5 10 15 Pro Asp Ile Asp Phe Ile Lys Glu Ile Ala Tyr Gln Leu Thr Lys Val 20 25 30 Ser Glu Asp His Glu Val Ala Val Val Val Gly Gly Gly Lys Leu Ala 35 40 45 Arg Lys Tyr Ile Glu Val Ala Glu Lys Phe Asn Ser Ser Glu Thr Phe 50 55 60 Lys Asp Phe Ile Gly Ile Gln Ile Thr Arg Ala Asn Ala Met Leu Leu 65 70 75 80 Ile Ala Ala Leu Arg Glu Lys Ala Tyr Pro Val Val Val Glu Asp Phe 85 90 95 Trp Glu Ala Trp Lys Ala Val Gln Leu Lys Lys Ile Pro Val Met Gly 100 105 110 Gly Thr His Pro Gly His Thr Thr Asp Ala Val Ala Ala Leu Leu Ala 115 120 125 Glu Phe Leu Lys Ala Asp Leu Leu Val Val Ile Thr Asn Val Asp Gly 130 135 140 Val Tyr Thr Ala Asp Pro Lys Lys Asp Pro Thr Ala Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Lys Met Lys Pro Glu Glu Leu Leu Glu Ile Val Gly Lys Gly Ile Glu 165 170 175 Lys Ala Gly Ser Ser Ser Val Ile Asp Pro Leu Ala Ala Lys Ile Ile 180 185 190 Ala Arg Ser Gly Ile Lys Thr Ile Val Ile Gly Lys Glu Asp Ala Lys 195 200 205 Asp Leu Phe Arg Val Ile Lys Gly Asp His Asn Gly Thr Thr Ile Glu 210 215 220 Pro 225 <210> 15 <211> 207 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 15 Met Lys Gly Gln Leu Phe Val Ile Cys Gly Pro Ser Gly Ala Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ser Ile Ile Lys Glu Val Leu Lys Arg Leu Asp Asn Val Val Phe 20 25 30 Ser Val Ser Cys Thr Thr Arg Pro Lys Arg Pro His Glu Glu Asp Gly 35 40 45 Lys Asp Tyr Phe Phe Ile Thr Glu Glu Glu Phe Leu Lys Arg Val Glu 50 55 60 Arg Gly Glu Phe Leu Glu Trp Ala Arg Val His Gly His Leu Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Leu Arg Ser Phe Val Glu Ser His Ile Asn Glu Gly Lys Asp Val 85 90 95 Val Leu Asp Ile Asp Val Gln Gly Ala Leu Ser Val Lys Lys Lys Tyr 100 105 110 Ser Asn Thr Val Phe Ile Tyr Val Ala Pro Pro Ser Tyr Ala Asp Leu 115 120 125 Arg Glu Arg Ile Leu Lys Arg Gly Thr Glu Lys Glu Ala Asp Val Leu 130 135 140 Val Arg Leu Glu Asn Ala Lys Trp Glu Leu Met Phe Met Asp Glu Phe 145 150 155 160 Asp Tyr Ile Val Val Asn Glu Asn Leu Glu Asp Ala Val Glu Met Val 165 170 175 Val Ser Ile Val Arg Ser Glu Arg Ala Lys Val Thr Arg Asn Gln Asp 180 185 190 Lys Ile Glu Arg Phe Lys Met Glu Val Lys Gly Trp Lys Lys Leu 195 200 205 <210> 16 <211> 142 <212> PRT <213> Aquifex aeolicus <400> 16 Met Ala Val Glu Arg Thr Leu Ile Ile Val Lys Pro Asp Ala Met Glu 1 5 10 15 Lys Gly Ala Leu Gly Lys Ile Leu Asp Arg Phe Ile Gln Glu Gly Phe 20 25 30 Gln Ile Lys Ala Leu Lys Met Phe Arg Phe Thr Pro Glu Lys Ala Gly 35 40 45 Glu Phe Tyr Tyr Val His Arg Glu Arg Pro Phe Phe Gln Glu Leu Val 50 55 60 Glu Phe Met Ser Ser Gly Pro Val Val Ala Ala Val Leu Glu Gly Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ile Lys Arg Val Arg Glu Ile Ile Gly Pro Thr Asp Ser Glu 85 90 95 Glu Ala Arg Lys Val Ala Pro Asn Ser Ile Arg Ala Gln Phe Gly Thr 100 105 110 Asp Lys Gly Lys Asn Ala Ile His Ala Ser Asp Ser Pro Glu Ser Ala 115 120 125 Gln Tyr Glu Ile Cys Phe Ile Phe Ser Gly Leu Glu Ile Val 130 135 140 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Initially Transcribed Sequence <400> 17 gggagaccag gaatt 15

Claims (101)

  1. 진핵생물 메신저 리보핵산(messenger ribonucleic acid: mRNA)을 합성하기 위한 무세포(cell-free) 반응 방법으로서,
    (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합(depolymering)되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및
    (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및
    (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제, v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형, viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계
    를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  2. 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법으로서,
    (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;　및
    (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및
    (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제, v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형 및 viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및
    (d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나
    또는
    (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 상기 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 mRNA를 생산하는 단계
