CN110724675B - 转氨酶催化剂和酶法合成(r)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法 - Google Patents

转氨酶催化剂和酶法合成(r)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及一种转氨酶催化剂，还涉及一种酶法合成(R)‑1‑叔丁氧羰基‑3‑氨基哌啶的方法，以及一种(R)‑1‑叔丁氧羰基‑3‑氨基哌啶的生产方法。该酶法合成(R)‑1‑叔丁氧羰基‑3‑氨基哌啶的方法包括：在磷酸吡哆醛和转氨酶催化剂的存在下，作为反应底物的N‑叔丁氧羰基‑3‑哌啶酮与氨基供体反应生成(R)‑1‑叔丁氧羰基‑3‑氨基哌啶。酶法合成(R)‑1‑叔丁氧羰基‑3‑氨基哌啶的方法所用试剂较少，反应条件温和，大大的简化了采用化学工艺合成所需的繁琐步骤，且无需拆分即可获得ee值高达99.77％以上的目标产物。因此，本发明所提供的转氨酶催化剂及利用该转氨酶催化剂合成(R)‑1‑叔丁氧羰基‑3‑氨基哌啶的工艺方法具有广阔的应用前景与不菲的市场价值。

Description

转氨酶催化剂和酶法合成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的 方法
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及一种转氨酶催化剂，还涉及一种酶法合成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法，以及一种(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的生产方法。
背景技术
(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶(又称为R-1-BOC-3-氨基哌啶)是重要的医药及有机合成的中间体，在香料农药等的生产上有着一定的应用。
现有的R-1-BOC-3-氨基哌啶的合成方法主要是化学合成法，沈大东等(CN200910097326.X，浙江医药股份有限公司新昌制药厂，2009-04-07)以3哌啶甲酸乙酯为原料经过氨解，氧化等步骤得到最终的产品R-1-BOC-3氨基哌啶。帅小华等(上海皓伯化工科技有限公司，一种制备(R)-或(S)-3-氨基哌啶双盐酸盐的方法，CN201510589806.3[P]，2015-12-02)以N-BOC-3-哌啶酮为原料，利用手性助剂叔丁基亚磺酰基，通过手性控制得到手性氨基。
现有的专利技术也提供了一系列化学合成路线，例如，中国专利CN101565397B披露了一种N-Boc-3-氨基哌啶及其光学异构体的合成方法，主要包括以下步骤：3-哌啶甲酸乙酯以卤代烃为溶剂、有机碱为缚酸剂，在0-10℃之间，滴加二碳酸二叔丁酯，反应得N-Boc-3-哌啶甲酸乙酯；以1，4-二氧六环为溶剂，N-Boc-3-哌啶甲酸乙酯进行氨解反应，得N-Boc-3-哌啶甲酰氨；N-Boc-3-哌啶甲酰氨滴加到次氯酸钠和氢氧化钠的溶液中，得N-Boc-3-氨基哌啶。
然而，现有的合成方法涉及较多试剂，且操作复杂，工序繁琐，因此成本较高，并且无法得到高光学纯度的目标产物。
发明内容
针对现有技术中存在的种种技术缺陷，本发明旨在提供一种全新的酶法合成路线，该路线仅一步反应即可制得目标产物——(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶，而且产物ee值高达99.77％以上。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：
本发明第一方面提供了一种转氨酶催化剂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体参见下表1：
表1转氨酶催化剂的核苷酸序列与氨基酸序列
Figure BDA0002255599840000021
Figure BDA0002255599840000031
本发明第二方面提供了一种酶法合成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法，其反应方程式为：
Figure BDA0002255599840000032
其中，在磷酸吡哆醛和转氨酶催化剂的存在下，作为反应底物的N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮与氨基供体反应生成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶；
其中，所述转氨酶催化剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
值得补充说明的是，在上述方法中，磷酸吡哆醛(即PLP)作为辅酶，而转氨酶催化剂可以是纯的游离状态的酶(例如以例如酶粉的形式使用)，也可以表达该转氨酶催化剂的细胞的形式使用(例如表达该转氨酶催化剂的湿菌体)。当然，上述转氨酶催化剂还可以本领域技术人员所已知的任何其它形式存在，例如表达该转氨酶催化剂的细胞破碎上清液。
优选地，在上述酶法合成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法中，所述氨基供体选自以下任一种：异丙胺，叔丁胺，苯乙氨，丙氨酸，丁氨酸；进一步优选地，所述氨基供体为异丙胺，苯乙氨，丙氨酸中的任一种。
同时，本发明第三方面还提供了一种(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的生产方法，其包括以下步骤：
向反应容器中加入表达转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体、缓冲液、磷酸吡哆醛、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和氨基供体，在30～50℃下，搅拌反应12～36小时，后处理，即得(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶。
