CN115772510A - 一种环己烯甲酸酯水解酶突变体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种环己烯甲酸酯水解酶突变体及其制备方法与应用。本发明提供的环己烯甲酸酯水解酶突变体作为催化剂在不对称拆分手性环己烯甲酸酯制备手性环己烯甲酸的应用中，转化率适宜，光学纯度高(手性纯度达99%以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，收率高，成本低，易于工业放大。因此，本发明的环己烯甲酸酯水解酶突变体及其基因具有良好的工业应用开发前景。

Description

一种环己烯甲酸酯水解酶突变体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种环己烯甲酸酯水解酶突变体及其制备方法与应用，属于生物医药基因工程技术领域。

背景技术

(S)-3-环己烯-1-甲酸是新型口服抗凝药依度沙班的关键手性中间体。目前，狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应是合成该中间体的主要方法。但是该方法反应条件苛刻，步骤繁琐，收率低导致其生产成本较高。

近年来，环境友好型的生物酶水解拆分法颇受学术界和工业界关注。与化学法相比，酶法反应条件温和，选择性好，收率较高。目前，研究较多的水解酶拆分方法主要来源于两大类，其一是使用来源于动物的酯酶（主要是猪肝酯酶）拆分效果较好，可直接获得(S)-3-环己烯-1-甲酸（Tetrahedron Asymmetry, 2004, 15, 2057-2060）。但是该酶主要从动物中提取，若采用体外表达的方法，只能在Origami系列底盘菌中高效表达，该底盘菌无法实现高密度培养。其次，猪肝酯酶的表达需要分子伴侣，进一步增加猪肝酯酶体外表达难度，因此，动物来源的猪肝酯酶无法大规模应用。 其二酶是来源于微生物的水解酶，该类酶活力比动物来源的酯酶活力高，且能有在BL21(DE3)系列的大肠杆菌底盘菌种高效表达，且易于高密度放大培养。使用微生物来源的水解酶可将环己烯甲酸酯中的(R)-3-环己烯-1-甲酸酯水解而保留(S)-3-环己烯-1-甲酸酯，经NaOH进一步水解，便可获得(S)-3-环己烯-1-甲酸。因此，来源于微生物的水解酶法拆分在工业界应用具有更大的潜力。

目前，对于酶法拆分制备(S)-3-环己烯-1-甲酸酯的来源于微生物的水解酶研究比较有优势的酶是来源于微生物Acinetobacter sp. WCHAc010052（中国专利CN112813131B）和Acinetobacter sp. JNU9335（中国专利CN111778229B）的两种酶。与后者相比，来源于Acinetobacter sp. WCHAc010052的前者具有更高的活性。并且，根据专利CN112813131B的记载，发明人对酶进行了突变，获得了高活性突变体，且对其选择性未见显著影响。申请人经过研究发现，这两种不同的酶均需在水解转化率62%以上时，才能获得满足手性纯度要求的产物（>97%）。因此，尽管文献报道的酶的活性较高，但是其选择性较差，影响最终产品收率，从而影响最终的生产成本。因此，继续开发新的高选择性的环己烯甲酸酯水解酶突变体在工业化生产中依然具有实际意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对酶法拆分制备(S)-3-环己烯-1-甲酸酯对映选择性差的问题，提供一个来源于自然界酶突变得到的选择性更高的水解酶，并应用于3-环己烯-1-甲酸酯的拆分。

本发明以来源于Acinetobacter sp. WCHAc010052的水解酶VcHLA002为初始酶，基于Alphafold2蛋白结构建模和结构分析的方法，选取目标位点，进行定点饱和突变，最终获得高选择性的酶突变体。

包括如下步骤：

（1）评估自然界存在的酶的拆分效果

具体为合成来源于菌种Acinetobacter sp. WCHAc010052的水解酶VcHLA002，并对该酶进行酶活力和选择性测试：将合成的VcHLA002甘油菌，37℃培养，25℃表达后，在20℃的条件下，进行酶活力测试。结果表明：该酶具有较高的活性但是选择性较差。因此，需要进行突变获得更好选择性的酶；

（2）将该酶的氨基酸序列使用Alphafold2 进行结构建模与分析；

（3）将模型与目标原料进行对接测试，获得酶与原料结合的方式，并选取点进行引物合成（引物合成由生物公司完成）。选取的目标点为V133、D253和V257；

（4）拿到引物后，优化PCR条件，使用如下的条件进行基因扩增，获得PCR产物：

预变性：98℃ 3min

变性：98℃ 10s

退火：57℃ 15s

延伸：72℃ 3 min

延长：72℃ 5min

循环次数：30次

（5）将PCR产物转入感受态细胞中，涂布于含卡那霉素抗性平板后，37℃培养过夜，得到单克隆菌落。随后将单克隆分别挑至V133、D253和V257的96孔板中，37℃培养过夜，保菌，25℃诱导18小时后，离心获得突变的酶库；

