CN110511897A

CN110511897A - 一种沙雷氏菌及其在蛋白酶生产中的应用

Info

Publication number: CN110511897A
Application number: CN201910872187.7A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 颜正飞; 唐诚业
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2039-09-16
Also published as: CN110511897B

Abstract

本发明公开了一种沙雷氏菌及其在蛋白酶生产中的应用，属于微生物技术领域以及发酵技术领域。本发明筛选出了一种沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG‑D15，此沙雷氏菌JWG‑D15可高产氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶，将此沙雷氏菌JWG‑D15在大米蛋白的诱导下摇瓶发酵2d，可使发酵上清液中的蛋白酶酶活高达400～460U/mL；将此沙雷氏菌JWG‑D15发酵获得的蛋白酶以终酶活500U/mL的添加量加入大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液中进行反应，仅需反应2h，即可使反应上清液中的大米寡肽含量高达62.5％且游离氨基酸含量低至9.4％。

Description

一种沙雷氏菌及其在蛋白酶生产中的应用

技术领域

本发明涉及一种沙雷氏菌及其在蛋白酶生产中的应用，属于微生物技术领域以及发酵技术领域。

背景技术

大米蛋白是公认的优质蛋白，相对于大豆蛋白、乳清蛋白等蛋白而言，其营养抑制因子含量少，无过敏反应，包含人体所需氨基酸，氨基酸配比合理，且生物价远超大豆蛋白，可与虾及牛肉等的生物价相媲美，符合世界卫生组织(WHO)推荐的理想模式。大米蛋白水解成短肽后，还可以制成营养价值更高的短肽营养液，作为高价值添加剂运用于保健品、饮料、化妆品等行业。

在大米肽中，由2～10个氨基酸组成且分子量在180～1000Da之间的蛋白肽统称为“寡肽”，寡肽可被人体迅速吸收且吸收速率高出游离氨基酸70～80％，不仅不会引起营养过剩等副作用，而且还可以调节人体营养平衡，故而寡肽含量是大米肽品质的关键指标，提升寡肽含量、降低游离氨基酸含量则是大米肽产品追求的目标。

目前，大米寡肽的制备方法主要有酶解法、微生物发酵法、酸碱解法、化学合成法等，其中，酶解法是工业上可行，安全性高，而且绿色环保的一种方法。但是，酶解法具有许多缺陷，例如，公开号为CN1102229643A的专利中所记载的制备方法可使所得大米肽产品中的寡肽含量高达50％左右，但其在制备过程中需采用多种酶制剂协同酶解，并且，其需要使用中空纤维膜，这大大延长了大米肽产品的生产周期，增加了大米肽产品的工业生产成本；公开号为CN106967773A的专利中所记载的制备方法也可使所得大米肽产品中的寡肽含量高达50％左右，但其在制备过程中所采用的酶为亮氨酸和脯氨酸氨肽酶，亮氨酸和脯氨酸氨肽酶均为内切蛋白酶，切割多肽末端，使得用此法制备得到的大米肽产品中的游离氨基酸含量高达35％左右，这大大影响了大米肽产品的质量；公开号为CN103440949A的专利则先采用粉碎、调浆、洗涤、调浆、反应、浓缩、脱水等步骤对大米米渣进行预处理，然后再采用多种蛋白酶协同处理经预处理的大米米渣，但是，此方法主要以预处理方式提高大米肽产品中的寡肽含量，其酶解过程前后，大米肽产品中的寡肽含量变化不显著，并且，此方法制备步骤繁琐、能耗大、加酶量大，不利于工业化进程。因此，急需找到一种新的制备大米寡肽的方法以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可高效生产大米寡肽的方法。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种沙雷氏菌(Serratia sp.)，所述沙雷氏菌(Serratia sp.)已于2019年06月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2019417，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

所述沙雷氏菌(Serratia sp.)来源于于江苏省无锡市地区的大米加工厂厂区内土壤样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，发现其16S rDNA序列与Genbank Accession NumberJMPQ01000005的沙雷氏菌(Serratia marcescens subsp.marcescens)16S rDNA序列相似度高达99.17％，将与其相似度高的菌株构建系统进化树(具体可见图1)，结果显示菌株属于沙雷氏菌属，将其命名为沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15。

所述沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15在LB培养基上的菌落呈圆隆形凸起，浅红色，不透明，表面光滑，湿润有光泽，边缘整齐(具体可见图2)。

