CN111172138B

CN111172138B - 一种蛋白水解酶及其在蛋白肽生产中的应用

Info

Publication number: CN111172138B
Application number: CN202010093059.5A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 颜正飞; 秦琴
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: CN111172138A

Abstract

本发明公开了一种蛋白水解酶及其在蛋白肽生产中的应用，属于微生物技术领域以及发酵技术领域。本发明提供了一种来源于暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白水解酶，此蛋白水解酶酶解蛋白的能力强，将此蛋白水解酶以2400U/g_蛋白的添加量加入大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液中进行酶解，仅需酶解2h，即可使酶解上清液中小分子肽的含量高达74.81％。

Description

一种蛋白水解酶及其在蛋白肽生产中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白水解酶及其在蛋白肽生产中的应用，属于微生物技术领域以及发酵技术领域。

背景技术

大米是我国第一大粮食品种。大米蛋白则是国际公认的优质蛋白。与大豆蛋白、乳清蛋白等蛋白相比，大米蛋白的营养抑制因子含量少，无过敏反应，大米蛋白包含人体所需氨基酸且氨基酸配比合理，另外，大米蛋白的生物价远超大豆蛋白，可与虾及牛肉等的生物价相媲美，符合世界卫生组织(WHO)推荐的理想模式。

但是，大米蛋白由于含有较多谷蛋白，不易溶解，因此，目前，大米蛋白多用作动物饲料添加剂。为了提高大米蛋白的附加值，将其水解成短肽或氨基酸后，还可以制成营养价值更高的短肽或氨基酸营养液，作为高价值添加剂运用于保健品、饮料、化妆品等行业。高纯度的大米肽价格在10万/吨以上。

大米肽中，分子量小于1000Da的统称为“小分子肽”，小分子肽可被人体小肠迅速吸收，不仅不会引起营养过剩等副作用，而且，一些特定的小分子肽还具有独特的生理功能，例如，具有抗氧化能力(具体可见参考文献：Yan et al.,Food Chemistry,2015,179:290-295)、改善仔猪肠道菌群(具体可见参考文献：杨亚强.,南昌大学[M],2018)、具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性(具体可见参考文献：Wang et al.,LWT-Food SciTechnology,2017,75:93-99)以及具有抗癌活性(具体可见参考文献：Kannan et al.,TheOpen Bioactive Compounds Journal,2009,2:17-20)等，因此，小分子肽含量是大米肽品质的关键指标，提升大米肽中小分子肽的含量是提高其附加值和应用价值的有效途径之一。

目前，小分子肽的制备方法主要有酶解法、微生物发酵法、酸碱解法、化学合成法等，其中，酶解法是工业上可行，安全性高，而且绿色环保的一种方法。但是，现有的酶解法仍具有许多缺陷，例如，公开号为CN1102229643A的专利中所记载的制备方法可使所得大米肽产品中的小分子肽含量高达50％左右，但其在制备过程中需采用多种酶制剂协同酶解，并且，其需要使用中空纤维膜，这大大延长了大米肽产品的生产周期，增加了大米肽产品的工业生产成本；公开号为CN103440949A的专利则先采用粉碎、调浆、洗涤、调浆、反应、浓缩、脱水等步骤对大米米渣进行预处理，然后再采用多种蛋白水解酶协同处理经预处理的大米米渣，但是，此方法主要以预处理方式提高大米肽产品中的小分子肽含量，其酶解过程前后，大米肽产品中的小分子肽含量变化不显著，并且，此方法制备步骤繁琐、能耗大、加酶量大，不利于工业化进程。

因此，急需找到一种制备工艺简单、制备周期短、成本低且制备得到的大米肽中小分子肽含量高的制备大米肽的方法以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种制备工艺简单、制备周期短、成本低且制备得到的大米肽中小分子肽含量高的制备大米肽的方法。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种蛋白水解酶，其特征在于，所述蛋白水解酶为：

(a)由SEQ ID No.2或SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述蛋白水解酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.6所示。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-24a(+)质粒、pET-20b(+)质粒、pET-22b(+)质粒或pET-28a(+)质粒。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为真菌、细菌或动物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供了上述蛋白水解酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产蛋白肽方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白肽为大米肽。

在本发明的一种实施方式中，所述大米肽为分子量小于1000Da的小分子大米肽。

本发明还提供了一种生产蛋白肽的方法，所述方法为先将上述蛋白水解酶添加至含有蛋白的反应体系中进行酶解，得到含有蛋白肽的酶解液，然后将酶解液进行提取，得到蛋白肽。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白水解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述蛋白水解酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3或SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中含有金属离子。

在本发明的一种实施方式中，所述金属离子为Ca²⁺和/或Co³⁺。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，蛋白的浓度为5～50g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白水解酶在反应体系中的添加量为1000～3000U/g_蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，金属离子的浓度为100～1000mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述酶解的温度为温度为30～40℃、转速为150～200rpm、pH为7～8。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白为大米蛋白；所述蛋白肽为大米肽。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种来源于暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白水解酶，此蛋白水解酶酶解蛋白的能力强，将此蛋白水解酶以2400U/g_蛋白的添加量加入大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液中进行酶解，仅需酶解2h，即可使酶解上清液中小分子肽的含量高达74.81％。

