CN111500511B - 一种用于制备l-2-氨基丁酸的重组菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于制备L‑2‑氨基丁酸的重组菌及其构建方法和应用，属于生物化学技术领域。该重组菌是通过将苏氨酸脱氨酶基因、氨基酸脱氢酶基因以及甲酸脱氢酶基因转化至宿主菌中得到的；所述苏氨酸脱氨酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述氨基酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。本发明实施例提供的重组菌，可以实现在同一个载体上同时高效表达苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶；将该重组菌用于转化L‑苏氨酸来制备L‑2‑氨基丁酸，具有转化率高、制备成本低且操作简便等优点。

Description

一种用于制备L-2-氨基丁酸的重组菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体是一种用于制备L-2-氨基丁酸的重组菌及其构建方法和应用。

背景技术

2-氨基丁酸（2-aminobutyric acid，AABA）是一种非天然氨基酸，在药理学上具有很高的存在意义，它可以被用作合成布瓦西坦，左乙拉西坦和乙胺丁醇等几种治疗癫痫疾病药物的关键手型前体。AABA作为一种手性药物前体其光学纯度对药物安全性和有效治疗有着至关重要的作用。

目前传统的L-2-氨基丁酸制备方法主要有以下两种分别是化学法和生物法。化学法制备是比较经典的一种方法，虽在操作上较为简单但在制备过程中存在着反应条件苛刻，容易产生反应副产物且制备成本较高等问题，同时该法在制备过程中使用的大量有机溶剂会造成环境污染。生物法一般包括微生物发酵法和酶催化转化法。微生物发酵法是最传统的制备天然氨基酸的方法，其反应条件温和，对环境危害小，但其存在最终的反应产物成分不单一，且后期的分离工作较为繁琐等问题。酶催化转化是一种高选择性反应，不同的酶可作用于不同构型和种类的特定底物，达到定向转化的目的，具有较高的专一性的特点。酶催化转化法是一种高效率的制备方法，但目前很少有被运用到工业化的大生产中，原因是其工艺的转化率较低，成本偏高，同时也不适于工业的放大化生产。

因此，如何急需寻找一种可以在保证生产成本不提高的前提下，还能提高底物转化率的L-2-氨基丁酸制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备L-2-氨基丁酸的重组菌，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种用于制备L-2-氨基丁酸的重组菌，是通过将苏氨酸脱氨酶基因、氨基酸脱氢酶基因以及甲酸脱氢酶基因转化至宿主菌中得到的；所述苏氨酸脱氨酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述氨基酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述重组菌的构建方法，其包括以下步骤：

对所述氨基酸脱氨酶基因进行双酶切，并将双酶切后的氨基酸脱氨酶基因连接到表达载体的两个酶切位点之间，转化得到转化子；

通过如序列表SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列将所述苏氨酸脱氨酶基因和所述甲酸脱氢酶基因进行连接，得到连接基因片段；

对所述转化子进行双酶切，并将双酶切后的转化子与所述连接基因片段进行连接，得到连接产物；

将所述连接产物转入宿主菌中，得到所述重组菌。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，表达载体为pACYC-Duet-B质粒；表达载体的两个酶切位点分别为NcoI酶切位点和BamHI酶切位点。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述通过如序列表SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列将所述苏氨酸脱氨酶基因和所述甲酸脱氢酶基因进行连接，得到连接基因片段的步骤，具体包括：

取所述苏氨酸脱氨酶基因的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）产物，并消化所述苏氨酸脱氨酶基因的PCR产物中的模板和引物，得到第一消化产物；

取所述甲酸脱氢酶基因的PCR产物，并消化所述甲酸脱氢酶基因的PCR产物中的模板和引物，得到第二消化产物；

将所述第一消化产物与所述第二消化产物进行混合后，再进行PCR反应，得到重叠整合的PCR产物；

以重叠整合的PCR产物作为模板，以甲酸脱氢酶基因上游引物和苏氨酸脱氨酶基因下游引物作为引物组进行PCR反应，得到连接基因片段。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述甲酸脱氢酶基因上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；所述苏氨酸脱氨酶基因下游引物的核苷酸序列如序列表SEQID NO:8所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述构建方法得到的重组菌。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述重组菌在制备L-2-氨基丁酸中的应用。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述应用包括以下步骤：