本发明还提供了一种蛋白酶，所述蛋白酶来源于上述沙雷氏菌(Serratia sp.)且所述蛋白酶为：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述蛋白酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。

本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。

本发明还提供了上述沙雷氏菌(Serratia sp.)在生产蛋白酶方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述蛋白酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产蛋白肽方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白肽为植物蛋白肽或动物蛋白肽。

在本发明的一种实施方式中，所述植物蛋白肽为大米肽、大豆肽、玉米肽或高粱肽。

在本发明的一种实施方式中，所述大米肽为大米寡肽。

在本发明的一种实施方式中，所述动物蛋白肽为胶原肽、骨髓肽或骨肽。

本发明还提供了一种生产上述蛋白酶的方法，所述方法为先将上述沙雷氏菌(Serratia sp.)接种于发酵培养基中进行发酵，得到含有蛋白酶的发酵液，然后将发酵液进行提取，得到蛋白酶。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30～37℃、转速为150～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含大米蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含5g/L大米蛋白、2g/L牛肉膏、1g/L K₂HPO₄、1g/L NaH₂PO₄以及0.5g/L MgSO₄。

本发明还提供了一种生产大米寡肽的方法，所述方法为以大米蛋白为底物，在含有大米蛋白的溶液中加入上述蛋白酶进行酶解，得到大米寡肽。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶在含有大米蛋白的溶液中的添加量为500～1000U/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶在含有大米蛋白的溶液中的添加量为500U/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述酶解的温度为35～40℃、转速为180～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述酶解的温度为40℃、转速为200rpm。

[有益效果]

(1)本发明筛选出了一种沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15，此沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15可高产氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶，将此沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15在大米蛋白的诱导下摇瓶发酵2d，可使发酵上清液中的蛋白酶酶活高达400～460U/mL。

(2)本发明提供了一种来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的、氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶，此蛋白酶可高效酶解大米蛋白，将此蛋白酶以终酶活500U/mL的添加量加入大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液中进行反应，仅需反应2h，即可使反应上清液中的大米寡肽含量高达62.5％。

(3)本发明提供了一种来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的、氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶，此蛋白酶温度稳定性好，在温度为30～50℃的条件下均能保持较高的酶活，在40℃下水浴2h后残留酶活依然高于95％。

(4)本发明提供了一种来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的、氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶，此蛋白酶pH稳定性好，在pH为6.0～9.0的条件下均能保持较高的酶活，在pH为8.0的条件下保存2h后残留酶活依然高于95％。

(5)本发明提供了一种生产大米寡肽的方法，此方法通过使用来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的、氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶，大大提高了大米寡肽的生产效率，降低了大米寡肽的生产成本，同时，提高了生产得到的大米寡肽的质量，以大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液为底物，将来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的、氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶以终酶活500U/mL的添加量加入大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液中进行反应，仅需反应2h，即可使反应上清液中的大米寡肽含量高达62.5％且游离氨基酸含量低至9.4％。

生物材料保藏

一种沙雷氏菌(Serratia sp.)，分类学命名为Serratia sp.JWG-D15，已于2019年06月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019417，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1：沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的系统进化树。

图2：沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的菌落。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB培养基(g/L)：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂15g，pH 7.0。

肉汤蛋白胨液体培养基(g/L)：肉汤3g、蛋白胨5g，pH 7.0。

筛选培养基平板(g/L)：大米蛋白5g、酵母粉1g、K₂HPO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、琼脂15g，pH 7.0。

斜面培养基(g/L)：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、琼脂15g，pH 7.0。

发酵培养基(g/L)：大米蛋白5g、牛肉膏2g、K₂HPO₄ 1g、NaH₂PO₄ 1g、MgSO₄ 0.5g，pH7.0。

种子培养基(g/L)：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，pH 7.0。

基础型发酵培养基(g/L)：蛋白胨15g、牛肉膏2g、K₂HPO₄ 1g、NaH₂PO₄ 1g、MgSO₄0.5g，pH 7.0。

大米蛋白诱导型发酵培养基(g/L)：大米蛋白5g、牛肉膏2g、K₂HPO₄ 1g、NaH₂PO₄1g、MgSO₄ 0.5g，pH 7.0。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

