CN113046403B - 一种基于构建atp再生系统高效催化合成paps的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于构建ATP再生系统高效催化合成PAPS的方法，属于生物工程技术领域。通过微生物重组表达人工构建PAPS合成双功能酶，实现了PAPS的高效率生产。在此基础上，耦联了谷氨酸棒杆菌和结核分枝杆菌来源的聚磷酸激酶的ATP再生系统，可同时回收两种副产物焦磷酸和ADP，实现底物与产物的等量转化，催化体系中生成的PAPS具有较高的纯度，能实现大部分磺酸转移反应中磺酸基团的供给。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于构建ATP再生系统高效催化合成PAPS的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate，PAPS)是体外磺酸反应最重要的活性磺酸供体，可用于硫酸软骨素、肝素和硫酸皮肤素的磺酸化基团供给。
目前PAPS购买渠道狭窄，价格昂贵且纯度不高，主要原因为体外酶法合成PAPS转化率低，副产物难以去除，PAPS纯化困难。
在PAPS酶法合成中，主要产生两种副产物焦磷酸和ADP，使得底物的理论转化率仅为50％。副产物的重新利用是PAPS高效生产的重要研究内容，在目前的研究中多从聚磷酸激酶的角度入手，以期将副产物转化再利用，但是大多数的聚磷酸激酶只能转化ADP，而并不能转化焦磷酸，仍然存在着副产物不能得到充分利用的问题。
发明内容
[技术问题]
在酶法合成PAPS的过程中，由于副产物焦磷酸和ADP的产生，大量物质流和能量流被浪费，导致PAPS合成价格高昂且难于得到纯度较高的PAPS。已有报道的聚磷酸激酶大部分都只能转化ADP，而不能转化焦磷酸，但是在酶法制备PAPS中，副产物焦磷酸的量也比较大，如果只能转化ADP的话，那么剩余的焦磷酸还是不能被充分利用，造成了资源的浪费。
[技术方案]
发明人从少数能够同时转化ADP和焦磷酸的聚磷酸激酶中选出了一种酶活力高且能高效利用ADP和焦磷酸的聚磷酸激酶。基于筛选出的聚磷酸激酶，将其与酶法催化生成PAPS的系统进行耦联，可同时回收副产物焦磷酸和ADP合成底物ATP，继续参加PAPS的合成，实现无副产物的PAPS的合成，在催化体系中有极高的PAPS纯度，应用广泛。从而提高了整个反应过程的转化率、显著降低了生产成本、提升了效率。
本发明提供了一种合成PAPS的方法，在酶法转化合成PAPS的反应中加入聚磷酸激酶；所述酶法转化合成PAPS是以ATP为底物，以能将ATP转化为PAPS的酶为催化剂。
在本发明的一种实施方式中，所述聚磷酸激酶包括但不限于来源于谷氨酸棒杆菌、结核分枝杆菌、铜绿芽孢杆菌或链霉菌。
在本发明的一种实施方式中，来源于结核分枝杆菌的聚磷酸激酶的Gene ID为888760。
在本发明的一种实施方式中，所述聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒杆菌，Gene ID为1020661。
在本发明的一种实施方式中，所述能将ATP转化为PAPS的酶为APS激酶和ATP硫酸化酶；或是通过linker将APS激酶和ATP硫酸化酶连接得到的PAPS合成双功能酶。
在本发明的一种实施方式中，所述APS激酶的Gen Bank号为M74586.1。
在本发明的一种实施方式中，所述ATP硫酸化酶的Gene ID为853466。
在本发明的一种实施方式中，所述linker的序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有硫酸盐作为硫酸根供体，硫酸盐包括但不限于硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾。
在本发明的一种实施方式中，硫酸盐可优选为硫酸镁。
在本发明的一种实施方式中，在反应体系中加入底物ATP和硫酸镁，再加入PAPS合成双功能酶，或同时加入APS激酶和ATP硫酸化酶，催化反应开始后的0-24h添加聚磷酸激酶进行反应。
在本发明的一种实施方式中，催化合成PAPS的催化体系中缓冲液为50-100mMTris-HCl buffer pH 7.0～8.5，PAPS合成双功能酶1～5mg/mL，聚磷酸激酶1～5mg/mL，底物ATP 5～25g/L，硫酸镁3～15g/L。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中没有ATP检出时即视为反应结束。
本发明提供了一种提高PAPS转化效率的方法，在以ATP为底物的转化底物中加入聚磷酸激酶和磷酸供体。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸供体包括三聚磷酸、四聚磷酸和/或六聚磷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸供体包括三聚磷酸钠、四聚磷酸钠和/或六聚磷酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述聚磷酸激酶包括但不限于来源于谷氨酸棒杆菌、结核分枝杆菌、铜绿芽孢杆菌或链霉菌。
在本发明的一种实施方式中，来源于结核分枝杆菌的聚磷酸激酶的Gene ID为888760。
在本发明的一种实施方式中，所述聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒杆菌，Gene ID为1020661。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有硫酸盐作为硫酸根供体，硫酸盐包括但不限于硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾。