其中，所述转氨酶催化剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，在上述生产方法中，所述氨基供体选自以下任一种：异丙胺，叔丁胺，苯乙氨，丙氨酸，丁氨酸；进一步优选地，所述氨基供体为异丙胺，苯乙氨，丙氨酸中的任一种。
优选地，在上述生产方法中，所述缓冲液选自以下任一种：TEOA缓冲液，PBS缓冲液，Tris-盐酸缓冲液，HEPES缓冲液。并且，所述缓冲液最优选为TEOA缓冲液。
进一步优选地，在上述生产方法中，所述TEOA缓冲液的浓度为0.05～0.50M，并且所述TEOA缓冲液的pH值为7～10。在此基础上进一步优选地，所述TEOA缓冲液的浓度为0.05～0.20M，并且所述TEOA缓冲液的pH值为7～10。更进一步优选地，所述TEOA缓冲液的浓度为0.10M且pH值为8。
优选地，在上述生产方法中，所述磷酸吡哆醛的浓度为0.01mM～20mM；并且，所述磷酸吡哆醛的浓度进一步优选为2mM。
优选地，在上述生产方法中，所述重组大肠杆菌湿菌体的浓度为5～200g/L。进一步优选地，所述重组大肠杆菌湿菌体的浓度为40～65g/L。
优选地，在上述生产方法中，所述氨基供体的浓度为0.5M～2M；并且，所述氨基供体的浓度进一步优选为1M。
总之，本发明所提供的技术方案与现有技术相比至少具备以下有益效果：
本发明所述的转氨酶催化剂的专一性非常高，催化活性强，且具有很高的手性选择性，用于医药中间体(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的合成，仅需一步反应即可获得目标产物。可见，酶法合成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法所用试剂较少，反应条件温和，大大的简化了采用化学工艺合成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的繁琐步骤，且无需拆分即可获得ee值高达99.77％以上的目标产物。
因此，本发明所提供的转氨酶催化剂及利用该转氨酶催化剂合成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的工艺方法具有广阔的应用前景与不菲的市场价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但不构成对本发明的限定；需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。
根据本发明第一方面的一种转氨酶催化剂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明第二方面的一种酶法合成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法，其反应方程式为：
Figure BDA0002255599840000051
其中，在磷酸吡哆醛和转氨酶催化剂的存在下，作为反应底物的N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮与氨基供体反应生成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶；
其中，所述转氨酶催化剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一个优选实施例中，所述氨基供体选自以下任一种：异丙胺，叔丁胺，苯乙氨，丙氨酸，丁氨酸。
根据本发明第三方面的一种(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的生产方法，其包括以下步骤：
向反应容器中加入表达转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体、缓冲液、磷酸吡哆醛、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和氨基供体，在30～50℃下，搅拌反应12～36小时，后处理，即得(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶。
其中，所述转氨酶催化剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
此外，上述重组大肠杆菌湿菌体构建时所采用的大肠杆菌宿主细胞为E.Coli,BL21(DE3)。并且，应当说明的是，上述重组大肠杆菌湿菌体是通过本领域技术人员已知的构建方法获得的，例如实施以下步骤：将合成的转氨酶催化剂基因DNA片段在37℃用限制性内切酶NdeI和AvrⅡ双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段(SEQ ID NO.1)；然后，将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经NdeI和EcoRI酶切后的质粒pACYC-Duet-B，在25℃下连接过夜得到重组表达质粒；将重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌感受态细胞中，转化条件为：45℃，热击90秒，在含有氯霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至感受态细胞中，转化液涂布到含有氯霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体(即重组大肠杆菌)。
在一个优选实施例中，所述缓冲液为TEOA缓冲液，且其浓度为0.05～0.50M，其pH值为7～10。该TEOA缓冲液的配制方法为：称取一定量的三乙醇胺，用纯水溶解，使用稀盐酸调pH至所需pH值，定容到刻度即得。
在一个优选实施例中，所述磷酸吡哆醛的浓度为0.01mM～20mM。
在一个优选实施例中，所述重组大肠杆菌湿菌体的浓度为5～200g/L。
在一个优选实施例中，所述氨基供体的浓度为0.5M～2M。
应当说明的是，所述磷酸吡哆醛的浓度、所述重组大肠杆菌湿菌体的浓度以及所述氨基供体的浓度均是相对于催化体系总体积而言的，即它们分别相对于催化体系总体积的浓度。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好地理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