蛋白酶酶活测定：

采用福林酚法测定蛋白酶酶活，福林酚法具体步骤参照中华人民共和国专业标准GB/T23527-2009：蛋白酶制剂(附录B)。

蛋白酶酶活的定义：在pH为7.0、温度为37℃的条件下，1min内催化底物酪蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。

分子量分布测定：

取大米寡肽作为样品，加蒸馏水溶解成大米寡肽浓度为5mg/mL的溶液后，于12000rpm离心10min，取上清液200μL进行凝胶色谱分析；色谱条件如下：TSK gel G2000SW_XL(7.8mm×30cm，Tosoh)；二极管阵列检测器，检测波长220nm；流动相：V(乙腈)：V(水)：V(三氯乙酸)＝10:90:0.1；柱温30℃；进样量：20μL；流速0.8mL/min；利用V2.0英谱凝胶色谱数据工作站进行数据分析。

实施例1：沙雷氏菌(Serratia sp.)的筛选及鉴定

具体步骤如下：

1、筛选

以来源于江苏省无锡市地区的5家大米加工厂厂区内土壤为样本，每家大米加工厂厂区取两份土壤，共计10份样品；将10份样品放入60℃烘箱中热处理30min后，称取1g加入100mL肉汤蛋白胨液体培养基中，30℃、200rpm培养24h进行富集培养后，静置20min，取0.1mL上清液梯度稀释(10^-4，10^-5，10^-6)涂布于含大米蛋白的筛选培养基平板上，30℃培养2d，挑取四周有透明圈的菌落在固体肉汤蛋白胨培养基上划线分离纯化，反复3次进行初筛，得到纯化的单菌落；将纯化的单菌落接种至斜面培养基保存备用后，继续接种至发酵培养基中，30℃、200rpm培养2d，得到培养液；将培养液于12000rpm的条件下离心5min后，取上清液进行酶活测定，选取酶活高的培养液所对应的菌株，即菌株JWG-D15。

2、鉴定

提取菌株JWG-D15的总DNA进行16S rDNA的扩增和测序(JWG-D15的16S rDNA扩增的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3所示)，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，发现其16S rDNA序列与Genbank Accession Number JMPQ01000005的沙雷氏菌(Serratia marcescens subsp.marcescens)16S rDNA序列相似度高达99.17％，将与其相似度高的菌株构建系统进化树(具体可见图1)，结果显示菌株属于沙雷氏菌属，将其命名为沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15。

实施例2：沙雷氏菌(Serratia sp.)的培养

具体步骤如下：

从斜面上刮取一环实施例1获得的沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15在LB培养基划线培养，30℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落呈圆隆形凸起，浅红色，不透明，表面光滑，湿润有光泽，边缘整齐(具体可见图2)。

从斜面上刮取一环实施例1获得的沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15接入pH分别为3～10的LB培养基中于30℃恒温培养48h，发现其生长pH为6.0～9.0，最适pH为8.0。

从斜面上刮取一环实施例1获得的沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15接入pH为8的LB培养基中，分别于4～50℃恒温培养48h，发现其生长温度为25℃～40℃，最适温度30～37℃。

实施例3：沙雷氏菌(Serratia sp.)的摇瓶发酵

具体步骤如下：

1、基础型发酵

从斜面上刮取一环实施例1获得的沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15，置于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在30℃、200rpm的条件下振荡培养24h，得到种子液；将种子液以2.5％(v/v)的接种量接入装有50mL基础型发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养，在30℃、200rpm的条件下振荡培养2d，得到发酵液；将发酵液于12000rpm离心10min，得到上清液。

2、大米蛋白诱导型发酵

从斜面上刮取一环实施例1获得的沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15，置于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在30℃、200rpm的条件下振荡培养24h，得到种子液；将种子液以2.5％(v/v)的接种量接入装有50mL大米蛋白诱导型发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养，在30℃、200rpm的条件下振荡培养2d，得到发酵液；将发酵液于12000rpm离心10min，得到上清液。

分别取基础型发酵和大米蛋白诱导型发酵获得的上清液测蛋白酶活，检测结果为：基础型发酵获得的上清液中的蛋白酶酶活为250～265U/mL、大米蛋白诱导型发酵获得的上清液中的蛋白酶酶活为400～460U/mL(基础型发酵培养基中蛋白胨的含量和大米蛋白诱导型发酵培养基中大米蛋白的含量对上清液中蛋白酶酶活的影响见表1)。可见，沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15可在大米蛋白诱导下高产蛋白酶。