(2)本发明提供了一种生产大米肽的方法，此方法通过使用来源于暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白水解酶，大大提高了大米肽中小分子肽的含量，将暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20发酵获得的发酵上清液以2400U/g_蛋白的添加量加入大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液中进行酶解，仅需酶解2h，即可使酶解上清液中小分子肽的含量高达74.81％。

(3)本发明提供了一种生产大米肽的方法，此方法仅需将来源于暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白水解酶加入含有大米蛋白的大米蛋白分散液中进行酶解，即可获得富含小分子肽的大米肽，制备工艺简单、制备周期短且成本低。

生物材料保藏

一种暗灰链霉菌(Streptomyces canus)，分类学命名为Streptomyces canusT20，已于2019年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019936，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1：暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的系统进化树。

图2：暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的菌落。

图3：编码蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20)的基因的核酸凝胶电泳图。

图4：温度对蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20)酶活的影响。

图5：pH对蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20)酶活的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的大米蛋白粉购自购自无锡金农生物科技有限公司；下述实施例中涉及的pET-24a(+)质粒购自TaKaRa公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109购自BBI公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21购自Novagen公司；下述实施例中涉及的其他试剂材料均购自于国药集团。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

富集培养基：大米蛋白粉1g/L。

分离培养基：大米蛋白粉1g/L、葡萄糖3g/L、琼脂15g/L。

发酵培养基：大米蛋白粉2.5g/L、磷酸二氢钠0.1g/L、磷酸氢二钠0.1g/L、硫酸镁0.05g/L、硫酸亚铁0.001g/L，pH 7.0。

NaCl耐受培养基：NaCl 0～10g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

蛋白水解酶酶活的测定：

标准曲线的绘制：称取一定量的对硝基苯胺用少量无水乙醇溶解，用pH为8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至终浓度为40μg/mL；以稀释后的对硝基苯胺溶液为母液，分别取1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、0μL母液，用浓度为50mM、pH为9.0的Tris-HCl缓冲液补齐至1000mL，配置成一系列浓度梯度的标准溶液(0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、22.0、24.0、26.0、28.0、30.0、32.0、34.0、36.0、38.0、40.0μg/mL)；以pH为8.0的Tris-HCl缓冲液为空白对照，在405nm波长处测定标准溶液的吸光度；以对硝基苯胺的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作出OD₄₀₅与对硝基苯胺浓度关系的线性图，即为酶活标准曲线；

酶活的测定：于1.5mL EP管中加入600μL浓度为50mM、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液和50μL待测液；将混合液置于60℃水浴中预热5min后，在混合液中加入50μL浓度为100mM的L-Leu-p-NA溶液，于60℃水浴中继续反应10min；反应结束后，将EP管完全置于冰中终止反应，并用酶标仪测定反应液在405nm波长下的吸光值；根据吸光值计算待测酶液中蛋白水解酶的酶活；

其中，酶活的计算公式为：

酶活(U/mL)＝OD₄₀₅×7×D/(K×10×0.5)；

酶活的定义为：在pH为8.0、温度为60℃的条件下，每分钟释放1μmol对硝基苯胺(p-nitroanilide)的所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。

大米肽分子量分布的测定：

取大米肽作为样品，加蒸馏水溶解成大米肽浓度为5mg/mL的溶液后，于12000rpm离心10min，取上清液200μL进行凝胶色谱分析；色谱条件如下：TSK gel G2000 SW_XL(7.8mm×30cm，Tosoh)；二极管阵列检测器，检测波长220nm；流动相：V(乙腈)：V(水)：V(三氯乙酸)＝10:90:0.1；柱温30℃；进样量：20μL；流速0.8mL/min；利用V2.0英谱凝胶色谱数据工作站进行数据分析。

实施例1：暗灰链霉菌T20的初筛

具体步骤如下：

以来源于江苏省无锡市滨湖区的面粉厂厂区内土壤为样本，称取10g样本加入90mL灭菌的富集培养基中，30℃、200rpm震荡培养48h，得到培养液；吸取10mL培养液加入新的90mL灭菌的富集培养基中，30℃、200rpm震荡培养48h，重复2次，得到富集液；将富集液用无菌水梯度稀释，得到梯度稀释液；分别取200μL稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的梯度稀释液涂布于分离培养基上，30℃下培养48h，挑选有透明圈的单菌落；挑取有透明圈的单菌落在LB固体培养基上划线，30℃下培养48h，重复多次，直至可在显微镜下观察到形态单一的菌体，得到纯化后的单菌落；将纯化后的单菌落点接种到分离培养基上，30℃下培养48h，选择透明圈较大的菌株(直径>20mm)，分别命名为T16、T20、T37、T39、T40、T53(菌株T16、T20、T37、T39、T40、T53的透明圈直径可见表1)。