以L-苏氨酸作为底物，将L-苏氨酸、甲酸铵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸吡哆醛与所述重组菌进行混合反应，得到所述L-2-氨基丁酸。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例提供了一种用于制备L-2-氨基丁酸的重组菌，可以实现在同一个载体上同时高效表达苏氨酸脱氨酶、氨基酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶；将该重组菌用于转化L-苏氨酸来制备L-2-氨基丁酸，具有转化率高、制备成本低且操作简便等优点。

附图说明

图1为pACYC-DuetB质粒的图谱。

图2为本发明实施例1以及对比例1~2提供的重组菌的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中，B1为实施例1得到的重组菌；A1为对比例1得到的重组菌；A2为对比例2得到的重组菌。

图3为本发明实施例1以及对比例1~2提供的重组菌在共表达反应中不同时间的转化率对比图；其中，B1为实施例1得到的重组菌；A1为对比例1得到的重组菌；A2为对比例2得到的重组菌。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。

实施例1

该实施例提供了一种用于制备L-2-氨基丁酸的重组菌，该重组菌是通过将苏氨酸脱氨酶基因、氨基酸脱氢酶基因以及甲酸脱氢酶基因转化至宿主菌中得到的；所述苏氨酸脱氨酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述氨基酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，重组菌的基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO:9所示。

具体的，上述重组菌的构建方法包括以下步骤：

（1）选用pACYC-Duet-B质粒作为表达载体，备用；其中，pACYC-Duet-B质粒的图谱如附图1所示，pACYC-Duet-B质粒上有两个多克隆位点（MCS1和MCS2）。

（2）对上述氨基酸脱氢酶基因进行双酶切，酶切位点选择为pACYC-DuetB质粒第一个多克隆位点处的NcoI和BamHI两个酶切位点，并将双酶切后的氨基酸脱氢酶基因通过多基因片段快速拼接克隆试剂盒（Easy Assembly Cloning Kit，EAC）（北京唯尚立德生物科技有限公司的市售产品）连接到表达载体的两个酶切位点之间，转化得到转化子，备用。

（3）通过如序列表SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列（Link序列）将所述苏氨酸脱氨酶基因和所述甲酸脱氢酶基因进行连接，得到连接基因片段；该步骤具体包括以下步骤：

3.1、取上述苏氨酸脱氨酶基因的PCR产物与混合酶进行混合，以消化所述苏氨酸脱氨酶基因的PCR产物中的模板和引物，得到第一消化产物；其中，混合酶为PCR产物清除试剂ExoSAP-IT与甲基化模板消化酶Dpn I以4:1的体积比进行混匀的混合物；苏氨酸脱氨酶基因的PCR产物可以通过以苏氨酸脱氨酶大肠杆菌基因组内自带的酶为模板，以苏氨酸脱氨酶基因上游引物和苏氨酸脱氨酶基因下游引物为引物组进行PCR扩增反应得到的；苏氨酸脱氨酶基因上游引物和苏氨酸脱氨酶基因下游引物的核苷酸序列分别序列表SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示。

3.2、取上述甲酸脱氢酶基因的PCR产物与混合酶进行混合，以消化所述甲酸脱氢酶基因的PCR产物中的模板和引物，得到第二消化产物；甲酸脱氢酶基因的PCR产物可以通过以现有甲酸脱氢酶酶库中选择的甲酸脱氢酶为模板，以甲酸脱氢酶基因上游引物和甲酸脱氢酶基因下游引物为引物组进行PCR扩增反应得到的；甲酸脱氢酶基因上游引物和甲酸脱氢酶基因下游引物的核苷酸序列分别序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

3.3、将上述第一消化产物与所述第二消化产物按等体积比进行混合作为模板，并进行PCR反应，得到重叠整合的PCR产物；其中，该PCR反应的反应体系包括：5x Trans StartFastPfu Fly Buffer（全式金市售产品）5μL、Trans Start FastPfu Fly DNA Polymerase（全式金市售产品）0.5μL、2.5mM dNTPs（全式金市售产品）2μL、模板15μL、无菌水2.5μL。具体的PCR设置程序如下：98℃预变性2min；98℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸60s，共10个循环；72℃反应3min。