对此来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶进行测序，发现其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

表1基础型发酵培养基中蛋白胨的含量和大米蛋白诱导型发酵培养基中大米蛋白的含量对上清液中蛋白酶酶活的影响

实施例4：来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)的蛋白酶的酶学性质研究

具体步骤如下：

1、来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的最适pH

分别用浓度为50mM的NaAc-HAC缓冲液、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液以及Tris-HCL缓冲液与酪蛋白配制成酪蛋白质量体积浓度为1.0％，pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10的酪蛋白溶液；向每900μL酪蛋白溶液中加入实施例3中的大米蛋白诱导型发酵获得的上清液100μL，于37℃孵育10min后，以沸水浴灭活的实施例3中的大米蛋白诱导型发酵获得的上清液为对照组，测定每组孵育液中蛋白酶的酶活以确定来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的最适pH；每个pH条件下3个平行样品。

由结果可知，来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的最适pH为8.0。

2、来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的pH稳定性

将实施例3中的大米蛋白诱导型发酵获得的上清液在pH分别为3～10的条件下保存2h后，分别按1:9的体积比加入酪蛋白质量体积浓度为1.0％、pH值为8的酪蛋白溶液中，以未经处理的实施例3中的大米蛋白诱导型发酵获得的上清液的酶活为100％，测定每组上清液的残留酶活以确定来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的pH稳定性；每个pH条件下3个平行样品。

由结果可知，来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的pH稳定性好，在pH为6.0～9.0的条件下均能保持较高的酶活，在pH为8.0条件下下保存2h后残留酶活依然高于95％。

3、来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的最适温度

将实施例3中的大米蛋白诱导型发酵获得的上清液按1:9的体积比加入酪蛋白质量体积浓度为1.0％、pH值为8的酪蛋白溶液中，分别于0、20、30、40、50、60、70℃的条件下孵育10min后，以沸水浴灭活的实施例3中的大米蛋白诱导型发酵获得的上清液为对照组，测定每组孵育液中蛋白酶的酶活以确定来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的最适温度；每个温度条件下3个平行样品。

由结果可知，来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的最适温度为40℃。

4、来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的温度稳定性

将实施例3中的大米蛋白诱导型发酵获得的上清液在温度分别为0～70℃的条件下水浴2h后，分别按1:9的体积比加入酪蛋白质量体积浓度为1.0％、pH值为8的酪蛋白溶液中，以未经处理的实施例3中的大米蛋白诱导型发酵获得的上清液的酶活为100％，测定每组上清液的残留酶活以确定来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的温度稳定性；每个温度条件下3个平行样品。

由结果可知，来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶的温度稳定性好，在温度为30～50℃的条件下均能保持较高的酶活，在40℃下水浴2h后残留酶活依然高于95％。

实施例5：来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)的蛋白酶的应用

具体步骤如下：

将大米蛋白粗品(购自无锡金农生物科技有限公司)按料液比10:1(w/v，g/L)溶解于蒸馏水，得到分散液；在分散液中分别加入实施例3获得的来源于沙雷氏菌(Serratiasp.)JWG-D15的蛋白酶使其分散液终酶活500U/mL(以未经酶解的大米蛋白粗品为空白对照，以购自夏盛公司的200U/mg的商业碱性蛋白酶、200U/mg的中性蛋白酶、50U/mg的酸性蛋白酶50U/mg、250U/mg的胰蛋白酶、3000U/mg的胃蛋白酶，以及购自安占美公司的15U/mg的商业风味酶为对照组)，于40℃、150rpm恒温水浴摇床中反应2h后煮沸15min灭酶，得到酶解液；将酶解液于5000rpm的条件下离心20min，收集上清液；将上清液冷冻干燥制得大米寡肽。

检测不同蛋白酶处理后获得的大米寡肽的分子量分布，检测结果见表2。

由表2可知，大米蛋白粗品中的寡肽含量仅占总蛋白含量的19％；经来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶处理后，大米寡肽中的寡肽含量可达达到62.5％，远高于多种商业蛋白酶处理后的结果，而且，经来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶处理后的大米寡肽中的游离氨基酸含量也处于最低水平，约9.4％。可见，来源于沙雷氏菌(Serratia sp.)JWG-D15的蛋白酶适合制备大米寡肽。

表2不同蛋白酶处理后获得的大米寡肽粉的分子量分布

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种沙雷氏菌及其在蛋白酶生产中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 476

<212> PRT

<213> Serratia sp.