表1菌株T16、T20、T37、T39、T40、T53的透明圈直径

菌株	透明圈直径(mm)
		T16	20
T20	25
		T37	20
T39	22
		T40	20
T53	21

实施例2：暗灰链霉菌T20的复筛

具体步骤如下：

挑取实施例1获得的菌株T16、T20、T37、T39、T40、T53的纯化后的单菌落分别接种至LB液体培养基中，30℃、200rpm震荡下培养24h，获得种子液；将种子液以5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，30℃、200rpm震荡培养48h至发酵液的OD₆₀₀＝1.2；将发酵液于12000rpm、4℃的条件下离心20min，获得发酵上清液；将大米蛋白粉按料液比10:1(w/v，g/L)溶解于蒸馏水，得到分散液；在分散液中加入发酵上清液使分散液中蛋白水解酶的终酶活为2400U/g_蛋白，40℃、150rpm恒温水浴摇床中反应2h后煮沸15min灭酶，得到酶解液；将酶解液于5000rpm的条件下离心20min，获得酶解上清液。

检测发酵上清液中蛋白水解酶的酶活(检测结果见表2)。

以加入经沸水浴处理20min后的发酵上清液的分散液作为空白对照，将酶解上清液经0.45μM滤膜过滤后通过凝胶色谱分析检测滤液中大米肽的分子量分布(检测结果见表3)。

由表2可知，菌株T20发酵获得的发酵上清液中蛋白水解酶的酶活最高，为1500U/mL。对获得的蛋白水解酶进行测序，发现其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

由表3可知，经菌株T20发酵获得的发酵上清液酶解的酶解上清液中小分子肽的含量最高，占总蛋白含量的70.3％。

表2菌株T16、T20、T37、T39、T40、T53发酵获得的发酵上清液中蛋白水解酶的酶活

菌株	蛋白水解酶的酶活(U/mL)
		T16	940
T20	1500
		T37	906
T39	1230
		T40	920
T53	1106

表3经菌株T16、T20、T37、T39、T40、T53发酵获得的发酵上清液酶解的酶解上清液中小分子肽和多肽的含量占总蛋白含量的比值

菌株编号	小分子肽(＜1000Da，％)	多肽(＞1000Da，％)
			空白对照	24.5	75.6
T16	41.2	56.2
			T20	70.3	29.19
T37	30.6	67.3
			T39	49.2	49.2
T40	51.6	47.1
			T53	60.3	38.4

实施例3：暗灰链霉菌T20的鉴定和保藏

具体步骤如下：

选取实施例2中获得的菌株T20，提取菌株T20的总DNA进行18S rDNA的扩增和测序(由无锡天霖生物科技有限公司完成，菌株T20的18S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，发现其18S rDNA序列与暗灰链霉菌(Streptomyces canus)DSM 40017的18S rDNA序列相似度高达98.3％，将与其相似度高的菌株构建系统进化树(具体可见图1)，结果显示菌株与暗灰链霉菌(Streptomycescanus)cfcc 3169同属于一个分支，将其命名为暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20。

将暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为：2019年11月15日，保藏编号为CCTCC NO:M 2019936，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

实施例4：暗灰链霉菌T20的培养和观察

具体步骤如下：

刮取一环实施例1获得的暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的纯化后的单菌落在LB固体培养基划线培养，30℃培养24h后，观察其菌落，发现其菌落呈白色(具体可见图2)。

刮取一环实施例1获得的暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的纯化后的单菌落接入pH为7.0的LB液体培养基中，分别于10～50℃恒温培养48h，发现其生长温度为20～45℃，最适温度30℃。

刮取一环实施例1获得的暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的纯化后的单菌落接入pH分别为3.0～10.0的LB液体培养基中于30℃恒温培养48h，发现其生长pH为6.0～8.0，最适pH为7.0。

刮取一环实施例1获得的暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的纯化后的单菌落接入分别含0～10g/LNCl的NCl耐受培养中，于pH为7.0、温度为30℃的条件下恒温培养48h，发现其可在含有0～5g/LNCl的NCl耐受培养中生长，且发现其在含有1g/LNCl的NCl耐受培养中生长最为旺盛。

