CN115896050A - 7α-羟基类固醇脱氢酶末端改造组合点突变及高效合成熊去氧胆酸中间体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了7α‑羟基类固醇脱氢酶末端改造组合点突变及高效合成熊去氧胆酸中间体，属于基因工程和生物催化领域。本发明通过将7α‑羟基类固醇脱氢酶N末端氨基酸截短、结合口袋特定的氨基酸定点突变，获得了热稳定性和催化效率显著提高的突变体。最佳组合突变体ΔN53/M196I/I258M/K262T的酶活力提高约323倍，k_cat/K_m值比野生型提高267.04倍，T_m值提高了21.06℃，野生型催化50mM底物鹅去氧胆酸，反应需要48h，合成产物7‑氧代‑石胆酸的产率为84.4％。而突变体催化50mM底物鹅去氧胆酸，反应仅仅需要4h，合成产物7‑氧代‑石胆酸的产率高达97.1％。

Description

7α-羟基类固醇脱氢酶末端改造组合点突变及高效合成熊去氧胆酸中间体

技术领域

本发明涉及7α-羟基类固醇脱氢酶末端改造组合点突变及高效合成熊去氧胆酸中间体，属于基因工程和生物催化技术领域。

背景技术

鹅去氧胆酸(又名3α,7α-二羟基-5-β-胆烷酸)是一种含有2个羟基的类固醇，主要作用是降低胆汁内胆固醇的饱和度。7-氧代-石胆酸(又名3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸)是鹅去氧胆酸的还原产物，充当熊去氧胆酸(又名3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸)合成的中间体。熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸互为立体异构体，主要作用是治疗治疗胆结石、脂肪肝、胆汁性消化不良和预防新冠病毒等。

7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH，EC 1.1.1.159)是用于生产7-氧代-石胆酸的主要酶之一。7α-HSDH属于短链脱氢酶/还原酶。天然的7α-HSDH酶在催化合成7-氧代-石胆酸生产中效率低，酶的热稳定性较差。近年来，计算机辅助蛋白设计策略在提高蛋白催化效率、立体/区域选择性、稳定性方面做出了巨大的贡献。如通过结构指导的定点突变提高了亚胺还原酶对(R)-3-苄基氨基-1-Boc-哌啶的合成效率，催化效率比野生型提高了4193倍，T_m提高16.2℃，产物光学纯度从78％提高到99％。基于结构信息定点诱变的活性位点替换，Eiben等人为了增加CYP102A1的过程稳定性，将CYP102A1不稳定的还原酶结构域与稳定的CYP102A3结构域交换，获得了稳定性增强的嵌合融合蛋白，在50℃时半衰期为100分钟，比野生型CYP102A1提高10倍以上。热稳定性好的蛋白质通常具有更高的刚性，而柔性区域，如柔性残基、蛋白质链的N端和C端loop，与其它氨基酸的接触次数很少。因此截短、替换柔性环或引入点突变以增强柔性残基的刚性是提高稳定性的有效方法。Savino等人基于结构比对，分段截短了C.absonum 7β-HSDH的C末端片段，活性降低1000倍甚至失活。娄等人提出了C.absonum 7α-HSDH中的loop结构(残基194–211)与酶的热稳定性密切相关。

发明人筛选到一种来自Brucella melitensis的7α-HSDH，能够以鹅去氧胆酸为底物，以NAD⁺为辅酶，在碱性条件下稳定催化合成7-氧代-石胆酸。但是野生型酶催化稳定性和催化效率较低，导致生物制备过程中时间成本和经济成本较高，阻碍其工业化进程。本发明通过计算机辅助蛋白设计策略来研究末端修饰对蛋白表达、催化效率和热稳定性的影响。首先基于同源建模获得7α-HSDH的三维结构，结合蛋白功能的先验信息进行分子对接、动力学模拟分析蛋白末端的柔性变化。基于序列、结构特征，loop N无序区域进行分段截短，结合单点突变进行定向组合突变，并考察突变体对酶的表达、催化效率和热稳定性的影响。获得了酶催化效率与热稳定性显著提高的突变体，对于工业化制备7-氧代-石胆酸具有重要的研究意义。