<400> 1

Met Ser Gly Ile Glu Pro Met Gln Ser Thr Lys Lys Ala Ile Glu Ile

1 5 10 15

Thr Glu Ser Ser Leu Ala Ala Ala Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Val Asp

20 25 30

Asp Leu Leu His Tyr His Glu Arg Gly Asn Gly Ile Gln Ile Asn Gly

35 40 45

Lys Asp Ser Phe Ser Asn Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ile Thr Arg Glu

50 55 60

Asn Gln Thr Trp Asn Gly Tyr Lys Val Phe Gly Gln Pro Val Lys Leu

65 70 75 80

Thr Phe Ser Phe Pro Asp Tyr Lys Phe Ser Ser Thr Asn Val Ala Gly

85 90 95

Asp Thr Gly Leu Ser Lys Phe Ser Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala Lys

100 105 110

Leu Ser Leu Gln Ser Trp Ala Asp Val Ala Asn Ile Thr Phe Thr Glu

115 120 125

Val Ala Ala Gly Gln Lys Ala Asn Ile Thr Phe Gly Asn Tyr Ser Gln

130 135 140

Asp Arg Pro Gly His Tyr Asp Tyr Gly Thr Gln Ala Tyr Ala Phe Leu

145 150 155 160

Pro Asn Thr Ile Trp Gln Gly Gln Asp Leu Gly Gly Gln Thr Trp Tyr

165 170 175

Asn Val Asn Gln Ser Asn Val Lys His Pro Ala Thr Glu Asp Tyr Gly

180 185 190

Arg Gln Thr Phe Thr His Glu Ile Gly His Ala Leu Gly Leu Ser His

195 200 205

Pro Gly Asp Tyr Asn Ala Gly Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Arg Asp Val

210 215 220

Thr Tyr Ala Glu Asp Thr Arg Gln Phe Ser Leu Met Ser Tyr Trp Ser

225 230 235 240

Glu Thr Asn Thr Gly Gly Asp Asn Gly Gly His Tyr Ala Ala Ala Pro

245 250 255

Leu Leu Asp Asp Ile Ala Ala Ile Gln His Leu Tyr Gly Ala Asn Leu

260 265 270

Ser Thr Arg Thr Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly

275 280 285

Arg Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gln Lys Val Ile Phe Ala

290 295 300

Ala Trp Asp Ala Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr

305 310 315 320

Ala Asn Gln Arg Ile Asn Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly

325 330 335

Gly Leu Lys Gly Asn Val Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn

340 345 350

Ala Ile Gly Gly Ser Gly Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn

355 360 365

Asn Val Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ala Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys Asp Ile Phe Val Phe

385 390 395 400

Ser Ala Ala Ser Asp Ser Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Arg Asp

405 410 415

Phe Gln Lys Gly Ile Asp Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Lys Glu

420 425 430

Ala Gln Ser Ser Asp Phe Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Thr

435 440 445

Ala Gly Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Asn Val Thr Asp

450 455 460

Leu Ser Val Asn Ile Gly Gly His Gln Ala Pro Asp

465 470 475

<210> 2

<211> 1425

<212> DNA

<213> Serratia sp.