在本发明的一种实施方式中，硫酸盐可优选为硫酸镁。
在本发明的一种实施方式中，在反应体系中加入底物ATP和硫酸镁，再加入PAPS合成双功能酶，或同时加入APS激酶和ATP硫酸化酶，催化反应开始后的0-24h添加聚磷酸激酶进行反应。
在本发明的一种实施方式中，催化合成PAPS的催化体系中缓冲液为50-100mMTris-HCl buffer pH 7.0～8.5，PAPS合成双功能酶1～5mg/mL，聚磷酸激酶1～5mg/mL，底物ATP 5～25g/L，硫酸镁3～15g/L。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中没有ATP检出时即视为反应结束。
本发明提供了一种提高ADP回收效率和速率的方法，在合成PAPS的反应中加入聚磷酸激酶，同时再加入磷酸供体；所述ADP是以ATP为底物合成PAPS的副产物。
在本发明的一种实施方式中，所述聚磷酸激酶包括但不限于来源于谷氨酸棒杆菌、结核分枝杆菌、铜绿芽孢杆菌或链霉菌。
在本发明的一种实施方式中，来源于结核分枝杆菌的聚磷酸激酶的Gene ID为888760。
在本发明的一种实施方式中，所述聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒杆菌，Gene ID为1020661。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸供体包括但不限于焦磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸和/或六聚磷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸供体包括三聚磷酸钠、四聚磷酸钠和/或六聚磷酸钠。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有硫酸盐作为硫酸根供体，硫酸盐包括但不限于硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾。
在本发明的一种实施方式中，硫酸盐可优选为硫酸镁。
在本发明的一种实施方式中，在反应体系中加入底物ATP和硫酸镁，再加入PAPS合成双功能酶，或同时加入APS激酶和ATP硫酸化酶，催化反应开始后的0-24h添加聚磷酸激酶进行反应。
在本发明的一种实施方式中，催化合成PAPS的催化体系中缓冲液为50-100mMTris-HCl buffer pH 7.0～8.5，PAPS合成双功能酶1～5mg/mL，聚磷酸激酶1～5mg/mL，底物ATP 5～25g/L，硫酸镁3～15g/L。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中没有ATP检出时即视为反应结束。
本发明还保护所述合成PAPS的方法，或提高PAPS转化效率的方法，或提高ADP回收效率和速率的方法在制备PAPS中的应用。
本发明还保护所述合成PAPS的方法，或提高PAPS转化效率的方法，或提高ADP回收效率和速率的方法在制备以PAPS为原料的产品中的应用。
本发明还保护所述合成PAPS的方法，或提高PAPS转化效率的方法，或提高ADP回收效率和速率的方法在制备需要有磺酸基团供给的产品中的应用。
[有益效果]
1、本发明利用PAPS合成双功能酶制备PAPS，与传统双酶合成法相比，催化剂制备步骤简单，催化效率高，稳定性好。
2、本发明在PAPS合成反应中引入耦联聚磷酸激酶的副产物回收系统，能同时将副产物焦磷酸和ADP回收，实现底物ATP和PAPS的等摩尔转化，使得合成完成后的体系中含有较高纯度的PAPS，无需额外纯化也可用于大部分磺酸转移反应中磺酸基团的供给。
附图说明
图1是PAPS合成体系中两种副产物同时再生示意图。
图2是不同来源聚磷酸激酶SDS-PAGE图；泳道1为结合分枝杆菌来源的聚磷酸激酶；泳道2为谷氨酸棒杆菌来源的聚磷酸激酶。
图3是谷氨酸棒杆菌及分支杆菌来源的聚磷酸激酶的酶活测定。
图4是不同催化体系下PAPS合成转化率。
具体实施方式
材料：
实验中所涉及的菌株、质粒均为本实验室保藏。
各种分析纯试剂购自国药集团。
基因操作工具、试剂购买于上海生物生工。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
TB培养基(g/L)：蛋白胨12，酵母粉24，K2HPO4 9.4，KH2PO4 2.2，甘油5。
ATP检测方法：购买于北京索莱宝科技有限公司，使用方法详见说明书。
PAPS检测方法：采用Agilent 1600HPLC系统，Polyamine II柱(4.6×250mm,12nm)，流动相：50mM KH2PO4和0.1％三乙胺溶液，流速：0.6mL·min-1，进样量：5μL，检测时间35min，检测器：UV 254nm。
PAPS合成双功能酶酶活定义：37℃条件下，每小时合成1μM PAPS所需要的酶量。
聚磷酸激酶酶活定义：37℃条件下，每小时合成1μM ATP所需要的酶量。
比酶活定义：37℃条件下，单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数。
ATP转化率：产品PAPS的摩尔数与底物ATP的摩尔比值。
实施例1：聚磷酸激酶的获得
(1)在NCBI网站获得来源谷氨酸棒杆菌的聚磷酸激酶的Gene ID:1020661，通过密码子优化获得核苷酸序列，利用聚合酶链式反应扩增目的基因，并接至pRSFDuet-1载体上，得到重组质粒，将验证正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)得到转化子，将转化子培养并测序验证，将验证正确的转化子处记为菌株E.coli GluPPK。