发明内容

本发明人团队发现来自B.melitensis的7α-HSDH，能够以鹅去氧胆酸为底物，催化合成7-氧代-石胆酸，但是野生型酶稳定性和催化效率较低，导致生物制备过程中催化周期长，转化效率低。

本发明将来源于布鲁氏菌(B.melitensis)的7α-HSDH基因根据大肠杆菌密码子的偏好性进行密码子优化后，进行基因的化学合成。然后通过N-末端不同长度氨基酸截短和/或对酶底物结合口袋区域特定的氨基酸突变的组合，获得了催化效率与热稳定性明显提高的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，实现了7-氧代-石胆酸的高效合成。

本发明的来源于B.melitensis的7α-HSDH基因含有915bp碱基，本发明提供了针对大肠杆菌密码子偏好性进行优化得到的7α-HSDH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示基因编码的7α-HSDH包含有305个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短得到的；或，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位、第258位，第262位的一个或多个氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为以下(a)～(f)任一：

(a)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短得到的，命名为：ΔN53；

(b)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位甲硫氨酸突变为异亮氨酸得到的，命名为：ΔN53/M196I；

(c)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸得到的，命名为：ΔN53/I258M；

(d)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为：ΔN53/K262T；

(e)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的1～53位氨基酸进行截短，同时将第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为：ΔN53/I258M/K262T；

(f)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位甲硫氨酸突变为异亮氨酸，第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为：ΔN53/M196I/I258M/K262T。

本发明还提供了编码所述突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET-21apET-21a或pRSFDuet-1为表达载体。

本发明还提供了表达上述突变体、或携带上述基因、或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。

本发明还提供一种包含所述7α-HSDH突变体的编码基因或其重组表达载体的重组表达转化体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组表达转化体可通过本领域常规技术，将上述重组表达载体转化至相应宿主细胞中制得。

所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所编码的7α-HSDH基因能被有效表达即可。

本发明还提供了一种用于催化鹅去氧胆酸合成7-氧代-石胆酸的催化剂，所述催化剂为上述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，或采用上述重组细胞制备得到的含有7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的酶液或其冻干粉。

在本发明的一种实施方式中，所述的催化剂是以下形式中的任意一种：培养本发明所述的重组表达转化体，分离得到的含有所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的转化体细胞；或，培养本发明所述的重组表达转化体，分离得到的含有所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的粗酶液；或，培养本发明所述的重组表达转化体，分离得到含有所述7α-HSDH突变体的粗酶液，将所述粗酶液干燥得到的粗酶粉。其中，所述重组表达转化体的培养方法和条件为常规的方法和条件，针对不同的宿主体系，采用不同的优化条件，从而实现蛋白的高效表达。

本发明还提供了一种合成7-氧代-石胆酸的方法，所述方法为，将上述突变体，或采用上述重组细胞制备得到的突变体添加至含有底物鹅去氧胆酸、辅酶NAD⁺的反应体系中，催化制备得到7-氧代-石胆酸。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有pH 8.0～9.5的缓冲盐溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲盐溶液可以是本领域常规的任何缓冲液，只要其pH范围在8.0～9.5即可，比如磷酸钠、磷酸钾、Tris-HCl缓冲液、碳酸钠缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲盐溶液为pH为9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，缓冲液的浓度可以为0.05～0.2M。

在本发明的一种实施方式中，底物鹅去氧胆酸的浓度为2～50mM。

在本发明的一种实施方式中，反应温度为20～40℃。

在本发明的一种实施方式中，反应温度为30℃。

本发明还提供了一种合成7-氧代-石胆酸的方法，所述方法为，将含有突变体的重组菌和表达乙醇脱氢酶突变体的重组菌添加至含有缓冲液(pH 9.5)、鹅去氧胆酸、NAD⁺、乙醛溶液的反应体中进行反应，制备得到7-氧代-石胆酸。

在本发明的一种实施方式中，反应体系包括0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.5)、50mM鹅去氧胆酸、0.5mM NAD⁺、5mL乙醛溶液、10g·L^-1的E.coli/pET-21a-ΔN53/M196I/I258M/K262T重组菌、10g·L^-1的E.coli/pET-21a-ADH重组菌，在30℃，800r·min^-1搅拌反应48小时。