实施例5：编码蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的基因的获取

具体步骤如下：

挑取实施例1获得的暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的纯化后的单菌落接种至LB液体培养基中，30℃下培养24h，获得种子液；将种子液以5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，28℃、200rpm震荡培养24h至菌液的OD₆₀₀＝1.2；取20mL菌液，于12000g、4℃的条件下离心20min，收集菌体沉淀A；在菌体沉淀A中加入20mL的溶菌酶缓冲液(10nMTris-HCl，pH 8.0)悬浮菌体，于12000g，4℃的条件下离心20min，收集菌体沉淀B；在菌体沉淀B中加入12.0mL溶菌酶缓冲液，得到重悬菌液；在重悬菌液中加入560μL浓度为20mg/mL的溶菌酶溶液，置于冰水浴中1h后转移至37℃水浴中温浴2h至重悬菌液粘稠，得到水浴后的重悬菌液；在水浴后的重悬菌液中加入0.82mL浓度为100mg/mL的EDTA溶液和60μL浓度为100mg/mL的蛋白酶K溶液，于52℃温浴1h，得到温浴后的重悬菌液；在温浴后的重悬菌液中加入15mL Tris-酚/氯仿/异戊醇(v/v/v＝25:24:1)，颠倒混匀至充分乳化，得到乳化后的重悬菌液；将乳化后的重悬菌液于12000g，4℃的条件下离心20min后取上清；在上清中加入2.0mLNaAc-HAc(pH 5.2，3.0M)缓冲液和17.0mL无水乙醇(贮于-20℃)，充分混匀，得到混合液；用枪头挑取混合液中的丝状DNA，转移至1.5mL离心管中，用70％乙醇洗涤2次，于12000g，4℃的的条件下微离心后取DNA沉淀A；将沉淀于12000g，4℃条件离心2min后取DNA沉淀B；将DNA沉淀B于无菌工作台风吹干燥后置于无菌去离子水中，于4℃放置30min溶解沉淀B，得到基因组DNA；设计引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得长度为1551bp、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的编码蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的基因(此基因的核酸凝胶电泳结果见图3)；

其中，引物如下：

上游引物：5’-TTGCACGCCTGCCGTTCGACGA-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物：5’-TCAGCGCTCGTGCACGTCATTC-3’(SEQ ID NO.5)。

实施例6：蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的重组表达

具体步骤如下：

实施例5获得的长度为1551bp、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的编码蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的基因含有编码信号肽的基因，通过SignalP-5.0去除编码信号肽的基因，获得长度为1431bp、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的编码蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的基因；以SMAP-R、SMAP-F为引物，通过PCR扩增在核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的编码蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的基因的N端添加酶切位点Nde I、C端添加酶切位点HindIII，获得目的基因(ScScpr)；将目的基因与pET-24a(+)质粒经Nde I、HindIII双酶切后用T4连接酶进行连接，获得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有40μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pET-24a(+)-Scpr；将重组质粒pET-24a(+)-Scpr转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组大肠杆菌BL21/pET-24a(+)-Scpr；

其中，引物如下：

SMAP-R：5’-CATATGGAATTCCCGCCGGCTACTCCCCCGGC-3’(SEQ ID NO.7)；

SMAP-F：5’-AAGCTTTCAGCGCTCGTGCACGTCATTC-3’(SEQ ID NO.8)。

将摇瓶培养8～12h后获得的重组大肠杆菌BL21/pET-24a(+)-Scpr菌液以5％(v/v)的接种量转接至100mL的LB液体培养基中，于37℃、200rpm摇床培养3h至OD₆₀₀＝0.8后添加IPTG至终浓度为0.4mM，于25℃、200rpm继续摇床培养20h，获得发酵液；将发酵液于8000rpm的条件下离心15min取沉淀；用pH 8.0Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀，获得重悬液；将重悬液用高压匀浆机于压力为800Bar的条件下破壁，得到破壁液；将破壁液于8000rpm的条件下离心15min取上清，此上清即为粗酶液。

检测粗酶液中蛋白水解酶的酶活，检测结果为：4000U/mL。对获得的蛋白水解酶进行测序，发现其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，与实施例2测得的序列(去除信号肽后)一致。

实施例7：蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的酶学性质研究

具体步骤如下：

1、最适温度

于1.5mL EP管中加入600μL浓度为50mM、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液和50μL实施例6获得的粗酶液，得到混合液；将混合液分别置于20、30、40、50、60、70、80℃水浴中预热5min后，在混合液中加入50μL浓度为100mM的Leu-pNA溶液反应10min；反应结束后，将EP管完全置于冰中终止反应。

用酶标仪测定反应体系在405nm波长下的吸光值，以酶活最高的为100％，计算其余温度下蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的相对酶活(检测结果见图4)。

由图4可知，蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的最适温度是60℃。

2、最适pH

于1.5mL EP管中加入600μL浓度为50mM、pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0的Tris-HCl缓冲液和50μL实施例6获得的粗酶液，得到混合液；将混合液置于60℃水浴中预热5min后，在混合液中加入50μL浓度为100mM的Leu-pNA溶液反应10min；反应结束后，将EP管完全置于冰中终止反应。

用酶标仪测定反应体系在405nm波长下的吸光值，以酶活最高的为100％，计算其余pH下蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的相对酶活(检测结果见图5)。

由图5可知，蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的最适pH为8.0。

3、底物特异性

于1.5mL EP管中加入600μL浓度为50mM、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液和50μL实施例6获得的粗酶液，得到混合液；将混合液置于60℃水浴中预热5min后，在混合液中分别加入50μL浓度为100mM的Leu-pNA(由无锡亚肽生物技术公司合成)溶液、Phe-pNA(由无锡亚肽生物技术公司合成)溶液、Lys-pNA(由无锡亚肽生物技术公司合成)溶液、Pro-pNA(由无锡亚肽生物技术公司合成)溶液反应10min；反应结束后，将EP管完全置于冰中终止反应。

