CN110257359A

CN110257359A - 一种改进的高活性耐热的肌酸水解酶及其应用

Info

Publication number: CN110257359A
Application number: CN201910551197.0A
Authority: CN
Inventors: 雷洁; 戴俊
Original assignee: Shaanxi Staimu Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Ackery Bioengineering Co.,Ltd.
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-06-24
Also published as: CN110257359B

Abstract

本发明构建了肌酸水解酶的突变体，实现了肌酸水解酶比活力和热稳定性的提高。突变体比野生型肌酸水解酶更适合应用于工业化。具有极好的市场应用前景和经济价值。

Description

一种改进的高活性耐热的肌酸水解酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种改进的高活性耐热的肌酸水解酶及其应用。

背景技术

肌酸水解酶(creatinase或creatine amidohydrolase，EC 3.5.3.3，简称CRE)能催化肌酸水解产生尿素和肌氨酸。目前在多种细菌中均发现肌酸水解酶的存在。肌酐是人体内磷酸肌酸代谢的终产物，它可以经过肾脏的过滤由血液进入尿液而排出体外。血清中肌酐含量的正常范围在35-150μM之间，但是在肾脏功能或肌肉功能出现问题时，肌酐的含量会上升到1000μM。因此血液和尿液的肌酐含量可反映肾脏的排泄功能。相对于化学检测法，酶法检测具有更多的优势。作为酶法检测肌酐含量的关键酶，肌酸水解酶在临床检测肾脏功能中起到非常重要的作用。

由于肌酸水解酶对肌酸的亲和性低，在临床诊断中需要大量的酶，并且昂贵的诱导物是酶生产中的一大障碍，解决这一问题有两条途径。第一、筛选组成性产生或超高产的突变菌株。第二、用分子生物学的方法克隆肌酸水解酶的基因，分析基因结构，构建高产菌株。许多细菌中编码肌酸水解酶的基因己被测序并在大肠杆菌中克隆和表达。高产的重组菌株可使提纯过程简化，并改善酶的性质。

Koyam等(Koyama et al.1990)把黄杆菌Flavobacterium sp.U-188菌株中的肌酸水解酶的基因克隆到Ecoli中，基因在lac启动子的控制下高效表达，酶的产量超过细胞中可溶蛋白的20％，他们的研究表明肌酸水解酶基因序列含有1134bp的开放阅读框，由基因序列推测出的肌酸水解酶的N一末端序列与黄杆菌中肌酸水解酶的N端巧个残基相一致。

Ming Chung Chang等(Ming Chung Chang et al.1992)采用了鉴定指示平板法把恶臭假单胞菌的肌酸水解酶基因克隆到E coli中并表达出重组酶。他们用肌酸水解酶鉴定指示平板法克服了基因克隆重组子筛选的繁琐，鉴定指示平板法是在含有肌酸的培养基中加入0.0l％的酚红，接种的平板在37℃培养24h，菌落直径至少达到2mm后，在菌落的附近接种上奇异变形菌(Proteus mirabilis)37℃培养24h，肌酸水解酶催化肌酸成肌氨酸和脉，奇异变形菌产生脉酶，催化脉产生氨，在培养基上呈现桃红色。因此，肌酸水解酶阳性菌在菌落周围产生桃红色圈。这种方法比从黄杆菌中亚克隆肌酸水解酶的基因，用测定酶活性的方法鉴定和作免疫测定的方法更简单迅速。

Ming Chuan Hong等(Ming Chuan Hong 1998)把嗜水气单胞菌(Aeromonas 匆drophila)的壳多糖酶信号肤基因序列与恶臭假单胞菌NTU-8菌株(Pseudomonas putidaNTU-8)的肌酸水解酶基因序列融合，使肌酸水解酶基因在Ecoli中表达，并把50％的融合酶蛋白送输到周质空间，在肌酸水解酶运出细胞质时，壳多糖酶信号肤己经被脱去，肌酸水解酶具有活性。恶臭假单胞菌NTU-8菌株肌酸水解酶基因的开放阅读框含有1209个碱基，多肤序列含有403个氨基酸残基，分子量为45.7kDa，该基因产物与恶臭假单胞菌NTU-8的肌酸水解酶(45kDa)很相似。