本发明还提供了上述突变体、或上述基因、或上述重组载体、或上述重组细胞在制备7-氧代-石胆酸或含有7-氧代-石胆酸的产品中的应用。

有益效果

(1)本发明以序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的7α-HSDH为母本，进行同源建模、分子对接获得复合体结构。为了研究loop区域对蛋白折叠和热稳定性的影响，应用50nsMD模拟分析7α-HSDH在N-末端、C-末端的柔性变化。通过同源序列、结构比对进行N-末端分段截短和C-末端定点突变，成功的实现了7α-HSDH催化效率、热稳定性的显著改变。在此基础上，通过酶活测定、圆二色谱检测、高压液相检测，获得催化效率提高的7α-HSDH突变体。与野生型相比，优选的突变体不仅可以高效催化鹅去氧胆酸，并且热稳定性得到了提高。

(2)本发明将7α-HSDH基因构建在质粒pET-21a中，并在Escherichia coli BL21(DE3)表达，粗酶液经His-Trap亲和层析柱纯化后得到纯酶。随着截短长度的增加，蛋白表达量逐步提高。通过优化酶活测定条件，在pH 9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中于30℃中测定比酶活。通过酶活测定，组合突变体ΔN53/M196I/I258M/K262T，酶活力提高约323倍，T_m值升高21℃。

(3)本发明的7α-HSDH为羟基类固醇脱氢酶用于不对称转化反应，合成熊去氧胆酸中间体7-氧代-石胆酸提供了新的途径，解决了鹅去氧胆酸代谢产物资源不能有效利用的问题，有助于降低制备生产熊去氧胆酸成本，为实现工业化生产奠定了坚实的研究基础。

附图说明

图1：N-末端截短蛋白的SDS-PAGE分析；M：蛋白分子量标准，CK：大肠杆菌细胞破碎液上清；1-4泳道：分别为WT、ΔN16、ΔN29、ΔN53蛋白在细胞中的表达情况；5-8泳道：分别为WT、ΔN16、ΔN29、ΔN53的蛋白纯化产物。

图2：组合突变的SDS-PAGE分析；M：蛋白分子量标准；1-6泳道：分别为WT、ΔN53/M196I、ΔN53/I258M、ΔN53/K262T、ΔN53/I258M/K262T和ΔN53/M196I/I258M/K262T蛋白纯化产物。

图3：Bm7α-HSDH与突变体ΔN53/M196I/I258M/K262T催化合成7-氧代-石胆酸的时间曲线。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的鹅去氧胆酸购自：百灵威有限公司。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(100μg·mL^-1)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

7α-HSDH酶活力的测定：

通过测定NADH在340nm的吸光度变化率，在30℃下测量7α-HSDH氧化CDCA的酶活力。酶活力测定标准：反应体积200μL，分别加入终浓度为100mM的Na₂CO₃-NaHCO₃(pH 9.5)、5mM的NAD⁺和5mM的CDCA，置于30℃金属浴孵育3min，加入适量的纯酶(10–200μM)，在Bio-Tek Cytation 5细胞成像多功能检测系统扫描340nm处吸光度的变化。

酶活力定义为：在上述条件下，每分钟催化生成1μmol的NADH的酶量定义为一个单位U。

酶活的计算公式为：酶活(U)＝EW×V×10³/(6220×0.5)；

比活的计算公式：比活(U·mg^-1)＝酶活(U)/蛋白量(mg)；

其中，EW：1min内340nm处吸光度的变化；V：反应液的体积(mL)；6220：摩尔消光系数(L·mol^-1cm^-1)；0.5：光程距离(cm)。

动力学参数的测定：

根据米氏方程v＝V_max×[S]/K_m+[S]，计算出酶对不同底物的K_m值。

其中，v：反应速率(U·mg^-1)；V_max：最大反应速率(U·mg^-1)；[S]：底物浓度(mM)；K_m：反应速度v达到一半1/2V_max时的底物浓度。

当底物浓度饱和时，V_max＝k_cat/[E]，计算出K_cat值。

其中，V_max：最大反应速率；Et：酶位点的浓度。

动力学参数测定：

总反应体积200μL，加入0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.5)，5.0mM NAD⁺，温度30℃保温2min，加入适量纯酶液测定不同底物浓度(0.1mM～5.0mM)下的比酶活。酶动力学曲线的拟合通过GraphPad软件实现，分别以底物浓度和比酶活为横、纵坐标，选择米氏方程模型进行非线性拟合，获得V_max值与K_m值，通过数据换算获得k_cat值与k_cat/K_m值(表3)。