    를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  3. 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법으로서,
    (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;　및
    (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및
    (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제, v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및
    (d) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계
    를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  4. 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법으로서,
    (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;　및
    (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및
    (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iii) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제, v) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된, 테일이 없는(untailed) RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및
    (d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나;
    또는
    (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 상기 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 비캡핑된 RNA를 생산하는 단계; 및
    (e) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계
    를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동시에 대신에 (c)의 나머지 단계 이전에 단계 (c) (i) 내지 (c) (v)를 수행하여 뉴클레오타이드 트라이포스페이트를 생산하는, 무세포 반응 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 캡핑 시약은 다이뉴클레오타이드, 트라이뉴클레오타이드 또는 테트라뉴클레오타이드 캡핑 시약인, 무세포 반응 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 RNA는 바이오매스(biomass)로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단계 (a)의 방법으로서, RNA를 5' 뉴클레오사이드 모노포스페이트로 해중합시키는 상기 효소는 뉴클레아제 P1인, 무세포 반응 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 상기 제2 반응 혼합물은 상기 PPK, 상기 NMP 키나제, 상기 NDP 키나제, 상기 데옥시리보핵산(DNA) 주형 및/또는 상기 RNA 중합효소를 생산하는 세포로부터 얻어지는 효소 제제를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트 키나제는 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus)로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트 키나제는 피로커스 푸리오서스(Pyroccus furiosus)로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트 키나제는 써마토가 마리티마(Thermatoga maritima)로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제는 아퀴펙스 애올리커스(Aquifex aeolicus)로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 폴리포스페이트 키나제는 데이노코커스 게오써말리스(Deinococcus geothermalis)로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2인, 무세포 반응 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스페이트 공여자는 헥사메타포스페이트인, 무세포 반응 방법.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 또는 이의 돌연변이체인, 무세포 반응 방법.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 주형은 i) 생성된 mRNA에 대한 오픈 리딩 프레임(ORF)을 암호화하는 서열; 및/또는 ii) 전사 프로모터, iii) 상기 생성된 mRNA에 대한 5' 미번역 영역(5' UTR)을 암호화하는 서열, iv) 상기 생성된 mRNA에 대한 3' 미번역 영역(3' UTR)을 암호화하는 서열 및 선택적으로, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 DNA 주형은 1종 이상의 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 요소를 암호화하는 서열을 더 포함하는, 무세포 반응 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 DNA 주형은 중합효소 연쇄 반응에 의해서 생산되는, 무세포 반응 방법.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 DNA 주형은 플라스미드 상에 암호화되는, 무세포 반응 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 플라스미드는 하나 또는 복수의 mRNA를 암호화하는 하나 또는 복수의 DNA 주형을 함유하는, 무세포 반응 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화되는, 무세포 반응 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화되는, 무세포 반응 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA 및/또는 제한 엔도뉴클레아제는 선형화 전 또는 후에 정제되는, 무세포 반응 방법. 무세포 반응 방법.
  25. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 poly(A) 중합효소는 열안정적인, 무세포 반응 방법.
  26. 제3항 또는 제4항에 있어서, 단계 3d 또는 4e의 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 포스파타제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 및/또는 구아닐릴트랜스퍼라제 활성을 갖는, 무세포 반응 방법.
  27. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 메틸 공여자는 S-아데노실 메티오닌인, 무세포 반응 방법.
  28. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 및/또는 블루텅 바이러스(Blue Tongue virus)로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  29. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 포스파타제 활성을 갖는, 무세포 반응 방법.
  30. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는, 무세포 반응 방법.
  31. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 구아닐릴트랜스퍼라제 활성을 갖는, 무세포 반응 방법.
