CN118291436A

CN118291436A - 一种n-乙酰氨基酸消旋酶突变体及应用

Info

Publication number: CN118291436A
Application number: CN202410457159.XA
Authority: CN
Inventors: 张怀; 吕乐; 张晋科; 罗晖
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Filing date: 2024-04-16
Publication date: 2024-07-05

Abstract

本发明提供一种N‑乙酰氨基酸消旋酶的突变体，其通过定点突变改造获得，具有较高的酶活力，与原始N‑乙酰氨基酸消旋酶相比对N‑乙酰‑L‑色氨酸的消旋活力可以提高54％；将该N‑乙酰氨基酸消旋酶的突变体应用于制备D‑色氨酸具有更高的效率。

Description

一种N-乙酰氨基酸消旋酶突变体及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种N-乙酰氨基酸消旋酶突变体及应用。

背景技术

N-乙酰氨基酸消旋酶(N-acyl amino acid racemase,NAAAR)催化各种N-乙酰氨基酸的消旋反应，可与立体选择性L-或D-氨基酰化酶同时反应以N-乙酰氨基酸为原料动态动力学拆分生产L-或D-α-氨基酸，在N-乙酰氨基酸消旋酶的消旋作用下，理论反应产率可达到100％。D-色氨酸是一种重要的手性氨基酸，在食品、农业、生物医药等方面有着重要的应用价值，可以作为非营养性甜味剂、饲料添加剂和植物生长剂，在医药行业中，D-色氨酸主要被作为一些药物(如他达拉非)的合成前体。N-乙酰-L-色氨酸在N-乙酰氨基酸消旋酶的作用下形成N-乙酰-D-色氨酸，N-乙酰-D-色氨酸在D-氨基酰化酶的作用下即可生成D-色氨酸，然而该方法制备D-色氨酸的缺点在于N-乙酰氨基酸消旋酶对于N-乙酰-L-色氨酸的消旋催化活力较低。

发明内容

本发明的目的在于针对现有N-乙酰氨基酸消旋酶的不足提供一种N-乙酰氨基酸消旋酶突变体，该突变体能够提高N-乙酰氨基酸消旋酶对于N-乙酰-L-色氨酸的消旋活性，进一步与D-氨基酰化酶联用用于D-色氨酸制备，N-乙酰氨基酸消旋酶催化活性的增强可提高制备D-色氨酸的反应效率，降低D-色氨酸的生产成本。

为此，本发明第一方面提供了一种影响N-乙酰氨基酸消旋酶的酶活力的氨基酸突变子，其为位于原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第21位苏氨酸突变为丙氨酸的突变或第21位苏氨酸突变为丝氨酸的突变。

本发明第二方面提供了一种N-乙酰氨基酸消旋酶的突变体，其序列包含位于原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第21位苏氨酸突变为丙氨酸的突变(本发明中简称为突变子T21A)或第21位苏氨酸突变为丝氨酸的突变(本发明中简称为突变子T21S)。

在本发明的一些具体实施例中，本发明还提供了影响N-乙酰氨基酸消旋酶的酶活力的核苷酸突变子，其包括位于编码原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第61位A突变为G、第63位C突变为A的突变，或者位于编码原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第61位A突变为T的突变。

在本发明的一些实施例中，所述突变体为1号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体，其序列包含位于原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第21位苏氨酸突变为丙氨酸的突变，本发明中也称为N-乙酰氨基酸消旋酶突变体T21A。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述1号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体的序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施例中，所述突变体为2号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体，其序列包含位于原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第21位苏氨酸突变为丝氨酸的突变，本发明中也称为N-乙酰氨基酸消旋酶突变体T21S。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述2号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明第三方面提供了编码本发明第二方面所述的突变体的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第61位A突变为G、第63位C突变为A的突变或第61位A突变为T的突变。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码1号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第61位A突变为G、第63位C突变为A的突变。

在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码2号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第61位A突变为T的突变。

本发明第四方面提供了一种含有本发明第三面所述核苷酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

本发明第五方面提供了如本发明第二方面所述的突变体或由本发明第三方面所述的核苷酸分子编码的突变体或如本发明第四方面所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体在催化制备D-色氨酸中的应用，其可以理解为利用如本发明第二方面所述的突变体或由本发明第三方面所述的核苷酸分子编码的突变体或如本发明第四方面所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体催化制备D-色氨酸的方法。

