CN106754601A - 一种应用磷脂酶c将胞内蛋白在胞外表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用磷脂酶C将胞内蛋白在胞外表达的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过共表达磷脂酶C，使胞内定位蛋白以非特异渗漏的方式释放到细胞外，筛选获得高性能的磷脂酶C和目标蛋白胞外酶活较高的共表达重组菌。蔗糖磷酸化酶与磷脂酶C共表达的重组菌胞外蔗糖磷酸化酶的酶活为1445.1U·mL‑1，海藻糖酶与磷脂酶C共表达的重组菌胞外海藻糖酶的酶活为322.3U·mL‑1，可以实现胞内定位目标蛋白胞外表达，提高生产效率、简化后提取工艺，在食品、化妆品及医药行业有广泛的应用价值,国内外市场需求较大。

Description

一种应用磷脂酶C将胞内蛋白在胞外表达的方法
技术领域
本发明涉及一种应用磷脂酶C将胞内蛋白在胞外表达的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统作为目前应用最广泛、研究最透彻的表达系统之一，在培养周期长短、实验操作简便度等方面具有显著优势。由于大肠杆菌具有两层的细胞膜结构，外源基因在大肠杆菌表达系统中的表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置，通常有三种定位方式：胞内、胞外和周质空间定位。
有研究发现，当天然胞内定位的蛋白在大肠杆菌表达系统重组表达时，即使给目的蛋白添加信号肽，也不能穿过大肠杆菌的细胞膜分泌到细胞外。这些蛋白通常只能在细胞内进行表达并且需要利用物理或化学方法对细胞进行破碎才能获得目的蛋白，后续提取工艺不但繁琐而且成本较高，因此寻找能够有效的简化下游提取步骤降低产物纯化的成本成为了研究者的目标。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶C；所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌共表达磷脂酶C与目标蛋白；所述目标蛋白是胞内蛋白，该基因工程菌能够使胞内蛋白在胞外表达。
在发明的一种实施方式中，三种磷脂酶C基因分别来源于Listeriamonocytogenes、Clostridium perfringens和Bacillus cereus。
在本发明的一种实施方式中，所述目标蛋白是胞内定位蛋白；所述胞内定位蛋白是在伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体后仍定位在细胞基质中的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述目标蛋白包括蔗糖磷酸化酶，海藻糖酶。
在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酶C与目标蛋白是以pETDuet-1为载体进行共表达。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主。
本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将编码磷脂酶C的基因和编码目标蛋白的基因分别连接到pETDuet-1表达载体的多克隆位点MCS1或MCS2上，得到重组表达质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述编码磷脂酶C的基因包括SEQ ID NO.4-6。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
本发明的第三个目的是提供一种将胞内蛋白在胞外表达的方法，是将磷脂酶C分别与目标蛋白在大肠杆菌中共表达；所述磷脂酶C的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明的第四个目的是提供一种生产胞外蛋白的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，离心，收集发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，具体是：(1)分别将基因序列如SEQ ID NO.4-6所示的三种磷脂酶C基因和蔗糖磷酸化酶基因连接到pETDuet-1表达载体的多克隆位点MCS1或MCS2上，得到重组表达质粒，(2)将重组质粒转化到宿主菌，(3)对重组菌进行发酵培养，收集发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pETDuet-1，所述宿主菌为E.coliBL21(DE3)。
在本发明的一种实施方式中，所述目标蛋白为胞内定位蛋白；所述胞内定位蛋白是在伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体后仍定位在细胞基质中的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述目标蛋白包括蔗糖磷酸化酶，海藻糖酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：
(1)将SEQ ID NO.4-6所示不含信号肽的磷脂酶C成熟蛋白基因以及蔗糖磷酸化酶基因，连接至pMD19-T simple vector，获得质粒pMD19T-plc(以plc代表三种磷脂酶C)和pMD19T-sp；
(2)分别对表达载体pETDuet-1和上步构建成功的pMD19T-plc或pMD19T-sp质粒进行双酶切，将不同的目的基因分别连接到表达载体pETDuet-1的多克隆位点MCS1，转化E.coli JM109感受态细胞，得到重组质粒pETDuet-1-plc和pETDuet-1-sp。
(3)分别对含有sp和plc基因的质粒以及上步构建的pETDuet-1-plc和pETDuet-1-sp进行双酶切，将sp或plc分别连接到重组质粒pETDuet-1-plc和pETDuet-1-sp的多克隆位点MCS2，转化E.coli JM109感受态细胞，得到共表达质粒pETDuet-1-plc-sp和pETDuet-1-sp-plc。
(4)将步骤(3)构建的共表达质粒pETDuet-1-plc-sp和pETDuet-1-sp-plc分别导入宿主大肠杆菌，获得六株重组菌；
(5)发酵培养步骤(4)构建的重组大肠杆菌生产目标蛋白，收集发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养具体是：将种子以8-10％的接种量接种，诱导前培养温度为37℃，诱导后培养温度30℃，pH6.5-7.5，溶氧20-30％；当发酵初始碳源甘油基本消耗完时，开始流加补料液，所述补料液按指数流加，比生长速率控制在μ＝0.1-0.3h-1；当菌体细胞浓度达到OD600为30-50时，开始诱导，诱导方法为恒速流加乳糖，乳糖加量0.1-0.4g·L-1·h-1，测定菌体干重和培养基中酶活变化，培养基中酶活不再上升时，发酵过程结束。在此条件下进行发酵培养，能够使胞内定位目标蛋白分泌到胞外。
有益效果：本发明通过共表达磷脂酶C，使大肠杆菌细胞膜透性提高，可以使胞内定位蛋白以非特异渗漏的方式释放到细胞外，筛选获得高性能的磷脂酶C和目标蛋白胞外酶活较高的共表达重组菌。蔗糖磷酸化酶与磷脂酶C共表达的重组菌胞外蔗糖磷酸化酶的酶活为1445.1U·mL-1，而单独表达的重组菌胞外未检测到蔗糖磷酸化酶酶活；海藻糖酶与磷脂酶C共表达的重组菌胞外海藻糖酶的酶活为322.3U·mL-1，而单独表达的重组菌胞外未检测到海藻糖酶酶活。在食品、化妆品及医药行业有广泛的应用价值,国内外市场需求较大。