用酶标仪测定反应体系在405nm波长下的吸光值，以酶活最高的为100％，计算使用其余底物时蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的相对酶活(检测结果见表4)。

由表4可知，蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)以Leu-pNA为底物时酶活最高，并且，蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)对其他类型的底物同样有较高酶活。

表4底物对蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)酶活的影响

底物	酶活(％)
		Leu-pNA	100
Lys-pNA	87.5
		Phe-pNA	56.64
Scpro-pNA	10.83

实施例8：金属离子对蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)酶活的影响

具体步骤如下：

于1.5mL EP管中加入600μL浓度为50mM、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液和50μL实施例6获得的粗酶液，得到混合液；将混合液置于60℃水浴中预热5min后，在混合液中加入50μL浓度为100mM的Leu-pNA溶液，并且，在混合液中分别加入终浓度为0.1mM的Cu²⁺、Ca²⁺、Co³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺反应10min；反应结束后，将EP管完全置于冰中终止反应。

用酶标仪测定反应体系在405nm波长下的吸光值，以未添加金属离子的反应体系的酶活为100％，计算添加不同金属离子时蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的相对酶活(检测结果见表5)。

由表5可知，Ca²⁺能有效提升蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的酶活。

表5金属离子对蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)酶活的影响

金属离子	酶活(％)
		无	100
Cu<sup>2+</sup>	69.78
		Ca<sup>2+</sup>	115.44
Co<sup>3+</sup>	104.03
		Zn<sup>2+</sup>	0
Mn<sup>2+</sup>	65.99
		Mg<sup>2+</sup>	98.21
Ni<sup>2+</sup>	70.47

实施例9：蛋白水解酶(来源于暗灰链霉菌T20)的应用

具体步骤如下：

将大米蛋白粉按料液比10:1(w/v，g/L)溶解于蒸馏水，得到分散液；在分散液中以2400U/mg_蛋白的添加量添加实施例6获得的粗酶液(以未经酶解的大米蛋白粉为空白对照，以购自夏盛公司的商业碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，以及购自安占美公司的商业风味酶、亮氨酸氨肽酶为对照组，对照组的酶添加量也均为2400U/mg_蛋白)，40℃、150rpm恒温水浴摇床中反应2h后煮沸15min灭酶，得到酶解液；将酶解液于5000rpm的条件下离心20min，获得酶解上清液，将酶解上清液冷冻干燥制得大米肽。

检测不同蛋白水解酶处理后获得的大米肽的分子量分布，检测结果见表6。

由表6可知，大米蛋白粉中的小分子肽含量仅占总蛋白含量的24.5％；而经来源于暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的蛋白水解酶处理后，大米肽中的小分子肽含量可占总蛋白含量的74.81％，远高于多种商业蛋白水解酶处理后的结果。可见，来源于暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的蛋白水解酶适合制备大米肽。

表6经不同蛋白水解酶酶解获得的大米肽中小分子肽和多肽的含量占总蛋白含量的比值

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种蛋白水解酶及其在蛋白肽生产中的应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1402

<212> DNA

<213> 暗灰链霉菌

<400> 1

attacacatg cagtcgaacg atgaaccact tcggtgggga ttagtggcga acgggtgagt 60

aacacgtggg caatctgccc ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg 120

gataccacta ccgcaggcat ctgtggtggt tgaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg 180

cggcctatca gcttgttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgacggg tagccggcct 240

gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 300

gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg 360

gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcgc aagtgacggt acctgcagaa 420

gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc 480

ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcac gtcgggtgtg aaagcccggg 540

gcttaacccc gggtctgcat tcgatacggg ctagctagag tgtggtaggg gagatcggaa 600

ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcggat 660

ctctgggcca ttactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 720

ctggtagtcc acgccgtaaa cggtgggaac taggtgttgg cgacattcca cgtcgtcggt 780

gccgcagcta acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa 840

aggaattgac gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcga 900

agaaccttac caaggcttga catacaccgg aaacaattag agataggtgc ccccttgtgg 960

tcggtgtaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1020

ccgcaacgag cgcaaccctt gtcctgtgtt gccagcaact ctttcgggag gttggggact 1080

cacaggagac cgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc 1140

ccttatgtct tgggctgcac acgtgctaca atggcaggta caatgagctg cgaaaccgtg 1200

aggtggagcg aatctcaaaa agcctgtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc 1260

atgaagtcgg agttgctagt aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg 1320

ccttgtacac accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc ggtggcccaa 1380

ccccttgtgg gagggagctt ag 1402

<210> 2

<211> 516

<212> PRT

<213> 暗灰链霉菌

<400> 2

Met His Ala Cys Arg Ser Thr Ile Val Pro Leu Arg Leu Gly Ala Phe

1 5 10 15

Val His Arg Arg Leu Ile Ala Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val