根据本发明，所述应用包括催化制备D-色氨酸、提高催化制备D-色氨酸的产量和提高制备D-色氨酸的效率。

本发明中所述用语“核苷酸突变子”是指基因的核苷酸系列中可发生突变的最小单位。

本发明中所述用语“氨基酸突变子”是指蛋白质的氨基酸序列中可发生突变的最小单位。

本发明中所述用语“蛋白”与“蛋白质”可以互相使用。

为解决现有方法制备D-色氨酸时N-乙酰氨基酸消旋酶对于N-乙酰-L-色氨酸的消旋催化活力较低的难题，本发明人对于N-乙酰氨基酸消旋酶的突变进行了大量的研究。本发明人经过长期大量的研究，筛选并发现将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N-乙酰氨基酸消旋酶的第21位苏氨酸突变为丙氨酸或丝氨酸，能够显著提高N-乙酰氨基酸消旋酶对于N-乙酰-L-色氨酸的消旋活性；进一步与D-氨基酰化酶联用用于D-色氨酸制备，N-乙酰氨基酸消旋酶催化活性的增强可提高制备D-色氨酸的反应效率，降低D-色氨酸的生产成本。

研究结果表明，本发明所提供的N-乙酰氨基酸消旋酶突变体蛋白具有较高的酶活力，其中T21A突变体酶活力比原始N-乙酰氨基酸消旋酶对于N-乙酰-L-色氨酸的消旋活性提高了54％，提高了单位催化剂的生产能力；将该N-乙酰氨基酸消旋酶突变体应用于催化D-色氨酸制备具有更高的效率。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1示出N-乙酰氨基酸消旋酶第21位点不同突变体酶活对比结果；其中，NAAAR为未突变N-乙酰氨基酸消旋酶。

图2示出T21A突变体与未突变N-乙酰氨基酸消旋酶制备D-色氨酸反应对比结果；其中，NAAAR为未突变N-乙酰氨基酸消旋酶。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

实施例

以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明均可由商业渠道获得。

实施例1

1)N-乙酰氨基酸消旋酶的点突变

以含Amycolatopsis sp.来源的N-乙酰氨基酸消旋酶(PDB登录号：5FJR；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的基因(如SEQ ID NO.4所示)的pET-28a(+)重组质粒(SEQ ID NO.4位于pET-28a序列SEQ ID NO.5与pET-28a序列SEQ ID NO.6之间)作为模板，点突变PCR以引物20R(ACGGAACGGCGCAACCAG)为正向引物，分别以引物21S(TCCAGCTTTGGCACCGCGAGC)、21A(GCAAGCTTTGGCACCGCGAGC)、21G(GGTAGCTTTGGCACCGCGAGC)为反向引物进行全质粒扩增，对N-乙酰氨基酸消旋酶第21位点Thr进行定点突变，分别突变为Ser、Ala、Gly。

PCR扩增体系：模板1μL，正反向引物各1μL，ddH₂O 7μL，2×Phanta Max MasterMix聚合酶10μL，总反应体系20μL。PCR反应条件：95℃预变性，3min；95℃变性，15s，56℃退火，30s，72℃延伸，6min，16个循环；72℃充分延伸，10min，16℃保存。

PCR产物经过凝胶电泳检验，然后对PCR产物进行KLD连接反应，室温放置2h，KLD连接体系：1μL的PCR产物，ddH2O 6μL，5X KLD buffer 2μL(10×CuterSmart buffer1μL、10mMATP 1μL)，KLD Mix 1μL(T4 DNA连接酶0.45μL、T4多聚核苷酸激酶0.4μL、Dpn I 0.15μL)。

将上述KLD连接的PCR产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(上海生工生物工程有限公司)，涂布50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养16h，从平板挑取单菌落进行菌落PCR鉴定及测序验证，获得N-乙酰氨基酸消旋酶突变体T21A、T21S、T21G。

2)N-乙酰氨基酸消旋酶突变体酶活比较

将突变原始质粒，含突变体T21A、T21S、T21G质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)(上海生工生物工程有限公司)，挑取单克隆菌落接种到含有卡那霉素(50μg/mL)的3mL LB培养液中,37℃200rpm培养16小时，然后以1％接种比例接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的50mL乳糖诱导培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％甘油，0.05％葡萄糖，0.2％α-乳糖，25mMNa₂HPO₄，25mM KH₂PO₄，50mM NH₄Cl，5mM Na₂SO₄，2mM Mg₂SO₄)中诱导表达，28℃200rpm培养24小时后离心收集菌体，水洗菌体2次后重悬，并调整菌悬液菌体浓度OD600为50OD，取少量50OD菌液稀释至20OD，对浓度为20OD菌液进行超声波破碎，离心取超声上清液，其他浓度OD600为50OD菌液-70℃冻存。

配制N-乙酰氨基酸消旋酶反应液1：25mM N-乙酰-L-色氨酸，50mM Tris-HCl缓冲(pH 8.0)，1mM氯化钴。

HPLC检测条件1：Poroshell 120Chiral-T 2.7μm 4.6×150mm手性色谱柱；1mMNaH₂PO₄-H₃PO₄，50％甲醇(pH3.0)流动相；28℃柱温；280nm检测波长；流速0.4mL/min；10μL进样量。

分别取1mL酶反应液1，加入上述超声上清液50μL，37℃反应15min后取样加入100μL 2M HCl中终止反应，12000rpm离心2min后取上清，适当稀释后HPLC检测条件1检测N-乙酰-D-色氨酸含量。