附图说明
图1为重组质粒的构建过程；a，pETDuet-1-lstplc-sp；b，pETDuet-1-sp-lstplc；
图2为重组菌的生物量和产酶曲线；其中，a，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp；b，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc；
图3为重组菌SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，a，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp；b，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc；M，Marker；1-3分别为E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp的发酵上清液、破壁上清液和破壁沉淀；4-6分别为E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc的发酵上清液、破壁上清液和破壁沉淀；
图4为重组菌的生物量和产酶曲线；其中，a，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-cpplc-sp；b，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-cpplc；■，菌体干重；▲，胞外上清酶活；●，总酶活；
图5为重组菌的SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，a，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-cpplc-sp；b，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-cpplc；M，Marker；1-3分别为重组菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-cpplc-sp的发酵上清液，破壁上清液和破壁沉淀；4-6分别为重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-cpplc的发酵上清液，破壁上清液和破壁沉淀
图6为重组菌的生物量和产酶曲线；其中，a，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-bcplc-sp；b，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc；■，菌体干重；▲，胞外上清酶活；●，总酶活；
图7为重组菌的SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，a，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-bcplc-sp；b，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc；M，Marker；1-3分别为重组菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-bcplc-sp的发酵上清液，破壁上清液和破壁沉淀；4-6分别为重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc的发酵上清液，破壁上清液和破壁沉淀。
图8为重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc高密度发酵的生物量和产酶曲线；其中，■，菌体干重；▲，胞外上清酶活；
图9为重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc高密度发酵上清SDS-PAGE凝胶电泳分析(将发酵上清液稀释10倍进行上样)；其中M，Marker；1-9分别为重组菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc诱导15h、18h、21h、24h、27h、30h、33h、36h、39h发酵上清液；
图10为重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-Tre F-bcplc的生物量和产酶曲线；其中，■，菌体干重；▲，胞外上清酶活；●，总酶活；
图11为重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-Tre F-bcplc的SDS-PAGE凝胶电泳分析；其中M，Marker；1-31-3分别为重组菌的发酵上清液，破壁上清液和破壁沉淀；
图12为重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-Tre F-bcplc高密度发酵的生物量和产酶曲线；其中，■，菌体干重；▲，胞外上清酶活；
具体实施方式
培养基见表1：
表1培养基成分及配制方法
在具体实施方式中，以蔗糖磷酸化酶和海藻糖酶为例实施本发明的技术方案，其中蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，海藻糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例1：L.monocytogenes磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶共表达
1.重组菌的构建：分别以含有L.monocytogenes磷脂酶C基因(氨基酸序列如SEQID NO.1所示)的表达质粒pET-24a(+)-lstplc和实验室保藏的含有蔗糖磷酸化酶基因的表达质粒pET-24a(+)-sp为模板，PCR扩增得到含有Nco I和Hind III酶切位点的磷脂酶C基因lstplc和蔗糖磷酸化酶基因sp，然后按照图1(a)和(b)质粒构建过程将L.monocytogenes磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶基因分别插入到pETDuet-1(购自Novagen公司)表达载体的多克隆位点MCS1或MCS2中，连接产物转化克隆宿主E.coli JM109涂布LB-Amp固体培养基，37℃培养箱培养8h，挑取单菌落，经LB-Amp液体培养基37℃培养8h后，收集菌体抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，获得重组表达质粒pETDuet-1-lstplc-sp和pETDuet-1-sp-lstplc。将重组表达质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB-Amp固体培养基，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB-Amp液体培养基37℃培养8h后保甘油菌，即得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc。
