CN110628800A - 一种手性醇高效生产重组菌的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于不对称合成技术领域，尤其涉及一种手性醇高效生产重组菌的构建方法及其在手性醇合成中的应用。技术方案包括：在大肠杆菌中引入来源于枯草芽孢杆菌168的yueD基因表达羰基还原酶BsCR；利用pET28a‑yfjB过表达NAD激酶提高胞内内源性NADP+的含量提高辅酶总供应量，同时引入来源于枯草芽孢杆菌168的NADP+依赖型甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶改造大肠杆菌EMP途径并提高NADPH再生效率。在两种技术手段的共同作用下，胞内NADPH含量提高到了原来的2.34倍。该生物催化剂用于S‑苯乙醇的合成，结果表明产率提高了3.78倍。并在对一系列手性醇的合成中表现出优秀的性能。

Description

一种手性醇高效生产重组菌的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于不对称合成技术领域，尤其涉及一种手性醇高效生产重组菌的构建方法及其在手性醇合成中的应用。
背景技术
手性醇是在化合物手性碳原子上具有羟基的一类化合物，是合成手性药物、手性农药以及很多化学化工材料的重要中间体，在医药及化工领域占有重要位置。
手性醇可以通过化学法和生物法合成。化学合成法一般需要高温高压等严苛的条件、采用大量的有机试剂，环境污染严重、制备过程复杂等问题，更重要的是化学方法得到的产物的对映体选择性低。因此，近年来利用微生物细胞生物催化制备手性醇受到了越来越多的关注。其中，微生物细胞（起催化作用的为羰基还原酶）作为一种可高选择性的催化前手性羰基化合物合成手性醇的生物催化剂，在制备光学活性手性化合物领域已取得了一定的成就。但辅酶NADPH是羰基还原酶催化合成手性醇必需辅酶。在羰基还原酶催化前手性羰基化合物合成手性醇的生物反应中就需要消耗大量的NADPH。然而，NADPH价格昂贵、稳定性差，工业生产过程中通过外源添加NADPH以维持反应的进行是不现实的。因此，内源性NADPH的浓度和再生效率是限制生物催化羰基不对称还原合成手性醇速率的关键因素。
目前，主要是通过偶联葡糖糖脱氢酶、甲酸脱氢酶等反应以提高胞内辅酶NADPH的再生效率，存在辅酶总供给不足，再生效率低等问题。如何提高辅酶总供给量与内源再生效率是生物催化合成手性醇急需解决的关键技术问题。此外，催化羰基还原的高效还原酶是该技术的另一关键技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种手性醇高效生产重组菌的构建方法及其应用。包括在大肠杆菌中引入高效羰基还原酶，同时改造大肠杆菌NADPH代谢途径构建手性醇高效生产菌，并利用构建的重组菌作为生物催化剂催化前手性羰基化合物不对称还原合成手性醇。
本发明是这样实现的，一种手性醇高效生产重组菌的构建方法，A1：在大肠杆菌中引入高效羰基还原酶基因yueD表达系统，所述yueD基因的GeneID为936558；
A2：利用pET28a-yfjB过表达NAD激酶基因yfjB，同时通过引入依赖NADP+的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapB改造重组大肠杆菌EMP途径，所述yfjB基因的GeneID为947092，gapB基因的GeneID为937393。
进一步，包括以下步骤：
S1：获取羰基还原酶基因yueD和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapB片段；所述gapB基因的GeneID为937393，所述yueD基因的GeneID为936558；
S2：将步骤S1中获得的yueD和gapB片段插入共表达载体，获得含有yueD和gapB片段的重组质粒；
S3：将步骤S2中获得重组质粒导入表达宿主菌，得到重组菌。
进一步，还包括获取NAD激酶基因yfjB片段，所述yfjB基因的GeneID为947092；并将所述yfjB片段插入表达载体，将含有yfjB片段的表达载体导入步骤S3中获得的重组菌中。
进一步，步骤S1中，所述羰基还原酶基因yueD来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (strain 168)。
进一步，步骤S1中，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapB来源于Bacillus subtilis (strain 168)。
进一步，所述NAD激酶基因yfjB来源于大肠杆菌E. coli K-12 MG1655。
进一步，步骤S2中所述共表达载体为pETDuet-1。
进一步，步骤S3中所述表达宿主菌为大肠杆菌E. coli BL21(DE3)。
进一步，步骤S4中所述NAD激酶基因yfjB片段的表达载体为pET-28a。
一种利用如上所述的手性醇高效生产的重组菌的构建方法构建的重组菌在催化还原羰基化合物合成手性醇中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明构建了含羰基还原酶基因（yueD）的重组大肠杆菌，实现了手性醇的生物催化合成。同时通过表达外源NDADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶对EMP途径进行调控，提高了NADPH的再生效率。进一步的，通过过表达NAD激酶增加内源性NADP+的胞内含量，从而为生物催化反应提供了充足的NADPH。本发明利用该方法构建的含羰基还原酶与辅酶NADPH再生体系偶联系统的重组工程菌E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD&pET-28a-yfjB，其胞内辅酶NADPH含量得到了很大的提高，将其应用于苯乙酮的催化转化过程，产物S-苯乙醇的产率也得到了很大的提升。进一步的，将重组菌E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD&pET-28a-yfjB应用于一系列前手性羰基化合物，如乙酰乙酸乙酯，4-氯乙酰乙酸乙酯，2- 羟基苯乙酮，α-氯苯乙酮，2'-氟苯乙酮，3'-氟苯乙酮，4'-氟苯乙酮，2,2,2-三氟苯乙酮的催化转化，产物对映体过量值（e.e.值）为97~99%，产率为45~99%。本发明建立了一套高效的辅酶NADPH再生系统，大幅度的提升了重组菌不对称催化活性。该辅酶NADPH再生系统的成功应用避免了昂贵的辅酶NADPH在生物催化转化过程中的添加，为生物催化的工业化进程减少了阻碍。