<400> 2

atgagtggaa tcgaaccaat gcaatctact aaaaaggcaa ttgaaattac tgaatccagc 60

ctcgctgccg cgacaaccgg ttacgatgct gtagacgacc tgctgcatta tcatgagcgg 120

ggtaacggga ttcagattaa tggcaaggat tcattttcta acgagcaagc tgggctgttt 180

attacccgtg agaaccaaac ctggaacggt tacaaggtat ttggccagcc ggtcaaatta 240

accttctcgt tcccggacta taagttctct tccaccaacg tcgccggcga caccgggctg 300

agcaagttca gcgcggaaca gcagcagcag gctaagctgt cgctgcagtc ctgggccgat 360

gttgccaata tcaccttcac cgaagtggcg gccggtcaaa aggccaatat caccttcggc 420

aactacagcc aggatcgtcc cggccactat gattacggca cccaggccta cgccttcctg 480

ccgaacacca tttggcaggg ccaggatttg ggcggccaga cttggtacaa cgtcaaccaa 540

tccaacgtga agcatccggc gaccgaagac tacggccgcc agacgttcac ccatgagatt 600

ggccatgcgc tgggtctgag ccacccgggc gactacaacg ccggtgaggg caacccgacc 660

tatagagatg tcacctatgc ggaagatacc cgccagttca gcctgatgag ctactggagt 720

gaaaccaata ccggtggcga caacggcggt cactatgccg cggctccgct gctggatgac 780

attgccgcca ttcagcatct gtatggcgcc aacctgtcga cccgcaccgg cgacaccgtg 840

tacggcttta actcaaatac cggtcgtgac ttcctcagca ccaccagcaa ctcgcagaaa 900

gtgatctttg cggcctggga tgcgggcggc aacgatacct tcgacttctc cggttacacc 960

gctaaccagc gcatcaacct gaacgagaaa tcgttctccg acgtgggcgg cctgaagggc 1020

aacgtgtcga tcgccgccgg tgtgaccatt gagaacgcca ttggcggttc cggcaacgac 1080

gtgatcgtcg gcaacgcggc caacaacgtg ctgaaaggcg gcgcgggtaa cgacgtgctg 1140

ttcggcggcg gcggggcgga tgaattgtgg ggcggtgccg gcaaagacat cttcgtgttc 1200

tctgccgcca gcgattccgc accgggcgct tcagactgga tccgcgactt ccagaagggg 1260

atcgacaaga tcgacctgtc gttcttcaat aaagaagcgc agagcagcga tttcattcac 1320

ttcgtcgatc acttcagcgg cacggccggt gaggcgctgc tgagctacaa cgcgtccagc 1380

aacgtgaccg atttgtcggt gaatatcggt gggcatcagg cgccg 1425

<210> 3

<211> 1444

<212> DNA

<213> Serratia sp.

<400> 3

ctaggcggga ggcttacaca tgcaagtcga gcggtagcac aggggagctt gctccctggg 60

tgacgagcgg cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta 120

ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc 180

tcttgccatc agatgtgccc agatgggatt agctagtagg tggggtaatg gctcacctag 240

gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc 300

agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360

catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca ctttcagcga ggaggaaggt 420

ggtgaactta atacgttcat caattgacgt tactcgcaga agaagcaccg gctaactccg 480

tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540

cgcacgcagg cggtttgtta agtcagatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca 600

tttgaaactg gcaagctaga gtctcgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa 660

atgcgtagag atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggacg aagactgacg 720

ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgctgtaa 780

acgatgtcga tttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaaat 840

cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 900

caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac 960

atccagagaa ctttccagag atggattggt gccttcggga actctgagac aggtgctgca 1020

tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080

tatcctttgt tgccagcggt tcggccggga actcaaagga gactgccagt gataaactgg 1140

aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct 1200

acaatggcat atacaaagag aagcgacctc gcgagagcaa gcggacctca taaagtatgt 1260

cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgta 1320

gatcagaatg ctacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1380

ggagtgggtt gcaaaagaag taggtagctt aaccttcggg agggcgctac cacttggata 1440

aggg 1444

Claims

1.一种沙雷氏菌(Serratia sp.)，其特征在于，所述沙雷氏菌(Serratia sp.)已于2019年06月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019417，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

2.一种蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶来源于权利要求1所述沙雷氏菌(Serratiasp.)且所述蛋白酶为：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，

3.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求2所述的蛋白酶。

4.如权利要求3所述的一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求3或4所述的基因。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求3或4所述的基因或权利要求5所述的重组质粒。

7.权利要求1所述沙雷氏菌(Serratia sp.)在生产蛋白酶方面的应用。

8.权利要求2所述蛋白酶或权利要求3或4所述基因或权利要求5所述重组质粒或权利要求6所述宿主细胞在生产蛋白肽方面的应用。

9.一种生产权利要求2所述蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1所述的沙雷氏菌(Serratia sp.)接种于发酵培养基中进行发酵，得到含有蛋白酶的发酵液，然后将发酵液进行提取，得到蛋白酶。

10.一种生产大米寡肽的方法，其特征在于，所述方法为以大米蛋白为底物，在大米蛋白中加入权利要求2所述的蛋白酶进行酶解，得到大米寡肽。