2.重组菌的摇瓶发酵：将重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc用移液枪吸取10μL菌液分别接种于10mL LB-Amp液体培养基中，置于37℃恒温摇床，200r·min-1，培养8-10h，作为种子液。
将培养好的种子液以5％的接种量接入50mL TB-Amp培养基中，置于37℃恒温摇床，转速200r·min-1，培养2h；加入终浓度为0.4mmol·L-1的IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)进行诱导发酵，25℃，转速200r·min-1，培养20-30h。如图2(a)，重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp经IPTG诱导发酵21h后，发酵上清中蔗糖磷酸化酶的酶活达到最高为72U·mL-1，占胞内总酶活的92.1％。如图2(b)，重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc经IPTG诱导发酵26h后，胞外上清的蔗糖磷酸化酶酶活达到最高为122.2U·mL-1，占总酶活的90.5％。此时，两株重组菌的磷脂酶C的酶活分别为9.5U·mL-1和9.1U·mL-1。
实施例2：C.perfringens磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶共表达
1.重组菌的构建：分别以含有C.perfringens磷脂酶C基因(氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示)的表达质粒pET-24a(+)-cpplc和实验室保藏的含有蔗糖磷酸化酶基因的表达质粒pET-24a(+)-sp为模板，PCR扩增得到含有Nco I和Hind III酶切位点的磷脂酶C基因cpplc和蔗糖磷酸化酶基因sp，然后参照图1(a)和(b)质粒构建过程将C.perfringens磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶基因分别插入到pETDuet-1表达载体的多克隆位点MCS1或MCS2中，连接产物转化克隆宿主E.coli JM109涂布LB-Amp固体培养基，37℃培养箱培养8h，挑取单菌落，经LB-Amp液体培养基37℃培养8h后，收集菌体抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，获得重组表达质粒pETDuet-1-cpplc-sp和pETDuet-1-sp-cpplc。将重组表达质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB-Amp固体培养基，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB-Amp液体培养基37℃培养8h后保甘油菌，即得到重组菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-cpplc-sp和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-cpplc。
2.重组菌的摇瓶发酵：培养方法同实施例1。如图4(a)，重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-cpplc-sp诱导发酵26h时，发酵液上清中蔗糖磷酸化酶的酶活达到最高为16.2U·mL-1，总酶活为187.2U·mL-1，胞外酶活占总酶活的8.6％。如图4(b)，重组菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-sp-cpplc诱导发酵30h时，胞外上清中蔗糖磷酸化酶的酶活达到最高为19.3U·mL-1，总酶活为285.0U·mL-1，胞外酶活约占总酶活的6.7％。两种重组菌磷脂酶C的总酶活分别为8.4U·mL-1和8.0U·mL-1。
实施例3：B.cereus磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶共表达
1.重组菌的构建：分别以含有B.cereus磷脂酶C基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)的表达质粒pET-24a(+)-bcplc和实验室保藏的含有蔗糖磷酸化酶基因的表达质粒pET-24a(+)-sp为模板，PCR扩增得到含有Nco I和Hind III酶切位点的磷脂酶C基因bcplc和蔗糖磷酸化酶基因sp，然后参照图1(a)和(b)质粒构建过程将B.cereus磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶基因分别插入到pETDuet-1表达载体的多克隆位点MCS1或MCS2中，连接产物转化克隆宿主E.coli JM109涂布LB-Amp固体培养基，37℃培养箱培养8h，挑取单菌落，经LB-Amp液体培养基37℃培养8h后，收集菌体抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，获得重组表达质粒pETDuet-1-bcplc-sp和pETDuet-1-sp-bcplc。将重组表达质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB-Amp固体培养基，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB-Amp液体培养基37℃培养8h后保甘油菌，即得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-bcplc-sp和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc。
2.重组菌的摇瓶发酵：培养方法同实施例1。如图6(a)，重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-bcplc-sp在诱导发酵28h时，发酵上清中的蔗糖磷酸化酶酶活达到最高为84.2U·mL-1，此时总酶活为101.5U·mL-1，胞外酶活约占总酶活的82.9％；如图6(b)，重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc在诱导发酵28h时，胞外上清中蔗糖磷酸化酶酶活达到最高为174U·mL-1，总酶活为224.5U·mL-1，胞外酶活约占总酶活的77.5％。两种重组菌磷脂酶C的总酶活分别为18.5U·mL-1和13.3U·mL-1。
不同的磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶共表达重组菌的摇瓶发酵生长和产酶情况如表2所示，当L.monocytogenes磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶共表达时，重组菌蔗糖磷酸化酶的胞外产酶比例最高，同L.monocytogenes磷脂酶C单独表达结果类似，但是磷脂酶C对蔗糖磷酸化酶的表达具有很大的影响，与另外两种磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶共表达相比，蔗糖磷酸化酶的发酵周期相对较短，总酶活最低；当C.perfringens磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶共表达时，磷脂酶C对蔗糖磷酸化酶的表达影响较小，重组菌发酵周期较长，蔗糖磷酸化酶的总酶活最高，但是由于C.perfringens磷脂酶C对细胞膜磷脂成分磷脂酰乙醇胺的水解活性较差，导致蔗糖磷酸化酶的释放到胞外的比例很低；与另外两种磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶共表达相比，当B.cereus磷脂酶C与蔗糖磷酸化酶共表达时，蔗糖磷酸化酶的胞外酶活最高，重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc蔗糖磷酸化酶的胞外酶活为174.0U·mL-1，由于磷脂酶C对细胞膜磷脂成分的水解作用，蔗糖磷酸化酶的胞外产酶比例也可到达77.5％。