附图说明
图1是NADPH再生调控系统及催化还原羰基化合物的流程结构图；
图2是目的基因yueD，gapB和yfjB片段PCR扩增产物检测图；
泳道M：1500 bp DNA Marker，泳道1：目的基因yueD片段，泳道2：目的基因gapB片段，泳道3：目的基因yfjB片段；
图3是重组质粒pETDuet-1-gapB-yueD图；
图4是重组质粒双酶切检测图；
A：泳道M：5000 bp DNA Marker，泳道1：重组质粒pETDuet-1-yueD双酶切处理产物；
B：泳道M：5000 bp DNA Marker，泳道1：重组质粒pETDuet-1-gapB-yueD双酶切处理产物；
C：泳道M：5000 bp DNA Marker，泳道1，2：重组质粒pET28a-yfjB双酶切处理产物；
图5是重组质粒pET-28a-yfjB图；
图6是重组蛋白的SDS-PAGE检测图；
泳道M：蛋白质Marker，泳道1：菌E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1的破胞上清液，泳道2：菌E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1-yueD的破胞上清液，泳道3：菌E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD的破胞上清液，泳道4：菌E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD&pET28a-yfjB的破胞上清液；
图7是胞内甘油醛-3-磷酸脱氢酶和NAD激酶酶活检测结果，以及酶活变化对NADPH含量的影响结果图；
a: E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1-yueD；
b: E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD；
c: E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD&pET28a-yfjB；
图8是重组菌催化苯乙酮不对称还原结果；
A：E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1-yueD；
B：E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD；
C：E. coli BL2l (DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD&pET28a-yfjB。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种手性醇高效生产重组菌的构建方法及其应用，NADPH再生调控系统及催化还原羰基化合物的流程结构图见图1。技术思路为：以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，通过基因工程手段引入羰基还原酶基因yueD赋予其对羰基化合物的还原能力；引入NADPH依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因gapB实现对EMP途径的调节；引入NAD激酶(NADK)基因yfjB提高胞内内源性NADP+的含量。本发明中涉及的羰基还原酶（BsCR）基因yueD来源于枯草芽孢杆菌168，含有732 bp碱基，GeneID为936558。甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapB来源于枯草芽孢杆菌168，Bacillus subtilis (strain 168)，含有1023 bp碱基，GeneID为937393。NAD激酶基因yfjB来源于大肠杆菌MG1655，含有879 bp碱基，GeneID为947092。
具体实验方案如下各实施例所示，下列各实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，《分子克隆：实验室指南》（New York: Cold Spring Harbor laboratoryPress, 2001)中所述的条件进行。
实施例1：羰基还原酶基因yueD，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapB和NAD激酶基因yfjB的克隆