20 25 30

Leu Leu Ala Ile Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr Ser Pro Gly Ala Pro

35 40 45

Gly Ile Gly Asp Pro Tyr Tyr Pro Ala Tyr Gly Asn Gly Gly Tyr Asp

50 55 60

Val Ser His Tyr Asp Leu Arg Leu Lys Tyr Gln Pro Ala Thr Asp Arg

65 70 75 80

Leu Glu Gly Thr Ala Thr Leu Leu Ala Arg Thr Thr Gln Asp Leu Ser

85 90 95

Arg Phe Asn Leu Asp Phe Leu Leu Asp Val Ser Glu Val Arg Val Asn

100 105 110

Gly Val Lys Ala Ala Phe Thr Ala Ser Gly Glu His Glu Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Pro Lys Thr Pro Leu Ala Lys Gly Ala Ala Ala Thr Ile Val Val

130 135 140

Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Ser Lys Gln Ala Tyr Gly Phe Thr Ser

145 150 155 160

Trp His Arg Thr Pro Asp Gly Gly Val Gly Ala Asn Glu Pro Glu Ala

165 170 175

Ala Trp Trp Trp Phe Pro Ser Asn Asp His Pro Leu Asp Lys Ala Thr

180 185 190

Tyr Asp Val Ser Val Leu Val Pro Asp Gly Ser Gln Ala Ile Ser Asn

195 200 205

Gly Thr Leu Gln Ser Thr Ser Ser Arg Ala Gly Trp Thr Arg Phe Asn

210 215 220

Trp Arg Ser Asn Lys Pro Gln Ala Thr Tyr Leu Ala Thr Leu Ala Val

225 230 235 240

Gly Lys Phe Asp Ile Thr Thr Gly Arg Thr Glu Ser Gly Ile Pro Val

245 250 255

Val Asn Ala Tyr Ser Lys Asp Leu Gly Asp Asn Ala Gly Ala Ala Arg

260 265 270

Ala Ser Ile Glu Arg Thr Gly Glu Ile Ala Asp Trp Leu Ser Glu Tyr

275 280 285

Tyr Gly Pro Tyr Pro Tyr Asn Ala Leu Gly Gly Tyr Val Pro Asn Thr

290 295 300

Asn Thr Gly Tyr Ala Leu Glu Thr Gln Thr Arg Pro Phe Tyr Ser Pro

305 310 315 320

Arg Gln Phe Ala Gly Gly Ser Asn Val Ser Val Val Val His Glu Leu

325 330 335

Ala His Gln Trp Tyr Gly Asp Leu Val Ser Val Ala Gly Trp Lys Asp

340 345 350

Ile Trp Ile Asn Glu Gly Phe Ala Arg Tyr Ala Gln Trp Leu Trp Ser

355 360 365

Glu His Glu Asn Glu Gly Thr Ala Gln Glu Ile Ala Asp Tyr Val Tyr

370 375 380

Ala Ser His Pro Ala Asp Asp Pro Phe Trp Thr Val Lys Pro Gly Asp

385 390 395 400

Pro Gly Pro Glu Asn Gln Phe His Leu Ala Val Tyr Asp Arg Gly Gly

405 410 415

Leu Ala Leu Gln Ala Leu Arg Asn Glu Ile Gly Asp Asp Asp Phe Phe

420 425 430

Ala Ile Leu Lys Gly Trp Pro Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Asn Ala Thr

435 440 445

Val Ala Asp Phe Glu Lys Tyr Ala Glu Glu Val Ser Gly Gln Ser Leu

450 455 460

Ser Ala Leu Phe Asp Thr Trp Leu Phe Gln Pro Ser Lys Pro Ala Ala

465 470 475 480

Pro Ala Ala Ala Asp Ala Ser Ile Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gly Glu