表2
注：lstplc-sp、sp-lstplc、cpplc-sp、sp-cpplc、bcplc-sp和sp-bcplc分别表示重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-lstplc-sp、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-lstplc、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-cpplc-sp、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-cpplc、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-bcplc-sp和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc。
综上，根据不同磷脂酶C和蔗糖磷酸化酶共表达对蔗糖磷酸化酶的酶活和胞外产酶比例的比较分析，重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc蔗糖磷酸化酶的胞外酶活最高，具有更好的工业应用价值。
实施例4：重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc的3L发酵罐高密度发酵
种子培养：将-80℃甘油管保存的E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-sp-bcplc菌株接入种子培养基中，使用恒温摇床进行培养，温度37℃，转速200rpm，培养8h。
发酵产酶：将种子液以8％接种量接入发酵培养基。通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持30％，控制温度为37℃，流加氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，以比生长速率μ＝0.2h-1指数流加的方式补加补料培养基。当细胞浓度达到OD600＝30时，开始以0.2g·L-1·h-1流速恒速流加乳糖进行诱导，诱导温度30℃，诱导36h左右。发酵培养结束后，30℃诱导39h，蔗糖磷酸化酶的酶活力最高可以达到1445.1U·mL-1，占总酶活的81.6％
实施例5：蔗糖磷酸化酶在E.coli BL21(DE3)单独表达
本发明将蔗糖磷酸化酶基因连接在pET-24a(+)表达载体上，构建了蔗糖磷酸化酶的单独表达重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-sp，对重组菌进行摇瓶发酵，在发酵上清中未检测到蔗糖磷酸化酶的酶活。
实施例6：海藻糖酶与B.cereus磷脂酶C共表达
1.重组菌的构建：分别以含有B.cereus磷脂酶C基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)的表达质粒pET-24a(+)-bcplc和实验室保藏的含有海藻糖酶基因的表达质粒pET-24a(+)-Tre F(氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)为模板，参照图1(b)的质粒构建过程将将海藻糖酶基因Tre F和B.cereus磷脂酶C基因bcplc分别连接到pETDuet-1表达载体的多克隆位点MCS1和MCS2，连接产物转化克隆宿主E.coli JM109涂布LB-Amp固体培养基，37℃培养箱培养8h，挑取单菌落，经LB-Amp液体培养基37℃培养8h后，收集菌体抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，获得重组表达质粒pETDuet-1-Tre F-bcplc。将重组表达质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB-Amp固体培养基，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB-Amp液体培养基37℃培养8h后保甘油菌，即得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-Tre F-bcplc。
2.重组菌的摇瓶发酵：培养方法同实施例1。如图11，重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-Tre F-bcplc重组菌胞外酶活达到最高为64.6U·mL-1，总酶活为85.9U·mL-1，胞外酶活约占总酶活的75.2％；此时，磷脂酶C胞内外酶活为12.5U·mL-1，表明B.cereus磷脂酶C共表达海藻糖酶时可以使海藻糖酶很好的分泌到胞外。
3.重组菌的高密度发酵：发酵条件同实施例4.如图12，重组菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-Tre F-bcplc发酵上清中海藻糖酶活最高为322.3U·mL-1，胞外酶活约占总酶活的40.6％。
实施例7：海藻糖酶在E.coli BL21(DE3)单独表达
本发明将海藻糖酶基因与pET-24a(+)表达载体连接，构建了蔗糖磷酸化酶的单独表达重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-Tre F，对重组菌进行摇瓶发酵，在发酵上清中未检测到海藻糖酶的酶活。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种应用磷脂酶C将胞内蛋白在胞外表达的方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Trp Ser Ala Asp Asn Pro Thr Asn Thr Asp Val Asn Thr His Tyr
1 5 10 15
Trp Leu Phe Lys Gln Ala Glu Lys Ile Leu Ala Lys Asp Val Asn His
20 25 30
Met Arg Ala Asn Leu Met Asn Glu Leu Lys Lys Phe Asp Lys Gln Ile
35 40 45
Ala Gln Gly Ile Tyr Asp Ala Asp His Lys Asn Pro Tyr Tyr Asp Thr
50 55 60
Ser Thr Phe Leu Ser His Phe Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Asn Thr Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Gly Phe Ala Asn Ala Lys Ile Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Asn