3.4、以上述重叠整合的PCR产物作为模板，以上述甲酸脱氢酶基因上游引物和上述苏氨酸脱氨酶基因下游引物作为引物组进行PCR反应，得到连接基因片段，使得甲酸脱氢酶基因和苏氨酸脱氨酶基因拼接构成一个整体。具体的，该步骤的PCR体系（50μL）如下：5xTrans Start FastPfu Fly Buffer（全式金市售产品）5μL、Trans Start FastPfu Fly DNAPolymerase （全式金市售产品）0.5μL、2.5mM dNTPs（全式金市售产品）2μL、甲酸脱氢酶基因上游引物1μL、苏氨酸脱氨酶基因下游引物1μL、上述重叠整合的PCR产物25μL、无菌水15.5μL；PCR反应程序设置如下：98℃预变性2min；98℃变性30s；56℃退火30 s；72℃延伸60s，共23个循环；最后72℃反应3min。

3.5、对上述得到的转化子进行双酶切；其中，双酶切该转化子时，需要在载体pACYC-Duet-B的第二个多克隆位点处选两个酶切位点，其应避开第一个多克隆位点处的两个酶切位点（NcoI和BamHI）。

3.6、将双酶切后的转化子与所述连接基因片段进行EAC连接，得到连接产物；其中，该步骤的连接体系（10μL）如下：EAC酶 5μL、连接基因片段（60ng/μL）1uL、双酶切后的转化子（20ng/μL）1μL、无菌水补齐3μL。连接条件为：50℃，连接1h。

3.7、将上述连接产物转入宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）中，并经筛选，得到所述重组菌。其中，可采用高转化效率的电转化进行连接产物的转入，具体的包括以下步骤：

a)在-80℃下取出电感受态细胞BL21，立即置于冰上解冻。同时将无菌的电转杯及连接产物置于冰上预冷。

b)待解冻完毕后，在超净台内取40μl感受态细胞加到预冷的电转杯杯底中，加入2μl上述连接产物，混合均匀，以上操作全程在冰上进行。

c) 连接产物与感受态均匀混合后，电转仪电击转化。电击后立即加入1mL培养基，同时将菌体转移至无菌的透析管中于37℃摇床，250rpm培养1h，得到培养物。

d) 将上培养物低速离心（5000g离心力离心1min）后，将菌液重悬后均匀涂布于含氯霉素抗性（Cam+）（80μg/mL）的固体LB平板上，并置于37℃恒温培养箱过夜培养9h。

e) 在平板中挑取阳性单克隆菌落，转移到氯霉素抗性的液体LB培养基中，置于37℃条件下进行培养7h后，经离心处理，得到所述重组菌（记为B1）。

实施例2

该实施例提供了一种利用上述实施例1得到的重组菌来制备L-2-氨基丁酸的方法，其包括以下步骤：

先在反应瓶中依次加入L-苏氨酸、甲酸铵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）及磷酸吡哆醛（PLP），并添加水作为溶剂；其中，L-苏氨酸的终浓度为20g/L，甲酸铵的终浓度为16g/L，NAD的终浓度为0.5g/L，PLP的终浓度为0.1mM；接着，用氨水将溶液的pH值调至8.0后，再加入上述实施例1得到的重组菌（以湿菌体的形成存在，其终浓度为12g/L），然后，置于40℃、400rpm的条件下进行磁力搅拌24h，即可得到L-2-氨基丁酸产物。

对比例1

该对比例提供了一种现有共表达氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶重组菌（记为A1），其构建方法包括以下步骤：

（1）酶切甲酸脱氢酶，使用NcoI和BamHI两个酶切位点，双酶切后的甲酸脱氢酶基因片段通过EAC连接pACYC-Duet-B载体转化得到转化子。

（2）甲酸脱氢酶基因转入pACYC-Duet-B载体的第一个多克隆位点处。该甲酸脱氢酶基因与实施例1的相同。

（3）将含有甲酸脱氢酶基因质粒进行抽质粒双酶切，双酶切该质粒此步骤酶切位点的选择应避开第一个多克隆位点处的两个酶切位点（NcoRI和BamHI），在载体pACYC-Duet-B的第二个多克隆位点处选两个酶切位点。