Y Nishiya等((Nishiya et al.1998)对节杆菌TE1826的肌配降解基因簇进行了研究，表明肌配水解酶、肌酸水解酶和肌氨酸氧化酶的基因构成一个基因簇。节杆菌TE1826的肌酸水解酶基因与恶臭假单胞菌DSM2106有63.1％的同源性，与黄杆菌U-188有63.1％的同源性，与枯草杆菌B-0618有77.6％的同源性。恶臭假单胞菌的肌酸水解酶的X一衍射研究表明活性中心在节杆菌和其它种中都是保守的。

基于目前的研究，我们发现肌酸水解酶的主要来源是微生物。在解决肌酐测定方法的问题时，发现某些微生物能利用肌酐作为主要的氮源和碳源进行生长。1937年首次发现肌酐可以被节杆菌(Arthrobacter)降解。随后发现另外一些属的菌株能够通过诱导产生肌酸水解酶并在细胞中累积。这些细菌有假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、副球菌属Paracoccus、大肠杆菌属等。目前，一些通过基因工程构建的工程菌株也可以表达产生重组CRE，例如来源于Flavobacteriumsp.U-188肌酸水解酶基因的重组酶等等。

发明人之前在CN104109658B公开过一种肌酸水解酶及其编码基因和应用，通过构建重组质粒pET20b-cre，转化入大肠杆菌E.coliBL21，得到高效表达肌酸水解酶的基因工程菌，应用该菌种可实现肌酸水解酶的生产，但是该酶在热稳定性以及酶活方面还有进一步改进的空间。

卢红波发现从Bacillus sp.BSD-8菌株中克隆肌酸水解酶，该酶的最适pH值为7.5,在pH5到8的范围处理24h后残余酶活力均在80％以上；酶的最适反应温度为37℃,在pH7.5的磷酸盐缓冲液中不同温度处理30min后,测定残余酶活力,结果发现重组酶在45℃以下稳定。但是该酶在热稳定性以及酶活方面同样还不适宜工业化生产的需求。

因此，本领域基于市场的需求，迫切需要一种高活性、高稳定性的肌酸水解酶酶。

发明内容

本发明基于现有技术的缺陷，提供了一个改进的肌酸水解酶。其氨基酸序列如SEQID NO：2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明所要解决的的另一个技术问题是提供提高肌酸水解酶的活性和热稳定性的制备方法，包括如下步骤:

1)在SEQ ID NO：1序列的基础上通过突变以及筛选，获得了突变序列；将突变序列连接载体质粒；

2)将突变质粒转化进宿主细胞；

本发明提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自：

(1)编码本发明所述多肽的多核苷酸；和

(2)与(1)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一具体实施例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO:2所示的多肽。

在一具体实施例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明提供一种载体，它含有本发明所述的多核苷酸。

本发明所述质粒载体为PUC系列，pET系列，或pGEX中的任——种。

所述的宿主细胞包括:细菌、酵母和真菌细胞，其也为本发明要求保护的范围。

所述的细菌为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。

本发明还提供了一种发酵生产重组肌酸水解酶的方法：从甘油管中按0.4％的接种量将所述的工程菌接入20mL/250mL三角瓶，回旋式摇床转速200rpm，培养温度为37℃，培养12h。发酵培养：将培养好的种子培养液按1％(v/v)的接种量接种至50mL/500mL三角瓶中进行培养，培养温度为37℃，摇床转速200rpm；待OD600＝0.6，加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导表达，培养10h。

通过上述方法制备的重组肌酸水解酶，E.coliBL21(pET20-cre)发酵液进行肌酸水解酶活性检测,采用比色法进行检测。

本发明构建了有意义的突变体，实现了肌酸水解酶比活力和热稳定性的提高。突变体比野生型肌酸水解酶更适合应用于工业化。

附图说明

图1为蛋白纯化图，泳道1为T-creatinase纯化图，泳道2为creatinase纯化图；

图2为酶的最适反应温度图

有益效果

具体实施方式

实施例1高活性突变序列的获得

以SEQ ID NO：1的序列(来自于专利CN104109658B)为基础，通过易错PCR建立突变文库，通过基因筛选以及酶表达后的热稳定性和酶活性筛选，获得了突变后的靶标蛋白SEQID NO：2T-creatinase和SEQ ID NO：3的优化基因。SEQ ID NO：1：creatinase核苷酸序列