85 90 95
Gln Ser Val Thr Asp Tyr Arg Glu Gly Lys Phe Asp Thr Ala Phe Tyr
100 105 110
Lys Leu Gly Leu Ala Ile His Tyr Tyr Thr Asp Ile Ser Gln Pro Met
115 120 125
His Ala Asn Asn Phe Thr Ala Ile Ser Tyr Pro Pro Gly Tyr His Cys
130 135 140
Ala Tyr Glu Asn Tyr Val Asp Thr Ile Lys His Asn Tyr Gln Ala Thr
145 150 155 160
Glu Asp Met Val Ala Lys Arg Phe Cys Ser Asp Asp Val Lys Asp Trp
165 170 175
Leu Tyr Glu Asn Ala Lys Arg Ala Lys Ala Asp Tyr Pro Lys Ile Val
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Lys Ser Tyr Leu Val Gly Asn Ser Glu Trp Lys
195 200 205
Lys Asp Thr Val Glu Pro Thr Gly Ala Arg Leu Arg Asp Ser Gln Gln
210 215 220
Thr Leu Ala Gly Phe Leu Glu Phe Trp Ser Lys Lys Thr Asn Glu
225 230 235
<210> 2
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val
1 5 10 15
Thr Gln Gly Val Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro
20 25 30
Glu Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu
35 40 45
Leu Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp
50 55 60
Leu Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser
65 70 75 80
Lys Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu
85 90 95
Ser Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg
100 105 110
Gly Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr
115 120 125
Phe Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val
130 135 140
Asp Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys
145 150 155 160
Glu Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Ala Phe
165 170 175
Tyr Thr Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu
180 185 190
Tyr Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His
195 200 205
Ala Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val
210 215 220
Thr Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe
225 230 235 240
Leu His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val
245 250 255
Lys Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly
260 265 270
Thr Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr
275 280 285
Gln Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser
290 295 300
Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp
305 310 315 320
Asp Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Ser
325 330 335
Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val
340 345 350
Val Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr
355 360 365
Asn Ile Lys
370
<210> 3
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
His Glu Asn Asp Gly Gly Ser Lys Ile Lys Ile Val His Arg Trp Ser
1 5 10 15
Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly Val Asn Ser His Leu Trp Ile Val
20 25 30
Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val Lys Gln
35 40 45
Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Gly
50 55 60
Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile Pro Phe
85 90 95
Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Gly
100 105 110
Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr Leu Gly
115 120 125
Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His Ala Ala
130 135 140
Asn Phe Thr Asn Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys Tyr Glu
145 150 155 160
Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp Gly Asn
165 170 175
Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile His Gly