(2)查得结核分枝杆菌来源的聚磷酸激酶的Gene ID:888760，通过密码子优化获得核苷酸序列，利用与步骤(1)相似的方法，将目的基因扩增并连接到载体pET32a(+)上，并将验证正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)得到转化子，将转化子培养并测序验证，将验证正确的转化子记为菌株E.coli MycPPK。
表达条件：挑取单菌落于LB培养基中过夜培养，将种子按照2mL/100mL接种于TB培养基中，继续培养至OD600为0.6-0.8时进行诱导表达。
菌株E.coli GluPPK诱导条件为：0.3-0.5mM的IPTG诱导表达(30℃，220rpm)，表达时间为10-12h；培养基中加入终浓度为50μg/L硫酸卡那霉素以保证质粒的稳定性。
菌株E.coli MycPPK诱导条件为：0.1-0.2mM的IPTG诱导表达(20℃，220rpm)，表达时间为20-24h；培养基中加入终浓度为100μg/L的氨苄青霉素。
实施例2：两种聚磷酸激酶的纯化及酶活比较
将实施例1中得到的重组菌株在LB培养基中培养6-20h之后，将收集的菌体超声破碎后高速离心去除细胞碎片，上清经由0.22μm水系膜过滤，利用Ni-NTA亲和层析对目的蛋白进行纯化。A液平衡柱子后上样粗酶液，再利用A液平衡层析柱，之后利用不同浓度的B液冲洗层析柱并收集冲洗液，利用SDS-PAGE验证纯化的组分(图2)，并将最纯的组分用PD-10脱盐柱进行脱盐，脱盐时使用低盐缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl；pH 6.0)，收集得到纯化脱盐的蛋白。
A液：20mM Tris-HCl buffer pH 7.5，500mM NaCl
B液：20mM Tris-HCl buffer pH 7.5，500mM NaCl，500mM咪唑。
在获得不同来源的聚磷酸激酶的纯酶后，先向催化体系50-100mM Tris-HClbuffer pH 7.5中同时添加等量纯酶0.5-1.0mg/L和ADP 5g/L，再分别添加等量不同的磷酸供体焦磷酸钠、三聚磷酸钠和偏六磷酸钠2-5g/L。通过检测ATP的产生来测定聚磷酸激酶的比酶活，反应温度为30-35℃，反应时间为12-24h，结果如图3所示，来源于谷氨酸棒杆菌的聚磷酸激酶能在以焦磷酸钠、三聚磷酸钠和偏六磷酸钠为底物时，比酶活更高。
实施例3：合成双功能酶的表达、纯化及酶活测定
双功能酶的构建：按照基因操作手段将酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶(Gene ID为853466)和大肠杆菌来源的APS激酶(Gen Bank号为M74586.1)融合为一个片段(两种酶的前后顺序不影响其表达)，分别在接头部分添加不同融合接头序列(linker)，融合为一个片段，使两种酶均保持一定的空间位置，催化更加有序，具体为，将前面一个基因的终止密码子去除，与linker直接连接，再与另一个基因的起始密码子连接，所述linker序列为：(GGGGS)6，将融合片段连接至质粒pET28a(+)，并转入E.coli BL21(DE3)得到转化子，将转化子培养并测序验证，将验证正确的转化子处记为菌株E.coli CaePAPS。具体的表达方式及酶的纯化方法同实施例1和2。
菌株E.coli CaePAPS诱导条件：0.1-0.2mM的IPTG诱导表达(25℃，220rpm)，表达时间为10-15h。
酶活测定：向催化体系中50-100mM Tris-HCl buffer pH 7.5中添加双功能酶的纯酶0.5-1.0mg/mL、底物ATP 1-5g/L和硫酸镁0.5-2.5g/L，通过检测反应体系中的PAPS的产生测定PAPS合成双功能酶的酶活，反应温度为30-35℃，反应时间为24-48h。结果表明酶活为300±20U，可用于后续的转化。
实施例4：耦联ATP再生系统高效合成PAPS
利用实施例3获得的合成双功能酶和实施例2获得的谷氨酸棒杆菌来源的聚磷酸激酶，合成PAPS。
准备1.5mL的反应体系(50-100mM Tris-HCl buffer pH 7.5)，其中，PAPS合成双功能酶1mg/mL，聚磷酸激酶1mg/mL，底物ATP 5g/L，硫酸镁3g/L。其中PAPS合成双功能酶加入时间为反应开始后0h，聚磷酸激酶加入的时间为反应开始后0～24h，反应35～50h完成反应(反应体系中没有ATP检出时即视为反应结束)，反应结束后测定PAPS的产量。
为了达到更高的产量和更快的转化速率，催化体系中可额外添加磷酸供体(焦磷酸钠、三聚磷酸钠和偏六磷酸钠)，利用和上述相同的方法制备合成PAPS，只是在反应时，在反应体系中加入终浓度为2g/L的磷酸供体(焦磷酸钠、三聚磷酸钠和偏六磷酸钠)，进行反应，反应结束后对PAPS纯化并测定产量。
产量结果如图4所示，耦联了聚磷酸激酶之后，底物ATP转化效率得到显著提升，可从耦联前的42％提升至83％～95％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种基于构建ATP再生系统高效催化合成PAPS的方法
<130> BAA201050A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Claims (10)