（4）通过氨基酸脱氢酶基因上、下游引物，PCR扩增出氨基酸脱氢酶基因。其中，氨基酸脱氢酶基因上游引物为：5’-TTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGACCCTGGAAATCTTCGAATACC-3’；氨基酸脱氢酶基因下游引物为：5’-GCGCGCCGAGCTCGAATTCGGATCCTCATTAGCGGCGGCTGATGATGTCG-3’；该氨基酸脱氢酶基因与实施例1的相同。

（5）将双酶切后的质粒与扩增出的氨基酸脱氢酶基因进行EAC连接，得到连接产物。

（6）将所述连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组菌A1。

对比例2

该对比例提供了另一种现有共表达氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶重组菌（记为A2），其构建方法包括以下步骤：

（1）酶切氨基酸脱氢酶，使用NcoI和BamHI两个酶切位点，双酶切后的氨基酸脱氢酶基因片段通过EAC连接pACYC-Duet-B载体，转化得到转化子。

（2）氨基酸脱氢酶基因转入pACYC-Duet-B载体的第一个多克隆位点处。该氨基酸脱氢酶基因与实施例1的相同。

（3）将含有氨基酸脱氢酶基因质粒进行抽质粒双酶切，双酶切该质粒此步骤酶切位点的选择应避开第一个多克隆位点处的两个酶切位点（NcoRI和BamHI），在载体pACYC-Duet-B的第二个多克隆位点处选两个酶切位点。

（4）通过甲酸脱氢酶基因上、下游引物，PCR扩增出甲酸脱氢酶基因。其中，甲酸脱氢酶基因上游引物为：5’-TTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGAAGGTGCTGGCAATCCTGTACA-3’；甲酸脱氢酶基因下游引物为：5’-TATTCCTTAAATTCGTATGTTCAGTGTCGTGCGCGGATTATTAACGCTGACCGTATGC-3’。该甲酸脱氢酶基因与实施例1的相同。

（5）将双酶切后的质粒与扩增出的甲酸脱氢酶基因进行EAC连接，得到连接产物。

（6）将所述连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组菌A2。

将实施例1、对比例1~2提供的重组菌分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，其检测结果如附图2，其显示本发明实施例提供的重组菌（B1）在上清中出现高表达。

图2中的上清是指重组菌经诱导培养超声破碎离心后取得的上清样品即蛋白由原先在包涵体内，经超声破碎后溶解在缓冲液中；沉淀是指相对于上清样品而言同样经超声破碎后蛋白未溶解在缓冲液内，依然存在于包涵体内。图2 SDS-PAGE说明A1和A2共表达重组菌能在上清表达，但相比较于B1在上清中的表达量略低于后者。构建的三种菌共表达的重组菌B1能够在上清中同时高效表达，相比较在沉淀中的表达量存在显著差别，目的蛋白已溶于缓冲液中。

另外，按照实施例2提供的方法，使用对比例1~2提供的重组菌来制备L-2-氨基丁酸，在相同的反应体系下，A1、A2、B1三种重组菌对应的不同时间的底物转化率情况如附图3所示；从图3中可以知道，本发明实施例提供的重组菌（B1）在相同的反应体系中，其转化率在1h时已显著高于共表达重组菌A1和共表达重组菌A2。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

序列表

<110> 宁波酶赛生物工程有限公司

<120> 一种用于制备L-2-氨基丁酸的重组菌及其构建方法和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1548

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcagaca gccagcctct gagcggtgca cctgagggtg cagagtacct gcgtgcagtg 60