180 185 190
Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn Asp Asn
195 200 205
Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr Ala Asp
210 215 220
Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu Met Asp
225 230 235 240
Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp Thr Tyr
245 250 255
Gly Asp Arg
<210> 4
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgtggtcag cagataatcc gaccaatacc gatgtgaata cccattattg gctcttcaag 60
caggcagaaa aaattctggc aaaagatgtt aatcacatgc gcgcaaatct gatgaatgaa 120
ctgaaaaaat ttgataaaca gattgcacag ggtatttatg atgcagatca taaaaatccg 180
tattatgata cctcaacctt tctgtctcat ttttataatc cagatcgcga taatacctat 240
ctgcctggtt ttgcaaatgc aaaaattacc ggcgcaaaat attttaatca gagtgtgacc 300
gattatcgcg aaggtaaatt tgataccgca ttttataaac tgggcctggc aattcattat 360
tataccgata ttagtcagcc gatgcacgca aataatttta ccgcaattag ctatccgcca 420
ggttatcatt gtgcttatga aaattatgtg gataccatta aacataatta tcaggcaacc 480
gaagatatgg tggcaaaacg cttttgtagc gatgatgtta aagattggct gtatgaaaat 540
gcaaaacgtg caaaagcaga ttatccgaaa attgttaatg caaaaaccaa aaaatcttat 600
ctggtgggta atagcgaatg gaaaaaagat accgtggaac cgaccggcgc acgcctgcgt 660
gattcacagc agaccctggc aggctttctg gaattttgga gtaaaaaaac caatgaataa 720
<210> 5
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgtgggatg gtaaaattga tgggaccggc acccatgcaa tgattgtgac ccagggtgtg 60
tcaattctgg aaaatgatct gtctaaaaat gaaccggaat cagttcgtaa aaatctggaa 120
attctgaaag aaaatatgca cgaactgcag ctgggctcta cctaccctga ttatgataaa 180
aatgcctacg atctgtatca ggatcatttt tgggaccccg ataccgataa taatttttct 240
aaagataata gttggtatct ggcatatagc atccccgata ccggcgaatc tcagattcgc 300
aaattttcag cactggcacg ctatgaatgg cagcgcggta attataaaca ggcaaccttt 360
tatctgggcg aagcaatgca ctattttggc gatattgata ccccgtatca tccggcaaat 420
gtgaccgcag ttgatagcgc aggccatgtt aaatttgaaa cctttgcaga agaacgcaaa 480
gaacagtata aaatcaacac cgcaggttgt aaaaccaatg aagcatttta taccgatatt 540
ctgaaaaata aagattttaa tgcttggtct aaagaatatg cacgcggctt tgcaaaaacc 600
ggtaaatcaa tttattatag tcatgcaagt atgtctcata gttgggatga ttgggattat 660
gcagcaaaag tgaccctggc aaatagccag aaaggtacag caggctatat ttatcgcttt 720
ctgcatgatg ttagcgaagg taatgatccg agcgtgggca aaaatgttaa agaactggtt 780
gcatatatta gtaccagtgg cgaaaaagat gcaggcaccg atgattatat gtattttggt 840
attaaaacca aagatggcaa aacccaggaa tgggaaatgg ataatcctgg aaatgatttt 900
atgaccggct ctaaagatac ctataccttt aaactgaaag atgaaaatct gaaaattgat 960
gatattcaga atatgtggat tcgcaaacgt aaatataccg catttagcga tgcgtataaa 1020
ccggaaaata ttaaaattat tgcaaatggc aaagtggttg tggataaaga tattaacgaa 1080
tggattagcg gtaattcaac ctataatatt aaataa 1116
<210> 6
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
catgaaaatg atgggggaag taaaataaaa atagttcacc gctggtctgc tgaagataaa 60
cataaagaag gtgtaaattc tcatttatgg attgtaaacc gtgcgattga tattatgtct 120
cgcaatacaa cacttgtaaa acaagatcga gttgcacaat taaatgaatg gcgtacggag 180
ttagagaacg gtatttatgc tgctgactat gaaaatcctt attatgataa tagcacattt 240
gcttcacatt tctatgatcc agacaatgga aaaacatata ttccatttgc aaagcaggca 300
aaagaaactg gcgctaaata ttttaaatta gctggtgaat catacaaaaa taaagatatg 360
aaacaagcat tcttctattt aggattatct cttcattatt taggagatgt aaaccaaccg 420
atgcatgcgg caaactttac aaatctttca tatccacaag gattccattc taaatatgaa 480
aactttgtag atacgataaa agataattat aaagtaacgg atggaaatgg atattggaac 540