（6）将突变库进行稀释处理后，加入磷酸盐缓冲液，再加入5ul原料，于15～30℃反应30～90min。所属缓冲液pH为5.0～9.0。反应后检测，挑取优势点进行重新培养后，经擎科生物进行测序。测序结果意外发现，与野生型酶相比D253V及D253M突变体对底物原料具有更好的选择性；

（7）将较好的突变体D253V与野生型酶同时重新培养表达后再次活力和选择性验证。分别称取150mg酶与3.0g产物于15～30℃反应，反应过程中，使用2M NaOH进行pH调节(pH 5.0～9.0)，结果表明突变体D253V的选择性优于野生型酶。

本发明一方面提供一种环己烯甲酸酯水解酶突变体，其氨基酸序列如序列号(ID): 4所示。

本发明所述的环己烯甲酸酯水解酶突变体是将序列号 (ID): 2所示氨基酸序列的第253位天门冬氨酸残基替换为缬氨酸残基后形成的新氨基酸序列的蛋白质。

本发明还提供一种编码环己烯甲酸酯水解酶突变体的基因，其核苷酸序列如序列号 (ID): 3所示。

本发明还提供一种重组表达载体，其包含上述核苷酸序列如序列号 (ID): 3所示的编码基因。

本发明还提供环己烯甲酸酯水解酶突变体的制备方法，该突变体由定点饱和突变得到，所述定点饱和突变的上游引物为：CTGACCGGCGCTNNKGTTGATTACGTT，下游引物为：AACGTAATCAACMNNAGCGCCGGTCAG。

本发明另一方面还提供环己烯甲酸酯水解酶突变体在催化3-环己烯-1-甲酸酯制备光学活性(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。

所述3-环己烯-1-甲酸酯的结构式如下所示：

，

其中R选自甲基、乙基、异丙基或丁基。

本发明的应用是采用环己烯甲酸酯水解酶突变体在缓冲液中将3-环己烯-1-甲酸酯消旋体中的(R)-3-环己烯-1-甲酸酯水解，得到(S)-3-环己烯-1-甲酸酯，然后在碱性条件下水解得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。所述缓冲液选自柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液；所述缓冲液pH为5～9。反应温度为15～30℃。

本发明实施例，环己烯甲酸酯水解酶突变体在缓冲液中将3-环己烯-1-甲酸酯消旋体中的(R)-3-环己烯-1-甲酸酯水解的过程中，需要用碱调节pH为5～9，调节pH所用的碱为0.5～5M NaOH、Na₂CO₃或者NaHCO₃。

本发明的有益效果：

本发明提供了一个来源于自然界酶突变得到的选择性更高的水解酶；本发明的水解酶突变体应用于3-环己烯-1-甲酸酯的拆分中，转化率适宜，光学纯度高(手性纯度达99%以上)，反应条件温和，环境友好，操作简便，收率高，成本低，易于工业放大。

附图说明

图1、VcHLA002蛋白结构模型。

图2、VcHLA002活性中心及对接结果。

图3、V133、D253和V257 PCR产物核酸电泳图。

图4、VcHLA002突变库。

具体实施方式

实施例1、合成来源于菌种Acinetobacter sp. WCHAc010052的水解酶VcHLA002

将序列号 (ID): 2中的氨基酸序列提交于生工生物工程(上海)股份有限公司进行大肠杆菌中密码子优化。确认优化结果后，进行基因序列合成，并将合成的基因拼接至pET28a载体上，转入大肠杆菌感受态中。经活化培养后，保存甘油菌。在实验室中将10 ul甘油菌转入含有4 ml 的LB培养基（含卡那霉素抗性）中， 37℃培养过夜后，转入含有200 mlLB培养基（含卡那霉素抗性）中，继续37℃培养OD600nm=0.6～0.8，然后向其中加入200 ul50 mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，25℃诱导培养过夜，8000 rpm 离心后收集到约1.0 g菌体（控干水分），即为制备的粗酶。

称取200 mg 菌体重悬于80 mL 200 mM 的磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液中（pH8.0），于20℃水浴中搅拌5 min 后，加入4.0g 原料3-环己烯-1-甲酸甲酯消旋体。反应过程中，使用2M NaOH水溶液维持pH为7.5～8.0。分别于反应70 min、100 min、130 min、180min取样200 uL，加入1 mL 甲醇中淬灭，过滤后使用LC/MS 检测转化率。另外，分别在各时间点取1 mL反应液加入1 mL 二氯甲烷萃取后，氮气吹干，送检分析(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的手性纯度，检测结果如表1所示。

表1

由表1可知，本实验合成的酶有较高的活力，但是存在明显的过度水解现象。理想情况下，在转化率在50%的条件下，(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的手性纯度应该接近100%。因此，本发明对该酶进行改造。