ctgcgtgcac ctgtgtacga ggcagcacag gtgacccctc tgcagaagat ggagaagctg 120

agcagccgtc tggacaacgt gatcctggtg aagcgtgagg accgtcagcc tgtgcacagc 180

ttcaagctgc gtggtgcata cgcaatgatg gcaggtctga ccgaggagca gaaggcacac 240

ggtgtgatca ccgcaagcgc aggtaaccac gcacagggtg tggcattcag cagcgcacgt 300

ctgggtgtga aggcactgat cgtgatgcct accgcaaccg cagacatcaa ggtggacgca 360

gtgcgtggtt tcggtggtga ggtgctgctg cacggtgcaa acttcgacga ggcaaaggca 420

aaggcaatcg agctgagcca gcagcagggt ttcacctggg tgcctccttt cgaccaccct 480

atggttattg caggtcaggg taccctggca ctggagctgc tgcagcagga cgcacacctg 540

gaccgtgtgt tcgtgcctgt gggtggtggt ggtctggcag caggtgtggc agtgctgatc 600

aagcagctga tgcctcagat caaggttatt gcagtggagg cagaggacag cgcatgcctg 660

aaggcagcac tggacgcagg tcaccctgtg gacctgcctc gtgtgggtct gttcgcagag 720

ggtgtggcag ttaagcgtat cggtgacgag accttccgtc tgtgccagga gtacctggac 780

gacatcatca ccgtggacag cgacgcaatc tgcgcagcaa tgaaggacct gttcgaggac 840

gtgcgtgcag tggcagagcc tagcggtgca ctggcactgg caggtatgaa gaagtacatc 900

gcactgcaca acatccgtgg tgagcgtctg gcacacatcc tgagcggtgc caacgtgaac 960

ttccacggtc tgcgttacgt gagcgagcgt tgcgagctgg gtgagcagcg tgaggcactg 1020

ctggcagtga ccatccctga ggagaagggt agcttcctga agttctgcca gctgctgggt 1080

ggtcgtagcg tgaccgagtt caactaccgt ttcgcagacg caaagaacgc atgcatcttc 1140

gtgggtgtgc gtctgagccg tggtctggag gagcgtaagg agatcctgca gatgctgaac 1200

gacggtggtt acagcgtggt ggacctgagc gacgacgaga tggcaaagct gcacgtgcgt 1260

tacatggtgg gtggtcgtcc tagccaccct ctgcaggagc gtctgtacag cttcgagttc 1320

cctgagagcc ctggtgcact gctgcgtttc ctgaacaccc tgggtaccta ctggaacatc 1380

agcctgttcc actaccgtag ccacggtacc gactacggtc gtgtgctggc agcattcgag 1440

ctgggtgacc acgagcctga cttcgagacc cgtctgaacg agctgggtta cgactgccac 1500

gacgagacca acaaccctgc attccgtttc ttcctggcag gttaataa 1548

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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caagacaaag aaagcggcct gaaagcgatt atcgcaattc atgataccac gctgggtccg 120

gcactgggcg gtacccgtat gtggacgtat gattccgaag aagcggcaat cgaagacgct 180

ctgcgtctgg caaaaggcat gacctacaaa aacgcagctg cgggtctgaa tctgggcggt 240

gccaaaacgg tgattatcgg cgatccgcgt aaagacaaaa gcgaagccat gtttcgtgca 300

ctgggtcgct atattcaggg cctgaacggt cgctacatca ccgcggaaga tgtgggcacc 360

acggttgatg acatggatat tatccatgaa gaaaccgact ttgttacggg tattagtccg 420

tccttcggca gctctggtaa tccgagtccg gttaccgcct atggcgtcta ccgtggtatg 480

aaagccgcag ctaaagaagc gtttggcacc gataacctgg agggtaaagt gattgcagtt 540

cagggcgtcg gtaatgtggc ttatcacctg tgcaaacatc tgcacgcgga aggtgccaaa 600

ctgattgtga ccgatatcaa caaagaagct gtccaacgcg cggtggaaga attcggcgca 660

agcgctgtcg aaccgaatga aatttatggt gtggaatgcg atatctacgc accgtgtgct 720

ctgggcgcga ccgtgaacga cgaaacgatt ccgcagctga aagcgaaagt tatcgccggt 780

tctgcaaaca atcaactgaa agaagatcgt catggcgaca ttatccacga aatgggtatt 840

gtgtatgctc cggattacgt tattaacgcg ggcggtgtta tcaatgtcgc cgacgaactg 900

tatggctaca atcgtgaacg cgccctgaaa cgtgttgaat caatttatga taccatcgca 960

aaagtcattg aaatctcgaa acgcgatggt attgcaacgt acgttgcagc agaccgtctg 1020

gcagaagaac gcatcgcatc cctgaaaaac tcccgttcca cctacctgcg taatggtcac 1080

gacatcatca gccgccgcta atga 1104

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctgctgggta ccattgaaaa ccagctgggt atccgtcagt ggctggaaag tgaaggtcat 120