tggaaaggta caaatccaga agagtggatt catggagcgg cagtagtagc gaaacaagat 600
tactctggaa ttgtaaatga taatacgaaa gattggttcg taaaagcagc tgtgtcacaa 660
gaatatgcag ataaatggcg cgctgaagtt acaccaatga caggtaagcg attaatggat 720
gcacaacgtg ttactgctgg atacattcag ctttggtttg atacgtacgg agatcgttaa 780
<210> 7
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Glu Ile Gln Asn Lys Ala Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu
1 5 10 15
Gly Lys Asn Leu Lys Asp Val His Gln Val Leu Lys Glu Asp Ile Gly
20 25 30
Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly
35 40 45
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ala Asp Tyr Thr Arg Val Asp Ala Ala Phe
50 55 60
Gly Asp Trp Ala Asp Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Tyr Tyr Leu Met
65 70 75 80
Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Glu Ser Val Met Tyr Gln
85 90 95
Asp Phe Lys Lys Asn His Asp Asp Ser Lys Tyr Lys Asp Phe Phe Ile
100 105 110
Arg Trp Glu Lys Phe Trp Ala Lys Ala Gly Glu Asn Arg Pro Thr Gln
115 120 125
Ala Asp Val Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Lys Ala Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Ile Thr Phe Asp Asp Gly Thr Thr Glu Asn Leu Trp Asn Thr Phe
145 150 155 160
Gly Glu Glu Gln Ile Asp Ile Asp Val Asn Ser Ala Ile Ala Lys Glu
165 170 175
Phe Ile Lys Thr Thr Leu Glu Asp Met Val Lys His Gly Ala Asn Leu
180 185 190
Ile Arg Leu Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Val Asp Thr Asn
195 200 205
Asp Phe Phe Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Thr Leu Asn Glu Val Arg
210 215 220
Glu Ile Leu Thr Pro Leu Lys Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu
225 230 235 240
His Tyr Ser Ile Pro Lys Lys Ile Asn Asp His Gly Tyr Phe Thr Tyr
245 250 255
Asp Phe Ala Leu Pro Met Thr Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Lys
260 265 270
Thr Asn Gln Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe
275 280 285
Thr Thr Leu Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Arg Asp
290 295 300
Ile Leu Thr Asp Asp Glu Ile Asp Tyr Ala Ser Glu Gln Leu Tyr Lys
305 310 315 320
Val Gly Ala Asn Val Lys Lys Thr Tyr Ser Ser Ala Ser Tyr Asn Asn
325 330 335
Leu Asp Ile Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asn
340 345 350
Asp Asp Ala Ala Tyr Leu Leu Ser Arg Val Phe Gln Val Phe Ala Pro
355 360 365
Gly Ile Pro Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Glu Asn Asp
370 375 380
Ile Ala Leu Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His
385 390 395 400
Tyr Tyr Thr Arg Glu Glu Val Lys Ser Glu Val Lys Arg Pro Val Val
405 410 415
Ala Asn Leu Leu Lys Leu Leu Ser Trp Arg Asn Glu Ser Pro Ala Phe
420 425 430
Asp Leu Ala Gly Ser Ile Thr Val Asp Thr Pro Thr Asp Thr Thr Ile
435 440 445
Val Val Thr Arg Gln Asp Glu Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Leu Thr
450 455 460
Ala Asp Ala Ala Asn Lys Thr Phe Glu Ile Val Glu Asn Gly Gln Thr
465 470 475 480
Val Met Ser Ser Asp Asn Leu Thr Gln Asn
485 490
<210> 8
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Leu Asn Gln Lys Ile Gln Asn Pro Asn Pro Asp Glu Leu Met Ile
1 5 10 15
Glu Val Asp Leu Cys Tyr Glu Leu Asp Pro Tyr Glu Leu Lys Leu Asp
20 25 30
Glu Met Ile Glu Ala Glu Pro Glu Pro Glu Met Ile Glu Gly Leu Pro
35 40 45
Ala Ser Asp Ala Leu Thr Pro Ala Asp Arg Tyr Leu Glu Leu Phe Glu
50 55 60
His Val Gln Ser Ala Lys Ile Phe Pro Asp Ser Lys Thr Phe Pro Asp