依据本实施例对表达转氨酶催化剂的重组大肠杆菌进行培养：
将合成的转氨酶催化剂基因DNA片段在37℃用限制性内切酶NdeI和AvrⅡ双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段(SEQ ID NO.1)；然后，将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经NdeI和EcoRI酶切后的质粒pACYC-Duet-B，在25℃下连接过夜得到重组表达质粒；将重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌感受态细胞中，转化条件为：45℃，热击90秒，在含有氯霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至感受态细胞中，转化液涂布到含有氯霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体(即重组大肠杆菌)。
将上述重组大肠杆菌接种于含有氯霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养20h；挑取单菌落接种于含有氯霉素抗性的50mL LB液体培养基，振荡培养20h，培养结束后移取菌液于250mL TB液体培养基，培养2.5h后取菌液稀释检测OD值为0.7，加入0.1mM IPTG诱导蛋白表达，30℃振荡培养18h，8000rpm离心收集菌体。
实施例2
转氨酶催化剂活性及手性验证
催化体系如下(总体积5mL)：0.25g(50g/L)表达转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体，0.1M TEOA缓冲液(pH8)，2mM磷酸吡哆醛，100g/L N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮，0.5M异丙胺(用盐酸调pH至8)；反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应24小时。反应结束后用乙腈1:1灭活，取样HPLC检测产物的生成，经计算反应24小时转化率为25％，产物生成12.5g。经检测，产物为R对映体，ee值为99.77％以上。
实施例3
底物浓度优化
催化体系如下(总体积5mL)：表达转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体0.25g(50g/L)，0.1M TEOA缓冲液(pH8)，2mM磷酸吡哆醛，4～100g/L N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮，0.5M异丙胺(用盐酸调pH至8)；反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应24小时。
反应结束后用乙腈1:1灭活，取样HPLC检测产物的生成，结果如下表2所示：
表2不同底物浓度对应的产物生成量
Figure BDA0002255599840000071
Figure BDA0002255599840000081
实施例4
氨基供体浓度优化
催化体系如下(总体积5mL)：表达转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体0.25g(50g/L)，0.1M TEOA缓冲液(pH8)，2mM磷酸吡哆醛，100g/L N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮，0.5M-2M异丙胺(用盐酸调pH至8)；反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应4小时。
反应结束后用乙腈1:1灭活，取样HPLC检测产物的生成结果如下表3所示：
表3不同氨基供体浓度对应的转化率
异丙胺浓度 4小时转化率
0.5M 10.8％
1M 11.8％
2M 11.4％
实施例5
反应缓冲液选择
催化体系如下(总体积5mL)：表达转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体0.25g(50g/L)，在四组平行实验中，分别使用0.1M TEOA缓冲液(pH8)，0.1M PBS缓冲液(pH8)，0.1M Tris-盐酸缓冲液(pH8)，以及0.1M HEPES缓冲液作为缓冲液，2mM磷酸吡哆醛，100g/LN-叔丁氧羰基-3-哌啶酮，0.5M-2M异丙胺(用盐酸调pH至8)；反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应4小时。
反应结束后用乙腈1:1灭活，取样HPLC检测产物的生成结果如下表4所示：
表4不同种类缓冲液对应的转化率
Figure BDA0002255599840000082
Figure BDA0002255599840000091
可见，使用TEOA缓冲液时，所获得的转化率最高。
综合分析以上实验结果可知，本发明所使用的转氨酶催化剂的催化活性较高，该转氨酶催化剂能够耐受较高浓度的底物及高浓度的氨基供体；并且，由该转氨酶催化剂催化的转氨反应，能够使N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮一步反应生成光学纯度极高的(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶，因此，该生产方法有利于实现大规模工业化生产。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 宁波酶赛生物工程有限公司
<120> 转氨酶催化剂和酶法合成(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的方法
<130> ECN1940563A
<140> 2019110522208
<141> 2019-10-31
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 972