gaactgatcg tgagcgacag taaggagggc ccggatagtg attttcagaa gcatatcgtg 180

gacgcagagg tgctgattac caccccgttt catccgggct atctgacccg tgatctgatt 240

gataaggcaa agaacctgaa gatttgtatc accgcaggtg tgggtagcga tcatattgat 300

ctgaacgccg cagtggagcg taaaattcag gttctggagg tgagcggtag caatgtggtg 360

agcgtggcag aacatgttat gatgagcatc ctgctgctgg tgcgtaattt cgttccggcc 420

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ctggaaggta aagtggtggg taccattggt gcaggccgta ttggttatcg cgtgctgcag 540

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ctgggtggcg gtaatggcat ggtgcctcat tatagcggca ccaccctgga tgcacaggca 960

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taa 1083

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<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgcgccgag ctcgaattcg gatccctaac ccgccaaaaa gaacctgaac 50

<210> 9

<211> 2668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaaggtgc tggcaatcct gtacaagggt ggtgacgcag caacccagga accgagactg 60

ctgggtacca ttgaaaacca gctgggtatc cgtcagtggc tggaaagtga aggtcatgaa 120

ctgatcgtga gcgacagtaa ggagggcccg gatagtgatt ttcagaagca tatcgtggac 180

gcagaggtgc tgattaccac cccgtttcat ccgggctatc tgacccgtga tctgattgat 240

aaggcaaaga acctgaagat ttgtatcacc gcaggtgtgg gtagcgatca tattgatctg 300

aacgccgcag tggagcgtaa aattcaggtt ctggaggtga gcggtagcaa tgtggtgagc 360

gtggcagaac atgttatgat gagcatcctg ctgctggtgc gtaatttcgt tccggcccat 420

gaaatgatcg agcgcggcga ttggcaggtt agtgatattg cccgtaacgc cttcgacctg 480

gaaggtaaag tggtgggtac cattggtgca ggccgtattg gttatcgcgt gctgcagcgc 540

ctggtgcctt ttgattgtaa agagctgctg tactacgact acgcgccgct gcctgaacat 600

gcagcaaaag ccgttaacgc acgtcgtgtt gaagacctga aggaattcgt gagccagtgc 660

gatgttgtga ccgttaatgc cccgctgcat gaaggtaccc gcggtttagt taacgccgaa 720

ctgctgaaac acttcaagaa gggtgcctgg ctggtgaata ccgcacgtgg tgctatttgt 780

gacaaggatg ccgtggccga agccctgaaa agcggtcaac tggcaggtta tgcaggcgat 840

gtgtggaatg tgcagccggc tcctaaagat catgtgtggc gtaccatgaa gaacccgctg 900

ggtggcggta atggcatggt gcctcattat agcggcacca ccctggatgc acaggcaaga 960

tatgccgccg gtacccgtgc aattctggaa aattacctga agaaccagcc tcaggagccg 1020

cagaatgtga ttgtgggcat tggtaaatac gagaccaagg catacggtca gcgttaataa 1080

tccgcgcacg acactgaaca tacgaattta aggaataaag ataatggctg actcgcaacc 1140

cctgtccggt gctccggaag gtgccgaata tttaagagca gtgctgcgcg cgccggttta 1200

cgaggcggcg caggttacgc cgctacaaaa aatggaaaaa ctgtcgtcgc gtcttgataa 1260

cgtcattctg gtgaagcgcg aagatcgcca gccagtgcac agctttaagc tgcgcggcgc 1320

atacgccatg atggcgggcc tgacggaaga acagaaagcg cacggcgtga tcactgcttc 1380

tgcgggtaac cacgcgcagg gcgtcgcgtt ttcttctgcg cggttaggcg tgaaggccct 1440

gatcgttatg ccaaccgcca ccgccgacat caaagtcgac gcggtgcgcg gcttcggcgg 1500

cgaagtgctg ctccacggcg cgaactttga tgaagcgaaa gccaaagcga tcgaactgtc 1560