CD测定

使用Jasco J720分光旋光计(Jasco，Inc.，Easton，MD)进行圆二色性(CD)测量。使用以下仪器设置(平均30次扫描)在磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中从190到250nm收集波长扫描数据：响应，1s；灵敏度为100毫米；速度为50nm min^-1。在20℃至80℃之间每3℃重复扫描一次。在50mM Na/K磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，蛋白质浓度约为0.01M，在220nm处记录了CD信号随温度升高的降低，计算不同蛋白的T_m值。

实施例1：7α-HSDH基因密码子优化及其合成

具体步骤如下：

(1)B.melitensis来源的7α-HSDH基因(NCBI的登录号为：MW202238)含有915bp碱基。参照大肠杆菌密码子偏爱性对7α-HSDH基因进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQID NO:1所示。

(2)在该基因的C端引入6个组氨酸标签基因，然后在两端分别加入BamH I和Xho I限制性酶切位点序列，最后与pET-21a连接，获得重组质粒pET-21a-7α-HSDH。

实施例2：7α-HSDH突变体基因和重组大肠杆菌表达体系的构建

(1)构建7α-HSDH突变体

采用全质粒PCR技术对7α-HSDH设计截短和/或定点突变，以重组质粒pET-21a-7α-HSDH为模板，设计引物序列，分别得到突变体：

N端末端截短16个氨基酸的ΔN16、N端末端截短29个氨基酸的ΔN29、N端末端截短53个氨基酸的ΔN53，N端末端截短61个氨基酸的ΔN61以及突变体：N端末端截短53个氨基酸的ΔN53同时将第196位突变为异亮氨酸ΔN53/M196I、N端末端截短53个氨基酸的ΔN53同时将第258位突变为甲硫氨酸ΔN53/I258M、N端末端截短53个氨基酸的ΔN53同时将第262位突变为苏氨酸ΔN53/K262T、N端末端截短53个氨基酸的ΔN53同时将将第258位突变为甲硫氨酸，第262位突变为苏氨酸ΔN53/I258M/K262T、N端末端截短53个氨基酸的ΔN53同时第196位突变为异亮氨酸，第258位突变为甲硫氨酸，第262位突变为苏氨酸ΔN53/M196I/I258M/K262T；

其引物设计如表1所示。

表1：构建突变体引物设计表

注释：下划线表示突变位点。

PCR扩增体系：DNA聚合酶25.0μl，上游引物(10pmol·μl^-1)1.0μl，下游引物(10pmol·μl^-1)1.0μl，模板1.0μl，ddH₂O 22.0μl；

PCR扩增条件：预变形：98℃30s；变性：98℃10s；退火：55℃15s；延伸：72℃60s；后延伸：72℃10min；保存：4℃。

PCR扩增结束后，将扩增产物用Dpn I在37℃条件下消化2h去除模板质粒，消化产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂平板、挑单菌落试管培养，测序验证突变体序列。

(2)重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)：

在每管100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入步骤(1)得到的10μL PCR产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却3min。每管中加入700μL LB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000×g离心2min，弃上清700μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50μg·mL^-1氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

(3)阳性克隆的选择：

挑取4个克隆，转接入装有5mL的含有100μg·mL^-1氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养8h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)提取质粒。

用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2μL，质粒DNA 5μL，Bam H I 0.5μL，Xho I 0.5μL，ddH₂O将体系补足20μL。

分别获得阳性克隆：E.coli/pET-21a-ΔN16、E.coli/pET-21a-ΔN53、E.coli/pET-21a-ΔN29、E.coli/pET-21a-ΔN61、E.coli/pET-21a-ΔN53/M196I、E.coli/pET-21a-ΔN53/I258M、E.coli/pET-21a-ΔN53/K262T、E.coli/pET-21a-ΔN53/I258M/K262T、E.coli/pET-21a-ΔN53/M196I/I258M/K262T。

同时，按照上述方法制备得到含有野生型酶的重组菌：E.coli/pET-21a-7α-HSDH。

实施例3：重组菌的诱导表达培养

具体步骤如下：

(1)分别挑取实施例2制备得到的含有突变体的阳性克隆及含有野生型酶的单菌落接种于10mL含100μg·mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