SEQ ID NO：2T-creatinase氨基酸序列

SEQ ID NO：3 T-creatinase核苷酸序列

实施例2：突变肌酸水解酶基因的表达系统的构建

表达载体选择为pET20b(+)，根据载体选取上游酶切位点为NdeI，下游酶切位点为XhoI。将得到的含有SEQ ID NO：3的T-creatinase的克隆载体pMD19-T和表达载体pET20b(+)分别进行双酶切，于37℃酶切60min后，凝胶电泳验证并回收酶切产物。将回收得到的表达载体和目的基因进行连接，连接液转化入表达宿主E.coli-BL21，重组克隆子经PCR验证正确。

实施例3：重组大肠杆菌异源表达T-creatinase

甘油管：甘油浓度为20％；种子培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，pH7.0，100μg/mL氨苄霉素；发酵培养基组成为(g/L)：蛋白胨12，酵母膏24，甘油4，KH₂PO₄2.31，K₂HPO₄16.43，100μg/mL氨苄霉素。种子培养：从甘油管中按0.4％的接种量接入20mL/250mL三角瓶，回旋式摇床转速200rpm，培养温度为37℃，培养12h。发酵培养：将培养好的种子培养液按1％(v/v)的接种量接种至50mL/500mL三角瓶中进行培养，培养温度为37℃，摇床转速200rpm。待OD600＝0.6，加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导表达，培养10h，肌酸水解酶产量可达125.6U/mL，对照未突变的酶产量为34U/mL，这说明优化后的序列能够更好的在大肠杆菌中表达。

实施例4：重组肌酸酶的纯化制备

破碎重组大肠杆菌后进行硫酸铵沉淀，选择80％硫酸铵饱和度的沉淀。以少量磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解蛋白沉淀，过夜透析以除去酶液中的硫酸铵。根据肌酸水解酶的等电点性质，选择QFF柱进行离子交换纯化。QFF柱以磷酸盐缓冲液平衡30min，将粗酶液注入纯化柱中，以含有0.1MNaCl的磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白，从图1可以看出，纯化的蛋白纯度较高，其浓度达到200mg/mL。

实施例5酶活性验证

取200μl T-creatinase(200mg/mL)以及SEQ ID NO：1表达的creatinase(200mg/mL)分别加入800μl含600μmol/L浓度PBS缓冲液中，PBS为阴性对照组。37℃、50r/min培养24h，13000r/min离心2min，取上清液用生化分析仪检测肌酸浓度。每组设5个样本。采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，用单因素方差分析(one-way，ANOVA)，多重比较用最小显著法(LSD)，P<0.05为差异有统计学意义。结果发现，T-creatinase处理后的肌酸浓度为(32.5±1.20)μmol/L，与creatinase对照组比较(146.0±12.5)μmol/L]显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)；PBS组为(589.5±13.5)μmol/L，充分的证明突变的T-creatinase具有更好的肌酸分解能力，具有较好的应用前景。

实施例6、酶的最适反应温度实验

在pH7.5的磷酸盐缓冲液中在不同的温度处理30min，测定不同温度下肌酸水解酶的活力(见图2)，发现酶的最适反应温度,45摄氏度，并且在50摄氏度情形下，仍然保持了较大的活性。

从以上结果可以看出，本发明提供的酶无论是酶活还是酶的耐热性均得到了显著的提高，具有极好的应用价值和应用前景，并且表达量较高，也适宜工业化的生产。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 陕西斯戴木生物科技有限公司