65 70 75 80
Cys Ala Pro Lys Met Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Arg Tyr Arg Lys
85 90 95
Val Arg Arg His Arg Asp Phe Asp Leu Arg Lys Phe Val Glu Asn His
100 105 110
Phe Trp Leu Pro Glu Val Tyr Ser Ser Glu Tyr Val Ser Asp Pro Gln
115 120 125
Asn Ser Leu Lys Glu His Ile Asp Gln Leu Trp Pro Val Leu Thr Arg
130 135 140
Glu Pro Gln Asp His Ile Pro Trp Ser Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln
145 150 155 160
Ser Tyr Ile Val Pro Gly Gly Arg Phe Ser Glu Thr Tyr Tyr Trp Asp
165 170 175
Ser Tyr Phe Thr Met Leu Gly Leu Ala Glu Ser Gly Arg Glu Asp Leu
180 185 190
Leu Lys Cys Met Ala Asp Asn Phe Ala Trp Met Ile Glu Asn Tyr Gly
195 200 205
His Ile Pro Asn Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Leu Ser Arg Ser Gln Pro
210 215 220
Pro Val Phe Ala Leu Met Val Glu Leu Phe Glu Glu Asp Gly Val Arg
225 230 235 240
Gly Ala Arg Arg Tyr Leu Asp His Leu Lys Met Glu Tyr Ala Phe Trp
245 250 255
Met Asp Gly Ala Glu Ser Leu Ile Pro Asn Gln Ala Tyr Arg His Val
260 265 270
Val Arg Met Pro Asp Gly Ser Leu Leu Asn Arg Tyr Trp Asp Asp Arg
275 280 285
Asp Thr Pro Arg Asp Glu Ser Trp Leu Glu Asp Val Glu Thr Ala Lys
290 295 300
His Ser Gly Arg Pro Pro Asn Glu Val Tyr Arg Asp Leu Arg Ala Gly
305 310 315 320
Ala Ala Ser Gly Trp Asp Tyr Ser Ser Arg Trp Leu Arg Asp Thr Gly
325 330 335
Arg Leu Ala Ser Ile Arg Thr Thr Gln Phe Ile Pro Ile Asp Leu Asn
340 345 350
Ala Phe Leu Phe Lys Leu Glu Ser Ala Ile Ala Asn Ile Ser Ala Leu
355 360 365
Lys Gly Glu Lys Glu Thr Glu Ala Leu Phe Arg Gln Lys Ala Ser Ala
370 375 380
Arg Arg Asp Ala Val Asn Arg Tyr Leu Trp Asp Asp Glu Asn Gly Ile
385 390 395 400
Tyr Arg Asp Tyr Asp Trp Arg Arg Glu Gln Leu Ala Leu Phe Ser Ala
405 410 415
Ala Ala Ile Val Pro Leu Tyr Val Gly Met Ala Asn His Glu Gln Ala
420 425 430
Asp Arg Leu Ala Asn Ala Val Arg Ser Arg Leu Leu Thr Pro Gly Gly
435 440 445
Ile Leu Ala Ser Glu Tyr Glu Thr Gly Glu Gln Trp Asp Lys Pro Asn
450 455 460
Gly Trp Ala Pro Leu Gln Trp Met Ala Ile Gln Gly Phe Lys Met Tyr
465 470 475 480
Gly Asp Asp Leu Leu Gly Asp Glu Ile Ala Arg Ser Trp Leu Lys Thr
485 490 495
Val Asn Gln Phe Tyr Leu Glu Gln His Lys Leu Ile Glu Lys Tyr His
500 505 510
Ile Ala Asp Gly Val Pro Arg Glu Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Pro Leu
515 520 525
Gln Asp Gly Phe Gly Trp Thr Asn Gly Val Val Arg Arg Leu Ile Gly
530 535 540
Leu Tyr Gly Glu Pro
545

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达磷脂酶C；所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，还共表达目标蛋白；所述目标蛋白是胞内定位蛋白；所述胞内定位蛋白是在伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体后仍定位在细胞基质中的蛋白。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述目标蛋白包括蔗糖磷酸化酶，海藻糖酶。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述磷脂酶C与目标蛋白是以pETDuet-1为载体进行共表达；所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主。
5.构建权利要求2所述基因工程菌的方法，其特征在于，将编码磷脂酶C的基因和编码目标蛋白的基因分别连接到pETDuet-1表达载体的多克隆位点MCS1或MCS2上，得到重组表达质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述编码磷脂酶C的基因包括SEQ IDNO.4-6。
7.一种将胞内蛋白在胞外表达的方法，其特征在于，将磷脂酶C与目标蛋白在大肠杆菌中共表达；所述磷脂酶C的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述胞内蛋白是在伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体后仍定位在细胞基质中的蛋白。
9.一种生产胞外蛋白的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，离心，收集发酵上清液。
10.权利要求7-9任一所述方法在食品、生物、医药、化工领域生产蛋白类物质方面的应用。
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