(2)取10mL步骤(1)得到的培养液转接于1L含100μg·mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6～0.8，制备得到培养物；向培养物中加入终浓度为0.1mM的异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷，在25℃下进行诱导培养12h。

(3)诱导培养结束后，分别将培养液于6,000×g离心10min收集重组大肠杆菌细胞并用生理盐水洗涤三次后收集。

实施例4：重组蛋白的纯化

利用His-Trap HP affinity column纯化重组蛋白：

(1)分别称取2g实施例3收集得到的湿菌体，加入适量20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液悬浮细胞，于冰浴中进行超声破碎(工作2s，间隔3s，工作时间10min)。4℃条件下12,000rpm离心30min收集上清液作为粗酶液。

(2)利用Cytiva公司生产的His-Trap亲和层析分别对上述粗酶液进行纯化，纯酶液超滤脱盐后用于酶活测定。

分别制备得到含有野生型酶WT的纯酶液、含有ΔN16的纯酶液、含有ΔN29的纯酶液、含有ΔN53的纯酶液、含有ΔN61的纯酶液、含有ΔN53/M196I的纯酶液、含有ΔN53/I258M的纯酶液、含有ΔN53/K262T的纯酶液、含有ΔN53/I258M/K262T的纯酶液、含有ΔN53/M196I/I258M/K262T的纯酶液，其蛋白的SDS-PAGE分析图如图1～2所示。

结果显示，纯化的野生型显示出三条主条带，ΔN16显示为两条相近的条带，ΔN29、ΔN53以及截短组合突变均显示为单一条带(图1和图2)。表明全长蛋白的N末端无序结构可能干扰了Bm7α-HSDH的正确折叠，从而影响了蛋白表达

实施例5：比酶活测定

分别检测实施例4得到的野生型酶与突变体酶对鹅去氧胆酸比酶活，结果如下表所示。

表2野生型与突变型的比酶活比较

注释：--表示未检测到；本发明的突变体命名方式：采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如I258A，表示位置258的氨基酸由亲本7α-HSDH的甲硫氨酸Ile替换成丙氨酸Ala，位置的编号对应于亲本7α-HSDH的氨基酸序列的相应位点。

结果显示，如表3所示，截短突变体中，单突变体ΔN53的比酶活相对于野生型呈现显著性提高，其他突变体比酶活显示不同程度的降低。

将优势截短突变体与单点突变体进行组合突变，最终筛选得到了比酶活显著提高的ΔN53/M196I、ΔN53/I258M、ΔN53/K262T、ΔN53/I258M/K262T、ΔN53/M196I/I258M/K262T。结果表明，N-末端柔性区域截短与196、258、262位点突变的组合重塑了底物结合通道，改善了酶与鹅去氧胆酸的结合与催化。

实施例6：动力学参数测定

动力学参数测定：总反应体积200μL，加入0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.5)，5.0mM NAD⁺，温度30℃保温2min，加入适量纯酶液测定不同底物(0.1mM～5.0mM)下的比酶活。计算出7α-HSDH野生型与突变体的k_cat、K_m、k_cat/K_m(表3)。

表3野生型与突变型的动力学参数

^a n.d.代表未检测到活性；

如表3所示，与野生型相比，ΔN53、ΔN53/M196I、ΔN53/I258M、ΔN53/K262T、ΔN53/I258M/K262T以及ΔN53/M196I/I258M/K262T对底物的k_cat/K_m值呈现明显的提高，显著提高鹅去氧胆酸合成7-氧代-石胆酸的催化效率。

实施例7：CD测定

通过对实施例4得到的突变体酶及野生型的酶热稳定性进行表征，得到了热稳定性和催化效率同时提高的突变体，作为工业转化合成7-氧代-石胆酸的优良酶。

使用Jasco J720分光旋光计(Jasco，Inc.，Easton，MD)进行圆二色性(CD)测量。计算不同蛋白的T_m值(表4)。

表4：7α-HSDH野生型与优势突变体的热稳定性分析

如表所示，相对于野生型，ΔN53、ΔN53/M196I、ΔN53/I258M、ΔN53/K262T、ΔN53/I258M/K262T以及ΔN53/M196I/I258M/K262T的T_m值均得到改善，结合实施例6，ΔN53/M196I/I258M/K262T同时表现为热稳定性和催化效率的最大提高。