<120> 一种改进的高活性耐热的肌酸水解酶及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1254

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

atgactaccg ccaacatcgc caccaatgtt tccgaactgg cccgactgaa gaccctgcac 60

aacggcgcca aggagcagct gaccttctcg gatgccgagt tcgagcgccg cctggccggc 120

ctgcgccaga tcatggccgc gaagtcgctg gacgcggtca tcctgaccag ctaccacggc 180

atcaagtact actcggactt cctgtacacc accttcggcc gcaactacgc gctggtggtc 240

accgccagca actccaccac cgtcaccgcg aacatcgatg ccggcatgcc atggcgcacc 300

agctacggcg acaacatcgt gtacaccgac tggaagcgcg acaacttctt ctacggcctg 360

caggaagcac ttaagcgcga cggcgtgaag gcaacccgga tcggcgtgga agacgacttc 420

ctgccgggcc gcacccgcca gcagatcgcc gacaccttcg acggcgcaac cctggtggat 480

gtctcgcagg acgccatgcg ccagcgcatg atcaagtccg ccgaggaaat cgaggtcatc 540

aagcacggtg cacgcatcgg cgacctgggc ggcgaagcca tcaaggcagc gatccgcgaa 600

ggcatcagcg aatacgaggt cgcactgatc ggcaccgagg ccatggtgca cgagatcgcc 660

aagaccttcc cacaccgcga agtgcgcgac acctgggtct ggttccagtc cggcatcaac 720

accgacggcg cccacaactg ggccaccacc cgcaagcttc agcgcggcga catcctgtcg 780

ctgaactgct tccccatgac ttccggctac tacaccgcac tggagcgcac cctgttcctg 840

ggcgagccgg atgcccgcag cctggaactg tggaacatca acgtcgaggt gcacaagcgc 900

ggcctggagc tgatcaagcc cggtgctgtc tgcaaggaca tcgccgccga gctgaacgag 960

atctacatcg cccacggcct gctgccgaac cgcaccttcg gctacggcca ctccttcggc 1020

gtgctctcgc actactacgg acgtgaagcc ggtctggagc tgcgcgagga cattgagact 1080

gtcctggagc caggcatggt cgtctcgatg gaaccgatga tcaccgtcat ggacggcgag 1140

ccaggtgccg gcggctaccg cgagcacgac atcctggtca tcggcgagga taacaccgtt 1200

gagaacatca ccaagttcgg tttcggtccg gagaacaaca tcatcgacgc gtaa 1254

<210> 2

<211> 417

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Met Thr Thr Ala Asn Ile Ala Thr Asn Val Ser Glu Leu Ala Arg Leu

1 5 10 15

Lys Thr Leu His Asn Gly Ala Lys Glu Gln Leu Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Glu Phe Glu Arg Arg Leu Ala Gly Leu Arg Gln Ile Met Ser Ala Lys

35 40 45

Ser Leu Asp Ala Val Ile Leu Thr Ser Tyr His Gly Ile Lys Tyr Tyr

50 55 60

Ser Asp Phe Leu Tyr Thr Thr Phe Gly Arg Asn Tyr Ala Leu Val Val

65 70 75 80

Thr Ala Ser Asn Ser Thr Thr Val Thr Ala Asn Ile Asp Ala Gly Met

85 90 95

Pro Trp Arg Thr Ser Tyr Gly Asp Asn Ile Val Tyr Thr Asp Trp Lys

100 105 110

Arg Asp Gly Phe Phe Tyr Gly Leu Gln Glu Ala Leu Lys Arg Asp Gly

115 120 125

Val Lys Ala Thr Arg Ile Gly Val Glu Asp Asp Phe Leu Pro Gly Arg

130 135 140

Thr Arg Arg Gln Ile Ala Asp Thr Phe Asp Gly Ala Thr Leu Val Asp

145 150 155 160

Val Ser Gln Asp Ala Met Arg Gln Arg Met Ile Lys Ser Ala Glu Glu

165 170 175

Ile Glu Val Gln Lys His Gly Ala Arg Ile Gly Asp Leu Gly Gly Glu

180 185 190

Ala Ile Lys Lys Ala Ile Arg Glu Gly Ile Ser Glu Tyr Glu Val Ala

195 200 205

Leu Ser Gly Thr Glu Ala Met Val His Glu Ile Ala Lys Thr Phe Pro

210 215 220

Ala Arg Glu Val Arg Asp Thr Trp Val Trp Phe Gln Ser Gly Ile Asn

225 230 235 240

Thr Asp Gly Ala His Asn Trp Ala Thr Thr Arg Lys Leu Gln Arg Gly

245 250 255

Asp Ile Leu Ser Leu Asn Cys Phe Pro Met Thr Ser Gly Tyr Tyr Thr

260 265 270

Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Leu Gly Glu Pro Asp Ala Arg Ser Leu