实施例2、基于Alphafold2的VcHLA002蛋白建模、活性位点解析及分子对接

通过对VcHLA002蛋白的氨基酸序列对比发现尚未存在明确的蛋白结构。Alphafold2是机器学习在AlphaGo应用后的又一成功模型，其在预测人类蛋白的结构成功率达到98%以上。因此，本发明将氨基酸序列提交至Alphafold2平台上进行结构建模，获得如附图1所示的蛋白质结构。对于水解酶，其多数包含GXSXG的催化结构（其中S为催化氨基酸丝氨酸，G为甘氨酸，X为可变氨基酸）和形成氧负离子中心的XGGG结构。在VcHLA002中，GXSXG位于199-203区域， XGGG位于127-129位。

然后，本发明将该蛋白结构与3-环己烯-1-甲酸甲酯进行对接（如附图2所示）。分析发现，原料中甲酯的结构位于活性中心的催化基团附近，而环己烯结构与V133、D253、V257、N329及L249点相互作用，改变这些点的大小及极性，可能导致底物在结合口袋中的结合方式，进而引起酶活性和选择性的变化。因此，在第一轮进化中，本发明选择部分与底物结合紧密的氨基酸进行定点饱和突变，具体氨基酸为V133、D253与V257。

实施例3、VcHLA002定点饱和引物设计及定点突变库的构建

确定目标点后，本发明设计如下引物：

V257-F：GCTGATGTTGATTACNNKACCGATTACTACGCT

V257-R：AGCGTAGTAATCGGTMNNGTAATCAACATCAGC

D253-F：CTGACCGGCGCTNNKGTTGATTACGTT

D253-R：AACGTAATCAACMNNAGCGCCGGTCAG

V133-F ：GGCTTCGTTNNKGGCGGTATGGATAGC

V133-R：GCTATCCATACCGCCMNNAACGAAGCC，

以实施例1中合成的质粒为模板，进行基因扩增。其中PCR条件为：

预变性：98℃ 3min

变性：98℃ 10s

退火：57℃ 15s

延伸：72℃ 3 min

延长：72℃ 5min

循环次数：30次

PCR 结束后，将产物进行核酸电泳检测（如附图3所示）。核酸电泳结果表明，PCR产物分子大小在4000-6000之间，与目标产物一致，表明PCR成功。将产物使用核酸酶消化后，化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中。涂布于含卡那霉素抗性平板后，37℃培养过夜，得到单克隆菌落（如附图4所示）。

将单克隆用灭菌的枪头挑取至96孔板中（每块平板挑取一块96孔板，共3块板），加入300 ul 含卡那霉素抗性的LB培养基，37℃培养（250 rpm）18 h。吸取100 uL菌液加入到350 uL的保菌板中，加入100 uL 30%灭菌甘油，-80℃冷冻保藏。剩余样品加入400 ul 含卡那霉素抗性的LB培养基，培养3 h后加入100 uL含卡那霉素抗性和IPTG的LB培养基，25℃（250 rpm）诱导培养18 h。然后4000 rmp离心20 min，控干水分后得到表达后的定点饱和突变库，冷冻供筛选使用。

实施例4、定点饱和突变库的筛选

取实施例3中的96孔板(V133、D253、V257)，加入200 ul 200 mM pH 7.0的磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液，重悬后取20 uL重悬菌体于新的96孔板中，加入180 uL 200 mMpH 8.0的磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液。加入5 uL 3-环己烯-1-甲酸甲酯消旋体，震荡后于20℃、250 rpm条件下反应50～55min。随后立即加入800 uL甲醇淬灭反应。离心后，送分析检测。并且申请人选取转化率大于50%的样品中所使用的对应位置的酶，重新培养后，进行测序，其中突变体D253板筛选部分结果及测序结果如表2所示。

表2

说明：由于孔板微量表达，会导致同一基因型的菌体量或蛋白表达量有差异，导致同一板上基因型的酶转化率有差异。但对于同一基因型酶而言，转化率与ee值是相对应的。

根据表2的结果可知：D253板的样品转化率较高和ee值存在不匹配关系。对于未突变的野生型酶（样品D11、D6），其转化率越高，对应的ee值应该越高。但是对于突变体D253C（样品B12），其转化率达到73.82%，但是ee(s)%仅为69.36%，表明该突变体会降低其选择性，属于不利突变。

野生型酶（样品D11）与突变体D253V（样品A12、A11、A2）转化率接近，但ee值却明显低于后三个样品，表明突变体D253V选择性拆分效果有显著提升。

野生型酶（样品D6）与突变体D253V（样品A4）也是转化率接近，但ee值远低于A4，进一步表明突变体D253V优于野生型酶。

此外，该位点的其他突变体，如D253M、D253G、D253T、D253I等也有明显优势，但是由于多个优势突变为D253V，在后续实验中，优先选择该突变体进行后续的实验验证。