  32. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PPK, 선택적으로 NMP 키나제, 선택적으로 NDP 키나제를 포함하는 상기 제2 반응 혼합물, 선택적으로 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는 데옥시리보핵산(DNA) 주형, RNA 중합효소, polyA 중합효소 및/또는 캡핑 효소는 하나 이상의 세포 용해물로부터 제조되되, 상기 세포 용해물 중에 존재하는 경우, 바람직하지 않은 효소 활성이 제거되거나, 불활성화되거나 또는 부분적으로 불활성화되는, 무세포 반응 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 바람직하지 않은 효소 활성은 물리적 분리에 의해서 제거되거나 열 처리에 의해서 불활성화되거나 또는 부분적으로 불활성화되는, 무세포 반응 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 효소를 불활성화시키거나 부분적으로 불활성화시키는 온도는 70℃ 내지 95℃인, 무세포 반응 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 효소를 불활성화시키거나 부분적으로 불활성화시키는 온도는 55℃ 이상인, 무세포 반응 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 제2 반응 혼합물은 크로마토그래피에 의해서 세포 용해물로부터 정제된 1종 이상의 효소를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  37. 제32항에 있어서, 상기 캡핑 효소는 크로마토그래피를 사용하여 바람직하지 않은 효소 활성으로부터 분리된, 무세포 반응 방법.
  38. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 여과, 추출, 침전 또는 크로마토그래피에 의한 mRNA의 정제를 더 포함하는, 무세포 반응 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 mRNA는 염화리튬 침전에 의해서 더 정제되는, 무세포 반응 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 mRNA는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 더 정제되는, 무세포 반응 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된, mRNA.
  42. 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법으로서,
    (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;
    (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및
    (c) 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형, viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계
    를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  43. 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법으로서,
    (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;　및
    (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및
    (c) 뉴클레오사이드 모노포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소, vii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형; viii) 1종 이상의 캡핑 시약을 캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및
    d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 mRNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나
    또는
    (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 mRNA를 생산하는 단계
    를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  44. 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법으로서,
    (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;
    (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계;
    (c) 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vi) 적어도 1종의 RNA 중합효소 및 vii) polyA 테일을 갖는 mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고; 추가로 선택적으로 viii) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계; 및
    (d) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계
    를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  45. 진핵생물 메신저 리보핵산(mRNA)을 합성하기 위한 무세포 반응 방법으로서,
    (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 상기 세포 RNA가 실질적으로 해중합되는 조건 하에서 RNA를 해중합시키는 1종 이상의 효소를 인큐베이션시키는 단계로서, 생성된 제1 반응 혼합물은 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;　및
    (b) 상기 반응 혼합물을 상기 RNA 해중합 효소가 제거되거나 불활성화되는 조건 하에서 처리하는 단계; 및
    (c) 뉴클레오사이드 다이포스페이트를 포함하는 상기 반응 혼합물을 i) 적어도 1종의 폴리포스페이트(PPK) 키나제 및 포스페이트 공여자; 선택적으로 ii) 적어도 1종의 뉴클레오사이드-다이포스페이트(NDP) 키나제 및 선택적으로 iii) 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트(CMP) 키나제, iv) 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트(UMP) 키나제, v) 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트(GMP) 키나제를 포함하는 제2 반응 혼합물과 vi) 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 생산되는 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 추가로 vii) 적어도 1종의 RNA 중합효소, viii) mRNA를 암호화하는 적어도 1종의 DNA 주형을 비캡핑된, 테일이 없는 RNA를 생산하는 조건 하에서 첨가하고, 추가로 선택적으로 ix) 적어도 1종의 데옥시리보뉴클레아제를 RNA 생산 이후에 상기 DNA를 분해시키는 조건 하에서 첨가하는, 상기 인큐베이션시키는 단계;
    (d) (i) 단계 (c)에서 생산된 상기 반응 혼합물을 비캡핑된 RNA를 생산하는 조건 하에서 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 추가로 인큐베이션시키거나;
    또는
    (ii) 불활성화 또는 물리적 분리에 의해서 단계 (c)의 상기 반응 혼합물로부터 RNA 중합효소를 제거하고, 그 다음 polyA 중합효소 및 ATP의 존재 하에서 상기 반응 혼합물을 추가로 인큐베이션시킴으로써 비캡핑된 RNA를 생산하는 단계; 및
    (e) 단계 (c)로부터의 상기 반응 혼합물로부터 완충액을 교환시키고, 상기 반응 혼합물을 캡핑 효소, GTP 및 메틸 공여자의 존재 하에서 인큐베이션시켜 mRNA를 생산하는 단계
    를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 동시에 대신에 (c)의 나머지 단계 이전에 단계 (c) (i) 내지 (c) (v)를 수행하여 뉴클레오타이드 트라이포스페이트를 생산하는, 무세포 반응 방법.