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggcttcga tggacaaagt cttctcaggt tactacgccc gtcaaaaact gctggaacgc 60
tcagataatc cgttctcaaa aggtattgcc tatgtcgaag gtaaactggt gctgccgagt 120
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tcatgcgata aaatgcgtct gaaatttccg ctggcactga gctctgtcaa aaatatcctg 300
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<210> 2
<211> 323
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ser Gly Tyr Tyr Ala Arg Gln Lys
1 5 10 15
Leu Leu Glu Arg Ser Asp Asn Pro Phe Ser Lys Gly Ile Ala Tyr Val
20 25 30
Glu Gly Lys Leu Val Leu Pro Ser Asp Ala Arg Ile Pro Leu Leu Asp
35 40 45
Glu Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Ile Ser Val Trp
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Leu Gln Arg Ile Leu Glu
65 70 75 80
Ser Cys Asp Lys Met Arg Leu Lys Phe Pro Leu Ala Leu Ser Ser Val
85 90 95
Lys Asn Ile Leu Ala Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg Asp Ala
100 105 110
Phe Val Glu Val Ile Val Thr Arg Gly Leu Thr Gly Val Arg Gly Ser
115 120 125
Lys Pro Glu Asp Leu Tyr Asn Asn Asn Ile Tyr Leu Leu Val Leu Pro
130 135 140
Tyr Ile Trp Leu Met Ala Pro Glu Asn Gln Leu His Gly Gly Glu Ala
145 150 155 160
Ile Ile Thr Arg Thr Val Arg Arg Thr Pro Pro Gly Ala Phe Asp Pro
165 170 175
Thr Ile Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Ile Lys Gly Met Phe Glu
180 185 190
Ala Met Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp Thr
195 200 205
Asn Leu Thr Glu Gly Cys Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asn Gly
210 215 220
Ile Ile Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Arg Gly Ile Thr Arg Lys
225 230 235 240
Ser Val Ile Asp Val Ala Arg Ala Asn Ser Ile Asp Ile Arg Leu Glu
245 250 255
Val Val Pro Val Glu Gln Ala Tyr His Ser Asp Glu Ile Phe Met Cys
260 265 270
Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Leu Leu Asp Gly Gln Pro
275 280 285
Val Asn Asp Gly Gln Val Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp Gly
290 295 300
Tyr Trp Glu Met His Tyr Asn Pro Ala Tyr Ser Phe Pro Val Asp Tyr
305 310 315 320
Gly Ser Gly

Claims (3)

1.一种(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
向反应容器中加入表达转氨酶催化剂的重组大肠杆菌湿菌体、缓冲液、磷酸吡哆醛、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和氨基供体，在30～50℃下，搅拌反应12～36小时，后处理，即得(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶；
其中，所述转氨酶催化剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述转氨酶催化剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
其中，所述氨基供体为异丙胺；并且，所述缓冲液为TEOA缓冲液，所述TEOA缓冲液的浓度为0.10M且pH值为8；
并且，所述重组大肠杆菌湿菌体的浓度为40～65g/L。
2.根据权利要求1所述的(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的生产方法，其特征在于，所述磷酸吡哆醛的浓度为0.01mM～20mM。
3.根据权利要求1所述的(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶的生产方法，其特征在于，所述氨基供体的浓度为0.5M～2M。
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