实施例5、突变体VcHLA002_D253V和野生型酶VcHLA002_WT的重复表达与活力验证

吸取-80℃保存D253板中的A2及野生型甘油菌转入含有4 ml的LB培养基（含卡那霉素抗性）中，37℃培养过夜后，转入含有200 ml LB培养基（含卡那霉素抗性）中，继续37℃培养OD600nm=0.6～0.8，然后向其中加入200 ul 50 mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，25℃诱导培养过夜，8000 rpm离心后收集到约1.0 g菌体（控干水分），即为制备的粗酶。

分别称取150 mg突变体VcHLA002_D253V湿菌体和野生型酶VcHLA002菌体重悬于60 mL 200 mM 的磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液中（pH8.0），于20℃水浴中搅拌5 min后，加入3.0 g 原料3-环己烯-1-甲酸甲酯消旋体。反应过程中，使用2M NaOH水溶液维持pH为7.5～8.0。每30min取样200 uL，加入2 mL 甲醇中淬灭，过滤后使用LC/MS 检测转化率（转化率接近60%左右时，停止取样）。另外，分别在各时间点取1 mL反应液加入1 mL二氯甲烷萃取后，氮气吹干，送检分析(S) -3-环己烯-1-甲酸甲酯的手性纯度，结果如表3所示。

表3

实验结果表明：在此极少用酶量下，突变体VcHLA002_D253V短时间内产品可达到要求的手性纯度。同时，与野生型VcHLA002_WT相比，突变体在转化为约为55.5%时，手性纯度即可达到98.6%的手性纯度。而野生型酶在63.6%时，手性纯度只有96.2%。因此，突变体VcHLA002_D253V具有更优异的选择性。

实施例6、突变体VcHLA002_D253V催化不同酯的不对称拆分反应

采用突变体VcHLA002_D253V对不同的底物进行催化拆分，实验结果如表4所示。

表4

实验结果表明，突变体VcHLA002_D253V对3-环己烯-1-甲酸甲酯的拆分效果和活性较高。从结构上分析，改造后的酶活性空间更小，有利于控制小分子底物的手性。

实施例7、突变体VcHLA002_D253V的选择性水解放大实验

称取5 g突变体VcHLA002_D253V湿菌体重悬于500 mL 200 mM 的磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液中（pH8.0），于20℃水浴中搅拌5 min后，加入100 g 原料3-环己烯-1-甲酸甲酯消旋体。反应过程中，使用2M NaOH水溶液维持pH为7.5～8.0。每30min取样200 uL，加入2 mL 甲醇中淬灭，过滤后使用HPLC 测转化率。然后将检测后的样品送检手性。实验结果表明，转化率为53.81%时，(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的手性纯度为97.59%。反应结束后，使用100 mL 甲苯萃取2次后，合并甲苯相。

向上述(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的甲苯溶液中加入400 mL 甲苯、200 mL水以及15.4 g NaOH后，升温至75℃，反应4h，未检测到原料剩余，反应完毕。分液除去甲苯，水相体系用盐酸调pH至2～3后，用二氯甲烷萃取，脱溶得到产品(S)-3-环己烯-1-甲酸共计41.5g，两步总收率：41.5%，手性纯度：97.7%。

Claims (10)

1.一种环己烯甲酸酯水解酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如序列号 (ID): 4所示。

2.根据权利要求1所述的环己烯甲酸酯水解酶突变体，其特征在于，所述的环己烯甲酸酯水解酶突变体是将序列号 (ID): 2所示氨基酸序列的第253位天门冬氨酸残基替换为缬氨酸残基后形成的新氨基酸序列的蛋白质。

3.一种编码权利要求1或2所述的环己烯甲酸酯水解酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列号 (ID): 3所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求3所述的编码基因。

5.一种权利要求1或2所述的环己烯甲酸酯水解酶突变体的制备方法，其特征在于，突变体由定点饱和突变得到，

所述定点饱和突变的上游引物为：CTGACCGGCGCTNNKGTTGATTACGTT；

下游引物为：AACGTAATCAACMNNAGCGCCGGTCAG。

6.一种权利要求1或2所述的环己烯甲酸酯水解酶突变体在催化3-环己烯-1-甲酸酯制备光学活性(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述3-环己烯-1-甲酸酯的结构式如下所示：

，其中R选自甲基、乙基、异丙基或丁基。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用环己烯甲酸酯水解酶突变体在缓冲液中将3-环己烯-1-甲酸酯消旋体中的(R)-3-环己烯-1-甲酸酯水解，得到(S)-3-环己烯-1-甲酸酯，然后在碱性条件下水解得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述缓冲液选自柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液；所述缓冲液pH为5～9。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，反应温度为15～30℃。

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