以未突变N-乙酰氨基酸消旋酶对底物N-乙酰-L-色氨酸的相对酶活定义为100％，N-乙酰氨基酸消旋酶第21位点点突变对N-乙酰-L-色氨酸消旋速度比较结果如图1所示，结果显示，将N-乙酰氨基酸消旋酶21位氨基酸苏氨酸突变为丝氨酸酶活提高25％(T21S),21位氨基酸苏氨酸突变为丙氨酸(T21A)酶活提高54％，而将21位氨基酸苏氨酸突变为甘氨酸(T21G)酶活大幅度降低，仅为未突变酶活32％，21位点与N-乙酰氨基酸消旋酶底物结合空间相关，从苏氨酸突变为丝氨酸、丙氨酸，侧链变小，消旋酶可提高对N-乙酰-L-色氨酸的催化活性，表明消旋酶21位点氨基酸残基侧链变小导致底物结合位点空间变大对提高对N-乙酰-L-色氨酸的催化活性作用很大，但21位突变为无侧链的甘氨酸时酶活最低。

配制N-乙酰氨基酸消旋酶反应液2：25mM N-乙酰-L-苯丙氨酸，50mM Tris-HCl缓冲(pH 8.0)，1mM氯化钴。

HPLC检测条件2：Poroshell 120Chiral-T 2.7μm 4.6×150mm手性色谱柱；1mMNaH₂PO₄-H₃PO₄，50％甲醇(pH3.0)流动相；28℃柱温；205nm检测波长；流速0.4mL/min；10μL进样量。

分别取1mL酶反应液2，加入上述超声上清液50μL，37℃反应15min后取样加入100μL 2M HCl中终止反应，12000rpm离心2min后取上清，适当稀释后HPLC检测条件2检测产物N-乙酰-D-苯丙氨酸含量。

以未突变N-乙酰氨基酸消旋酶对底物N-乙酰-L-苯丙氨酸的相对酶活定义为100％，突变体T21A、T21S、T21G对底物N-乙酰-L-苯丙氨酸的酶活均大幅度降低。突变体T21A对底物N-乙酰-L-苯丙氨酸的酶活为未突变N-乙酰氨基酸消旋酶酶活的28.3％，突变体T21S对底物N-乙酰-L-苯丙氨酸的酶活为未突变N-乙酰氨基酸消旋酶酶活的15.4％，突变体T21G对底物N-乙酰-L-苯丙氨酸的酶活为未突变N-乙酰氨基酸消旋酶酶活的7.2％。

实施例2：

配置N-乙酰氨基酸消旋酶与D-氨基酰化酶双酶反应液：100mM N-乙酰-L-色氨酸，50mM Tris-HCl缓冲(pH 8.0)，1μM硫酸锌，1mM氯化钴。

取实施例1中OD600为50OD冻存菌液，室温放置解冻。

分别取上述双酶反应液4mL，加入160μL未突变N-乙酰氨基酸消旋酶或T21A突变体的解冻菌液，再分别加入40U D-氨基酰化酶，置于37℃200rpm反应，反应1小时与2小时取样100μL加入至900μL 0.1M HCl中终止反应，12000rpm离心2min后取上清，适当稀释后HPLC检测D-色氨酸含量。

HPLC检测条件：Inertsil C8-3 5μm 4.6×250mm色谱柱；1mM NaH₂PO₄-H₃PO₄，50％甲醇(pH3.0)流动相；28℃柱温；280nm检测波长；流速1mL/min；20μL进样量。

反应结果如图2所示，可以看出在与D-氨基酰化酶反应过程中，T21A比未突变NAAAR生成D-色氨酸速度更快，酶反应效率更高。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种影响N-乙酰氨基酸消旋酶的酶活力的氨基酸突变子，其为位于原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第21位苏氨酸突变为丙氨酸的突变或第21位苏氨酸突变为丝氨酸的突变。

2.一种N-乙酰氨基酸消旋酶的突变体，其序列包含位于原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第21位苏氨酸突变为丙氨酸的突变或第21位苏氨酸突变为丝氨酸的突变。

3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，

所述突变体为1号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体，其序列包含位于原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第21位苏氨酸突变为丙氨酸的突变；优选地，所述1号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体的序列如SEQ ID NO.2所示；

或者，所述突变体为2号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体，其序列包含位于原N-乙酰氨基酸消旋酶的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第21位苏氨酸突变为丝氨酸的突变；优选地，所述2号N-乙酰氨基酸消旋酶突变体的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种编码权利要求2或3所述的突变体的核苷酸分子。

5.一种含有权利要求4所述核苷酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

6.如权利要求2或3所述的突变体或如权利要求4所述的核苷酸分子编码的突变体或如权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体在催化制备D-色氨酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括催化制备D-色氨酸、提高催化制备D-色氨酸的产量和提高制备D-色氨酸的效率。