实施例8：7α-HSDH催化合成7-氧代-石胆酸

具体步骤如下：

全细胞反应体系在500mL生物反应器中进行，将酿酒酵母来源的乙醇脱氢酶(S.cerevisiae ADH)引入到反应中，构建辅酶循环体系。

(1)构建重组菌株：

选择酿酒酵母来源的乙醇脱氢酶(UniProtKB条目P00330)，由安升达有限公司(中国苏州)进行密码子优化、化学合成，克隆在表达质粒pET21a中，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株E.coli/pET-21a-ADH。

所述乙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述乙醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

(2)反应体系包括0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.5)、50mM鹅去氧胆酸、0.5mMNAD⁺、5mL乙醛溶液、10g·L^-1的E.coli/pET-21a-ΔN53/M196I/I258M/K262T重组菌、10g·L^-1的E.coli/pET-21a-ADH重组菌，在30℃，800r·min^-1搅拌反应48小时；

通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为9.5，12小时内间歇取样检测反应转化率。用2M的NaOH调节pH至10–11终止反应，用等体积的乙腈萃取三次，萃取液混合，然后旋转蒸发浓缩至有结晶析出，抽滤后除去溶剂，烘干至恒重，通过HPLC进行检测。液相柱为Waters XBridge C18反向色谱柱(5μm,4.6×250mm)，检测波长195nm，流速1mL min^-1，柱温30℃，流动相配比(v:v)：乙腈：0.1％磷酸水溶液＝60：40。

同时，以含有野生型的重组菌E.coli/pET-21a-7α-HSDH作为对照，按照上述步骤进行反应。

结果显示：

通过测定野生型酶7α-HSDH和组合突变体ΔN53/M196I/I258M/K262T催化合成7-氧代-石胆酸发现，在100mL的全细胞反应体系中(图3)。

采用生物反应器分别催化20mM底物鹅去氧胆酸，野生型菌株在48h后合成产物7-氧代-石胆酸的产率达到99.0％，组合突变菌株在4h达到最大产率99.7％。

采用生物反应器分别催化50mM底物鹅去氧胆酸，野生型菌株在48h后合成产物7-氧代-石胆酸的产率为84.4％，组合突变菌株在4h达到最大产率97.1％。

因此，最佳组合突变ΔN53/M196I/I258M/K262T显著改善了酶的稳定型和提升了酶的催化功能，转化时间由48h缩短至4h。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短得到的；

或，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位、第258位，第262位的一个或多个氨基酸进行突变得到的。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为以下(a)～(f)任一：

(a)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短得到的；

(b)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位甲硫氨酸突变为异亮氨酸得到的；

(c)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸得到的；

(d)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的第1～53位氨基酸进行截短，同时将第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的；

(e)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的1～53位氨基酸进行截短，同时将第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的；

(f)将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶氨基酸N末端的1～53位氨基酸进行截短，同时将第196位甲硫氨酸突变为异亮氨酸，第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pET-21a或pET-28a为表达载体。

6.表达权利要求1或2所述的突变体、或携带权利要求3所述的基因、或携带权利要求4或5所述的重组载体的重组细胞。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。

8.一种用于催化鹅去氧胆酸合成7-氧代-石胆酸的催化剂，其特征在于，所述催化剂为权利要求1或2所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，或采用权利要求6或7所述重组细胞制备得到的含有7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的酶液或其冻干粉。

9.一种合成7-氧代-石胆酸的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1或2所述的突变体，或采用权利要求6或7所述重组细胞制备得到的突变体添加至含有底物鹅去氧胆酸、辅酶NAD⁺的反应体系中，催化制备得到7-氧代-石胆酸；优选的，反应体系中还含有pH为9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；所述底物鹅去氧胆酸的浓度为1～50mM，反应温度为20～40℃。

10.权利要求1或2所述的突变体、或权利要求3所述的基因、或权利要求4或5所述的重组载体、或权利要求6或7所述的重组细胞在制备7-氧代-石胆酸或含有7-氧代-石胆酸的产品中的应用。

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