1.一种合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的方法，其特征在于，以ATP为底物，以APS激酶和ATP硫酸化酶为催化剂，并在反应中加入聚磷酸激酶合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸；所述聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒杆菌或结核分枝杆菌，Gene ID分别为1020661和888760；所述APS激酶的GenBank号为M74586.1；所述ATP硫酸化酶的Gene ID为853466。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过linker将APS激酶和ATP硫酸化酶连接得到PAPS合成双功能酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述linker的序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中还含有硫酸盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在反应体系中加入底物ATP和硫酸镁，再加入PAPS合成双功能酶，或同时加入APS激酶和ATP硫酸化酶，催化反应开始后的0-24h添加聚磷酸激酶进行反应；所述PAPS合成双功能酶是通过SEQ ID NO.1所示的linker将APS激酶和ATP硫酸化酶连接得到的。
6.一种提高3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸转化效率的方法，其特征在于，在以ATP为底物的反应体系中加入聚磷酸激酶和磷酸供体；所述磷酸供体包括三聚磷酸、四聚磷酸和/或六聚磷酸；所述反应体系中含有APS激酶和ATP硫酸化酶；所述APS激酶的GenBank号为M74586.1；所述ATP硫酸化酶的Gene ID为853466；所述聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒杆菌或结核分枝杆菌，Gene ID分别为1020661和888760。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，反应体系中还含有硫酸盐作为硫酸根供体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在反应体系中加入底物ATP和硫酸镁，再加入PAPS合成双功能酶，或同时加入APS激酶和ATP硫酸化酶，催化反应开始后24h内添加聚磷酸激酶进行反应；所述PAPS合成双功能酶是通过SEQ ID NO.1所示的linker将APS激酶和ATP硫酸化酶连接得到的。
9.一种提高ADP回收效率和速率的方法，其特征在于，在合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的反应中加入聚磷酸激酶，同时再加入磷酸供体；所述ADP是以ATP为底物合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的副产物；所述合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的反应是以ATP为底物，以APS激酶和ATP硫酸化酶为催化剂；所述聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒杆菌或结核分枝杆菌，Gene ID分别为1020661和888760；所述APS激酶的GenBank号为M74586.1；所述ATP硫酸化酶的Gene ID为853466。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述磷酸供体包括但不限于焦磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸和/或六聚磷酸。
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Application publication date: 20210629 Assignee: NANJING HANXIN PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2023980051872 Denomination of invention: A method for efficient catalytic synthesis of PAPS based on constructing an ATP regeneration system Granted publication date: 20230428 License type: Common License Record date: 20231213 |
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Application publication date: 20210629 Assignee: BLOOMAGE BIOTECH Co.,Ltd. Assignor: Jiangnan University Contract record no.: X2024980001409 Denomination of invention: A method for efficient catalytic synthesis of PAPS based on constructing an ATP regeneration system Granted publication date: 20230428 License type: Common License Record date: 20240125 |