485 490 495

Thr Pro Val Arg Pro Lys Ser Trp Lys Lys Ile Ala Ala Thr Asn Asp

500 505 510

Val His Glu Arg

515

<210> 3

<211> 1551

<212> DNA

<213> 暗灰链霉菌

<400> 3

ttgcacgcct gccgttcgac gattgtgccc ctacgacttg gagctttcgt gcaccgcaga 60

ctcatcgcgc ccggcgcact ggccgccgcg tccgtcctgc tggcgatccc ggcatcggcc 120

gccggctact cccccggcgc gccgggcatc ggcgacccct actacccggc ctacggcaac 180

ggcggatacg acgtctccca ctacgacctg cggctgaagt accagccggc cacggaccgg 240

ctggagggca cggcgaccct tctggcccgc accacgcagg acctgtcgcg gttcaacctg 300

gacttcctgc tcgatgtcag cgaggtgcgg gtcaacggcg tgaaggcggc gttcaccgcc 360

tccggggagc acgagctgga gatcacgccg aagaccccgc tggcgaaggg cgccgccgcg 420

acgatcgtcg tgcggtacag cggggtgccc tcgtcgaagc aggcgtacgg cttcaccagc 480

tggcaccgca ccccggacgg cggggtcggc gcgaacgagc ccgaggcggc ctggtggtgg 540

ttcccgagca acgatcatcc gctcgacaag gccacctacg acgtgtccgt actggttccg 600

gacggctccc aggccatctc caacggcacg ctccagtcga cgagttcacg ggcgggctgg 660

acccggttca actggcgctc caacaagccg caggccacct atctggcgac gctggccgtc 720

gggaagttcg acatcacgac cgggaggacc gagagcggca ttccggtcgt caacgcctac 780

agcaaggacc tcggggacaa cgcgggggcc gcgcgggcga gcatcgagcg gacaggagag 840

atcgccgact ggctgagcga gtactacggg ccgtacccgt acaacgcgct cggcgggtac 900

gtgccgaaca ccaacaccgg gtacgcgctg gagacgcaga cccggccgtt ctacagcccg 960

cggcagttcg cgggcgggtc caatgtgtcc gtggtcgtgc acgagctggc ccaccagtgg 1020

tacggcgacc tcgtctccgt cgccgggtgg aaggacatct ggatcaacga ggggttcgcg 1080

cggtacgccc agtggctgtg gtccgagcac gagaacgagg gcacggccca ggagatcgcg 1140

gactacgtgt acgcctcgca cccggccgac gacccgttct ggacggtgaa gcccggtgac 1200

cccgggccgg agaaccagtt ccacctcgcc gtctacgacc ggggcgggct ggccctgcag 1260

gcgctgcgca acgagatcgg ggacgacgac ttcttcgcga tcctgaaggg ctggccgcag 1320

aagtacgcgt acgggaacgc gacggtcgcc gacttcgaga aatacgccga ggaggtgtcc 1380

gggcagtcgc tgtcggcgct cttcgacacc tggctgttcc agccgtcgaa gccggccgcc 1440

ccggcggcgg cggacgcgtc catcgcgcgg gcggcggccg ccggggagac gccggtgcgg 1500

ccgaagtcgt ggaagaagat cgccgcgacg aatgacgtgc acgagcgctg a 1551

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgcacgcct gccgttcgac ga 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcagcgctcg tgcacgtcat tc 22

<210> 6

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccggctact cccccggcgc gccgggcatc ggcgacccct actacccggc ctacggcaac 60

ggcggatacg acgtctccca ctacgacctg cggctgaagt accagccggc cacggaccgg 120

ctggagggca cggcgaccct tctggcccgc accacgcagg acctgtcgcg gttcaacctg 180

gacttcctgc tcgatgtcag cgaggtgcgg gtcaacggcg tgaaggcggc gttcaccgcc 240

tccggggagc acgagctgga gatcacgccg aagaccccgc tggcgaaggg cgccgccgcg 300

acgatcgtcg tgcggtacag cggggtgccc tcgtcgaagc aggcgtacgg cttcaccagc 360

tggcaccgca ccccggacgg cggggtcggc gcgaacgagc ccgaggcggc ctggtggtgg 420

ttcccgagca acgatcatcc gctcgacaag gccacctacg acgtgtccgt actggttccg 480

gacggctccc aggccatctc caacggcacg ctccagtcga cgagttcacg ggcgggctgg 540

acccggttca actggcgctc caacaagccg caggccacct atctggcgac gctggccgtc 600

gggaagttcg acatcacgac cgggaggacc gagagcggca ttccggtcgt caacgcctac 660

agcaaggacc tcggggacaa cgcgggggcc gcgcgggcga gcatcgagcg gacaggagag 720

atcgccgact ggctgagcga gtactacggg ccgtacccgt acaacgcgct cggcgggtac 780

gtgccgaaca ccaacaccgg gtacgcgctg gagacgcaga cccggccgtt ctacagcccg 840

cggcagttcg cgggcgggtc caatgtgtcc gtggtcgtgc acgagctggc ccaccagtgg 900

tacggcgacc tcgtctccgt cgccgggtgg aaggacatct ggatcaacga ggggttcgcg 960

cggtacgccc agtggctgtg gtccgagcac gagaacgagg gcacggccca ggagatcgcg 1020

gactacgtgt acgcctcgca cccggccgac gacccgttct ggacggtgaa gcccggtgac 1080

cccgggccgg agaaccagtt ccacctcgcc gtctacgacc ggggcgggct ggccctgcag 1140

gcgctgcgca acgagatcgg ggacgacgac ttcttcgcga tcctgaaggg ctggccgcag 1200

aagtacgcgt acgggaacgc gacggtcgcc gacttcgaga aatacgccga ggaggtgtcc 1260

gggcagtcgc tgtcggcgct cttcgacacc tggctgttcc agccgtcgaa gccggccgcc 1320

ccggcggcgg cggacgcgtc catcgcgcgg gcggcggccg ccggggagac gccggtgcgg 1380

ccgaagtcgt ggaagaagat cgccgcgacg aatgacgtgc acgagcgctg a 1431

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catatggaat tcccgccggc tactcccccg gc 32