275 280 285

Glu Leu Trp Asn Ile Asn Val Glu Val His Lys Arg Gly Leu Glu Leu

290 295 300

Ile Lys Pro Gly Ala Val Cys Lys Asp Ile Ala Arg Ala Leu Asn Glu

305 310 315 320

Ile Tyr Ile Ala His Gly Leu Leu Pro Asn Arg Thr Phe Gly Tyr Gly

325 330 335

His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg Glu Ala Gly Leu

340 345 350

Glu Leu Arg Glu Asp Ile Glu Thr Val Leu Glu Pro Gly Met Val Val

355 360 365

Ser Met Glu Pro Met Ile Thr Val Met Asp Gly Glu Pro Gly Ala Gly

370 375 380

Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Val Ile Gly Glu Asp Asn Thr Val

385 390 395 400

Glu Asn Ile Thr Lys Phe Gly Phe Gly Pro Glu Asn Asn Ile Ile Asp

405 410 415

Ala

<210> 3

<211> 1251

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

atgaccaccg ctaacatcgc taccaacgtt tctgaactgg ctcgtctgaa aaccctgcac 60

aacggtgcta aagaacagct gaccttctct gacgctgaat tcgaacgtcg tctggctggt 120

ctgcgtcaga tcatgtctgc taaatctctg gacgctgtta tcctgacctc ttaccacggt 180

atcaaatact actctgactt cctgtacacc accttcggtc gtaactacgc tctggttgtt 240

accgcttcta actctaccac cgttaccgct aacatcgacg ctggtatgcc gtggcgtacc 300

tcttacggtg acaacatcgt ttacaccgac tggaaacgtg acggtttctt ctacggtctg 360

caggaagctc tgaaacgtga cggtgttaaa gctacccgta tcggtgttga agacgacttc 420

ctgccgggtc gtacccgtcg tcagatcgct gacaccttcg acggtgctac cctggttgac 480

gtttctcagg acgctatgcg tcagcgtatg atcaaatctg ctgaagaaat cgaagttcag 540

aaacacggtg ctcgtatcgg tgacctgggt ggtgaagcta tcaaaaaagc tatccgtgaa 600

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aaaaccttcc cggctcgtga agttcgtgac acctgggttt ggttccagtc tggtatcaac 720

accgacggtg ctcacaactg ggctaccacc cgtaaactgc agcgtggtga catcctgtct 780

ctgaactgct tcccgatgac ctctggttac tacaccgctc tggaacgtac cctgttcctg 840

ggtgaaccgg acgctcgttc tctggaactg tggaacatca acgttgaagt tcacaaacgt 900

ggtctggaac tgatcaaacc gggtgctgtt tgcaaagaca tcgctcgtgc tctgaacgaa 960

atctacatcg ctcacggtct gctgccgaac cgtaccttcg gttacggtca ctctttcggt 1020

gttctgtctc actactacgg tcgtgaagct ggtctggaac tgcgtgaaga catcgaaacc 1080

gttctggaac cgggtatggt tgtttctatg gaaccgatga tcaccgttat ggacggtgaa 1140

ccgggtgctg gtggttaccg tgaacacgac atcctggtta tcggtgaaga caacaccgtt 1200

gaaaacatca ccaaattcgg tttcggtccg gaaaacaaca tcatcgacgc t 1251

Claims

1.一个改进的肌酸水解酶，其在SEQ ID NO：1的基础上进行改进。

2.一个改进的肌酸水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.提供提高肌酸水解酶的活性和热稳定性的制备方法，包括如下步骤:

1)在SEQ ID NO：1序列的基础上通过突变以及筛选，获得了突变序列SEQ ID NO：3；将突变序列连接载体质粒；

2)将突变质粒转化进宿主细胞。

4.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自：

(1)编码SEQ ID NO：3所述多肽的多核苷酸；和

(2)与(1)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

5.一种载体，其包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的载体，其特征在于载体为PUC系列，pET系列，或pGEX中的任—种。

7.一种宿主细胞，其含有权利要求5或6所述的载体。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，包括:细菌、酵母和真菌细胞。

9.一种发酵生产重组肌酸水解酶的方法：从甘油管中按0.4％的接种量将权利要求8所述的宿主细胞接入20mL/250mL三角瓶，回旋式摇床转速200rpm，培养温度为37℃，培养12h，发酵培养：将培养好的种子培养液按1％(v/v)的接种量接种至50mL/500mL三角瓶中进行培养，培养温度为37℃，摇床转速200rpm；待OD600＝0.6，加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导表达，培养10h。