  47. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 캡핑 시약은 다이뉴클레오타이드, 트라이뉴클레오타이드 또는 테트라뉴클레오타이드 캡핑 시약인, 무세포 반응 방법.
  48. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 RNA는 바이오매스로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  49. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 해중합 효소는 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트(NDP)를 생성시키는 리보뉴클레아제인, 무세포 반응 방법.
  50. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, RNA를 5' 뉴클레오사이드 다이포스페이트로 해중합시키는 상기 효소는 PNPase인, 무세포 반응 방법.
  51. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 상기 제2 반응 혼합물은 PPK, NDP 키나제, NMP 키나제, 데옥시리보핵산(DNA) 주형, 및/또는 상기 RNA 중합효소를 생산하는 세포로부터 얻어지는 효소 제제를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  52. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 시티딘 모노포스페이트 키나제는 써머스 써모필러스로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  53. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 우리딘 모노포스페이트 키나제는 피로커스 푸리오서스로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  54. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 구아노신 모노포스페이트 키나제는 써마토가 마리티마로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  55. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제는 아퀴펙스 애올리커스로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  56. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 폴리포스페이트 키나제는 데이노코커스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2인, 무세포 반응 방법.
  57. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스페이트 공여자는 헥사메타포스페이트인, 무세포 반응 방법.
  58. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 또는 이의 돌연변이체인, 무세포 반응 방법.
  59. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 주형은 i) 생성된 mRNA에 대한 오픈 리딩 프레임(ORF)을 암호화하는 서열; 및/또는 ii) 전사 프로모터, iii) 상기 생성된 mRNA에 대한 5' 미번역 영역(5' UTR)을 암호화하는 서열, iv) 상기 생성된 mRNA에 대한 오픈 리딩 프레임(ORF)암호화하는 서열, v) 상기 생성된 mRNA에 대한 3' 미번역 영역(3' UTR)을 암호화하는 서열 및/또는 선택적으로, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 DNA 주형은 1종 이상의 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 요소를 암호화하는 서열을 더 포함하는, 무세포 반응 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 DNA 주형은 중합효소 연쇄 반응에 의해서 생산되는, 무세포 반응 방법.
  62. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 DNA 주형은 플라스미드 상에 암호화되는, 무세포 반응 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 플라스미드는 하나 또는 복수의 mRNA를 암호화하는 하나 또는 복수의 DNA 주형을 함유하는, 무세포 반응 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화되는, 무세포 반응 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화되는, 무세포 반응 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA 및/또는 제한 엔도뉴클레아제는 선형화 전 또는 후에 정제되는, 무세포 반응 방법.
  67. 제43항 또는 제45항에 있어서, 상기 poly(A) 중합효소는 열안정적인, 무세포 반응 방법.
  68. 제44항 또는 제45항에 있어서, 단계 44d 또는 45e의 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 포스파타제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 및/또는 구아닐릴트랜스퍼라제 활성을 갖는, 무세포 반응 방법.
  69. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 메틸 공여자는 S-아데노실 메티오닌인, 무세포 반응 방법.
  70. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 백시니아 바이러스 및/또는 블루텅 바이러스로부터 유래되는, 무세포 반응 방법.
  71. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 포스파타제 활성을 갖는, 무세포 반응 방법.
  72. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는, 무세포 반응 방법.
  73. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 1종 이상의 캡핑 효소는 구아닐릴트랜스퍼라제 활성을 갖는, 무세포 반응 방법.
  74. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PPK, 선택적으로 상기 NDP 키나제, 선택적으로 상기 NMP 키나제를 포함하는 상기 제2 반응 혼합물, 선택적으로 상기 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는 데옥시리보핵산(DNA) 주형, 상기 RNA 중합효소, 상기 polyA 중합효소 및/또는 상기 캡핑 효소는 하나 이상의 세포 용해물로부터 제조되되, 상기 세포 용해물 중에 존재하는 경우, 바람직하지 않은 효소 활성이 제거되거나, 불활성화되거나 또는 부분적으로 불활성화되는, 무세포 반응 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 바람직하지 않은 효소 활성은 물리적 분리에 의해서 제거되거나 열 처리에 의해서 불활성화되거나 또는 부분적으로 불활성화되는, 무세포 반응 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 효소를 불활성화시키거나 부분적으로 불활성화시키는 온도는 70℃ 내지 95℃인, 무세포 반응 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 효소를 불활성화시키거나 부분적으로 불활성화시키는 온도는 55℃ 이상인, 무세포 반응 방법.