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagctttcag cgctcgtgca cgtcattc 28

<210> 9

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Gly Tyr Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ile Gly Asp Pro Tyr Tyr Pro

1 5 10 15

Ala Tyr Gly Asn Gly Gly Tyr Asp Val Ser His Tyr Asp Leu Arg Leu

20 25 30

Lys Tyr Gln Pro Ala Thr Asp Arg Leu Glu Gly Thr Ala Thr Leu Leu

35 40 45

Ala Arg Thr Thr Gln Asp Leu Ser Arg Phe Asn Leu Asp Phe Leu Leu

50 55 60

Asp Val Ser Glu Val Arg Val Asn Gly Val Lys Ala Ala Phe Thr Ala

65 70 75 80

Ser Gly Glu His Glu Leu Glu Ile Thr Pro Lys Thr Pro Leu Ala Lys

85 90 95

Gly Ala Ala Ala Thr Ile Val Val Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Ser

100 105 110

Lys Gln Ala Tyr Gly Phe Thr Ser Trp His Arg Thr Pro Asp Gly Gly

115 120 125

Val Gly Ala Asn Glu Pro Glu Ala Ala Trp Trp Trp Phe Pro Ser Asn

130 135 140

Asp His Pro Leu Asp Lys Ala Thr Tyr Asp Val Ser Val Leu Val Pro

145 150 155 160

Asp Gly Ser Gln Ala Ile Ser Asn Gly Thr Leu Gln Ser Thr Ser Ser

165 170 175

Arg Ala Gly Trp Thr Arg Phe Asn Trp Arg Ser Asn Lys Pro Gln Ala

180 185 190

Thr Tyr Leu Ala Thr Leu Ala Val Gly Lys Phe Asp Ile Thr Thr Gly

195 200 205

Arg Thr Glu Ser Gly Ile Pro Val Val Asn Ala Tyr Ser Lys Asp Leu

210 215 220

Gly Asp Asn Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Ile Glu Arg Thr Gly Glu

225 230 235 240

Ile Ala Asp Trp Leu Ser Glu Tyr Tyr Gly Pro Tyr Pro Tyr Asn Ala

245 250 255

Leu Gly Gly Tyr Val Pro Asn Thr Asn Thr Gly Tyr Ala Leu Glu Thr

260 265 270

Gln Thr Arg Pro Phe Tyr Ser Pro Arg Gln Phe Ala Gly Gly Ser Asn

275 280 285

Val Ser Val Val Val His Glu Leu Ala His Gln Trp Tyr Gly Asp Leu

290 295 300

Val Ser Val Ala Gly Trp Lys Asp Ile Trp Ile Asn Glu Gly Phe Ala

305 310 315 320

Arg Tyr Ala Gln Trp Leu Trp Ser Glu His Glu Asn Glu Gly Thr Ala

325 330 335

Gln Glu Ile Ala Asp Tyr Val Tyr Ala Ser His Pro Ala Asp Asp Pro

340 345 350

Phe Trp Thr Val Lys Pro Gly Asp Pro Gly Pro Glu Asn Gln Phe His

355 360 365

Leu Ala Val Tyr Asp Arg Gly Gly Leu Ala Leu Gln Ala Leu Arg Asn

370 375 380

Glu Ile Gly Asp Asp Asp Phe Phe Ala Ile Leu Lys Gly Trp Pro Gln

385 390 395 400

Lys Tyr Ala Tyr Gly Asn Ala Thr Val Ala Asp Phe Glu Lys Tyr Ala

405 410 415

Glu Glu Val Ser Gly Gln Ser Leu Ser Ala Leu Phe Asp Thr Trp Leu

420 425 430

Phe Gln Pro Ser Lys Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Asp Ala Ser Ile

435 440 445

Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gly Glu Thr Pro Val Arg Pro Lys Ser Trp

450 455 460

Lys Lys Ile Ala Ala Thr Asn Asp Val His Glu Arg

465 470 475

Claims

1.一种蛋白水解酶，其特征在于，所述蛋白水解酶为由SEQ ID No.2或SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的蛋白水解酶。

3.如权利要求2所述的一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2或3所述的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的重组质粒。

6.权利要求1所述蛋白水解酶或权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组质粒或权利要求5所述宿主细胞在生产蛋白肽方面的应用。

7.一种生产蛋白肽的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1所述的蛋白水解酶添加至含有蛋白的反应体系中进行酶解，得到含有蛋白肽的酶解液，然后将酶解液进行提取，得到蛋白肽。

8.如权利要求7所述的一种生产蛋白肽的方法，其特征在于，所述反应体系中含有金属离子。

9.如权利要求8所述的一种生产蛋白肽的方法，其特征在于，所述金属离子为Ca²⁺和/或Co³⁺。

10.如权利要求7-9任一所述的一种生产蛋白肽的方法，其特征在于，所述蛋白水解酶在反应体系中的添加量为1000～3000U/g蛋白。