acagcagcag gggttcacct gggtgccgcc gttcgaccat ccgatggtga ttgccgggca 1620

aggcacgctg gcgctggaac tgctccagca ggacgcccat ctcgaccgcg tatttgtgcc 1680

agtcggcggc ggcggtctgg ctgctggcgt ggcggtgctg atcaaacaac tgatgccgca 1740

aatcaaagtg atcgccgtag aagcggaaga ctccgcctgc ctgaaagcag cgctggatgc 1800

gggtcatccg gttgatctgc cgcgcgtagg gctatttgct gaaggcgtag cggtaaaacg 1860

catcggtgac gaaaccttcc gtttatgcca ggagtatctc gacgacatca tcaccgtcga 1920

tagcgatgcg atctgtgcgg cgatgaagga tttattcgaa gatgtgcgcg cggtggcgga 1980

accctctggc gcgctggcgc tggcgggaat gaaaaaatat atcgccctgc acaacattcg 2040

cggcgaacgg ctggcgcata ttctttccgg tgccaacgtg aacttccacg gcctgcgcta 2100

cgtctcagaa cgctgcgaac tgggcgaaca gcgtgaagcg ttgttggcgg tgaccattcc 2160

ggaagaaaaa ggcagcttcc tcaaattctg ccaactgctt ggcgggcgtt cggtcaccga 2220

gttcaactac cgttttgccg atgccaaaaa cgcctgcatc tttgtcggtg tgcgcctgag 2280

ccgcggcctc gaagagcgca aagaaatttt gcagatgctc aacgacggcg gctacagcgt 2340

ggttgatctc tccgacgacg aaatggcgaa gctacacgtg cgctatatgg tcggcggacg 2400

tccatcgcat ccgttgcagg aacgcctcta cagcttcgaa ttcccggaat caccgggcgc 2460

gctgctgcgc ttcctcaaca cgctgggtac gtactggaac atttctttgt tccactatcg 2520

cagccatggc accgactacg ggcgcgtact ggcggcgttc gaacttggcg accatgaacc 2580

ggatttcgaa acccggctga atgagctggg ctacgattgc cacgacgaaa ccaataaccc 2640

ggcgttcagg ttctttttgg cgggttag 2668

Claims (6)

1. 一种用于制备L-2-氨基丁酸的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是通过将苏氨酸脱氨酶基因、氨基酸脱氢酶基因以及甲酸脱氢酶基因转化至宿主菌中得到的；所述苏氨酸脱氨酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述氨基酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；

所述重组菌的构建方法包括以下步骤：

对所述氨基酸脱氢酶基因进行双酶切，并将双酶切后的氨基酸脱氨酶基因连接到表达载体的两个酶切位点之间，转化得到转化子；

通过如序列表SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列将所述苏氨酸脱氨酶基因和所述甲酸脱氢酶基因进行连接，得到连接基因片段；

对所述转化子进行双酶切，并将双酶切后的转化子与所述连接基因片段进行连接，得到连接产物；

将所述连接产物转入宿主菌中，得到所述重组；

所述表达载体为pACYC-Duet-B质粒；所述表达载体的两个酶切位点分别为NcoI酶切位点和BamHI酶切位点；所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的一种用于制备L-2-氨基丁酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，通过如序列表SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列将所述苏氨酸脱氨酶基因和所述甲酸脱氢酶基因进行连接，得到连接基因片段的步骤，具体包括：

取所述苏氨酸脱氨酶基因的PCR产物，并消化所述苏氨酸脱氨酶基因的PCR产物中的模板和引物，得到第一消化产物；

取所述甲酸脱氢酶基因的PCR产物，并消化所述甲酸脱氢酶基因的PCR产物中的模板和引物，得到第二消化产物；

将所述第一消化产物与所述第二消化产物进行混合后，再进行PCR反应，得到重叠整合的PCR产物；

以重叠整合的PCR产物作为模板，以甲酸脱氢酶基因上游引物和苏氨酸脱氨酶基因下游引物作为引物组进行PCR反应，得到连接基因片段。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述甲酸脱氢酶基因上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；所述苏氨酸脱氨酶基因下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示。

5.一种如权利要求1~4中任一项所述重组菌在制备L-2-氨基丁酸中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

以L-苏氨酸作为底物，将L-苏氨酸、甲酸铵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸吡哆醛与所述重组菌进行混合反应，得到所述L-2-氨基丁酸。

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