  78. 제32항 또는 제74항에 있어서, 상기 RNA 중합효소는 헥사히스티딘-태깅되고, 고정 금속 친화도 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography)에 의해서 정제되는, 무세포 반응 방법.
  79. 제74항에 있어서, 상기 캡핑 효소는 크로마토그래피를 사용하여 바람직하지 않은 효소 활성으로부터 분리된, 무세포 반응 방법.
  80. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 여과, 추출, 침전 또는 크로마토그래피에 의한 mRNA의 정제를 더 포함하는, 무세포 반응 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 mRNA는 염화리튬 침전에 의해서 더 정제되는, 무세포 반응 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 mRNA는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 더 정제되는, 무세포 반응 방법.
  83. 제38항 내지 제40항 또는 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA는 역상 이온쌍 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 더 정제되는, 무세포 반응 방법.
  84. 제42항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된, mRNA.
  85. 제1항 내지 제40항 또는 제42항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 단계 (b) 이외의 수단에 의해서 생산된 뉴클레오타이드를 단계 (c)의 상기 반응 혼합물에 첨가함으로써, 단계 (a) 및 단계 (b)에 대한 필요성을 제거한, 무세포 반응 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 NMP, NDP, NTP 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 무세포 반응 방법.
  87. 제85항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 비변형된 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물 중 1종 이상으로 이루어지는, 무세포 반응 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 1종 이상의 비변형된 NMP 및 1종 이상의 변형된 NTP로 이루어져, 1종 이상의 비변형된 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드로 100% 대체된 mRNA를 생성시키는, 무세포 반응 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 비변형된 AMP, CMP 및 GMP 및 슈도우리딘 트라이포스페이트(슈도UTP)를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  90. 제88항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 슈도UTP 및 5-메틸시티딘 트라이포스페이트(5-메틸 CTP)를 갖는 비변형된 AMP 및 GMP를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  91. 제87항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 슈도UTP 및/또는 5-메틸 CTP를 갖는 비변형된 AMP, CMP, UMP 및 GMP 중 1종 이상을 함유하는 혼합물을 포함하는, 무세포 반응 방법.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드를 세포-RNA-유래 뉴클레오타이드에 첨가하여 부분적으로 변형된 mRNA를 달성하는, 무세포 반응 방법.
  93. 제2항, 제4항, 제43항 및 제45항 중 어느 한 항의 단계 (c) 또는 단계 (d)로서, ATP를 직접 첨가하는, 무세포 반응 방법.
  94. 제2항, 제4항, 제43항 및 제45항 중 어느 한 항의 단계 (c) 또는 단계 (d)로서, PPK의 존재 하에서 정제된 AMP 또는 ADP + 포스페이트 공여자를 첨가하여 ATP를 생성시키는, 무세포 반응 방법.
  95. 제2항, 제4항, 제43항 및 제45항 중 어느 한 항의 단계 (c) 또는 단계 (d)로서, PPK의 존재 하에서 세포 RNA로부터 유래된 AMP 또는 ADP 및 포스페이트 공여자를 첨가하여 ATP를 생성시키는, 무세포 반응 방법.
  96. 제3d항, 제4e항, 제44d항 및 제45e항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GTP를 직접 첨가하는, 무세포 반응 방법.
  97. 제3d항, 제4e항, 제44d항 및 제45e항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 GMP 또는 GDP와 포스페이트 공여자를 1종 이상의 키나제의 존재 하에서 사용하여 GTP를 생산하는 무세포 반응 방법.
  98. 제3d항, 제4e항, 제44d항 및 제45e항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 RNA로부터 유래된 GMP 또는 GDP 및 포스페이트 공여자를 1종 이상의 키나제의 존재 하에서 사용하여 GTP를 생산하는, 무세포 반응 방법.
  99. 제9항 또는 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 상기 제2 반응 혼합물은 PPK, NDP 키나제, NMP 키나제, 데옥시리보핵산(DNA) 주형 및/또는 상기 RNA 중합효소를 생산하는 세포로부터 얻어지는 효소 제제를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  100. 제7항 또는 제48항에 있어서, 상기 바이오매스는 효모를 포함하는, 무세포 반응 방법.
  101. 제85항 내지 제100항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된, mRNA.
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