将大肠杆菌E. coli K-12 MG1655（公知公用）和购自中国典型培养物保藏中心的菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (strain 168)复苏并培养，后收集菌体用作基因组DNA的提取。采用传统CTAB/NaCl法提取全基因组DNA。以提取到的基因组DNA为模版进行PCR扩增目的基因yueD，gapB和yfjB，根据目的基因和质粒载体序列在Primer Premier5软件中设计引物。上游引物 YueD-F：GGGAATTCCA↓TATGGAACTTTATATCATCACCGGAG（SEQ ID NO.1，下划线为Nde I酶切位点），和下游引物YueD-R：CCGC↓TCGAGCAAAAACTCTTTAATATCATAAATGCG（SEQID NO.2，下划线为Xho I酶切位点）用于扩增yueD基因；上游引物 GapB-F：CCGG↓ AATTCGATGAAGGTAAAAGTAGCG（SEQ ID NO.3，下划线为EcoR I酶切位点），和下游引物GapB-R：CCCA↓AGCTTTTATACAGCAGACGG（SEQ ID NO.4，下划线为Hind III酶切位点）用于扩增gapB基因；上游引物 YfjB-F：CGCG↓GATCCGCGATGAATAATCATTTCAAGTG（SEQ ID NO.5，下划线为BamH I酶切位点），和下游引物YfjB-R：CGCC↓TCGAGCCGTTAGAATAATTTTTTTGACC（SEQ IDNO.6，下划线为Xho I酶切位点）则用于扩增yfjB基因。获得引物后，以Bacillus subtilis(strain 168) 基因组DNA为模版，进行PCR克隆yueD基因片段和gapB基因片段；以E. coli K-12 MG1655基因组DNA为模版，进行PCR克隆yfjB基因片段。PCR所用2 × Phanta® MasterMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，反应体系如下：基因组DNA模板 200 ng，正向引物(10 μM) 2 μL，反向引物(10 μM) 2 μL，2 × Phanta® Master Mix 10 μL，加ddH2O至总体积为25 μL。PCR反应条件如下：预变性，95℃，2 min；（变性，95℃，10 sec；退火，X℃，30sec；延伸，72℃，30 sec循环34次）；彻底延伸，72℃，10 min。其中，进行PCR反应时，扩增yueD基因片段所有退火温度X=61℃，扩增gapB基因片段所有退火温度X=59℃，扩增yueD基因片段所有退火温度X=62℃。
反应结束后，PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。从图中可知，首先，目的片段条带单一、清晰，这表明引物特异性良好，泳道1中目的片段大小在730bp左右，与GenBank中公布的yueD基因大小为732 bp相符；泳道2中目的片段大小在1000 bp左右，与GenBank中公布的gapB基因大小为1023 bp相符；泳道3中目的片段大小在870 bp左右，与GenBank中公布的yfjB基因大小为879 bp相符。在确定产物条带单一的情况下使用PCR产物回收试剂盒分别对目的片段进行回收，获得高纯度目的基因片段。
实施例2：表达载体pETDuet-1-gapB-yueD和pET-28a-yfjB的构建
双基因共表达质粒pETDuet-1被设计用来在大肠杆菌中同时表达两个外源基因。载体携带有氨苄抗性基因和两个多克隆位点（MCS），每个多克隆位点都由T7启动子/Lac操纵子和一个核糖体结合位点组成。本实施例中将以pETDuet-1为载体实现基因yueD和基因gapB的共表达。具体实验方案如下：
构建重组质粒pETDuet-1-gapB-yueD：活化并在含100 μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB培养基中培养E. coli DH5α/ pETDuet-1（公知公用）用于提取载体质粒pETDuet-1。取新鲜菌液，使用TIANGEN公司的质粒快速提取试剂盒，提取质粒pETDuet-1，具体操作步骤参照试剂盒说明书。提取完成后通过琼脂糖凝胶电泳检测提取结果。
重组质粒的构建采用双酶切、连接的技术手段实现，构建策略如图3所示。
首先，对提取的质粒pETDuet-1和实施例1中扩增后的目的基因yueD，分别用Nde I和Xho I进行双酶切，双酶切体系为：DNA 1 ng，10× NE Buffer 2 μL，Nde I 1 μL，Xho I1 μL，加 ddH2O至总体积为50 μL。在无菌PCR管混匀上述双酶切体系中的溶液，37℃水浴1h后，65℃失活20 min。双酶切产物分别用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收后，回收产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并在DNA Marker的比对下，估算线性化载体和目的片段的浓度，便于后期用T4 DNA连接酶连接时，确定二者的加入的量，从而提高连接的成功率。
根据T4 DNA连接酶说明书，通过琼脂糖凝胶电泳结果，估算得到的线性化载体及目的片段的浓度。其中，DNA Marker各条带用到的浓度单位为ng/5μL，而连接体系用到的单位为pmol，因此为了初步估算二者的关系，用到的估算公式为：[0.02×片段的bp数] ng=0.03 pmol。根据二者的浓度比例，构建连接反应体系。体系如下：线性化载体 0.03 pmol，插入片段 0.3 pmol，10× Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase (400 U/μL) 1 μL，加ddH2O至总体积为10 μL。插入片段与线性化载体的摩尔比应在3:1-10:1之间，可提高连接成功的几率。在无菌PCR管混匀连接体系中的溶液后，16℃过夜反应。
通过电转化方法将连接产物导入克隆宿主菌E. coli DH5α中，在转化之前需要先制备电转感受态：选取所需的菌种E. coli DH5α在固体培养基上划线活化。挑取固体培养基上的单菌落接种于25 mL LB种子培养基中37℃摇瓶培养6 h待用。取1 mL种子液接种于100 mL LB培养基中37℃摇瓶培养至OD600值达到0.8~1.0时停止培养。将菌液收集至250 mL预冷的离心管中，在冰上预冷15-30 min。菌体在4℃、5,000×g下离心15 min，移除上清液并加入100 mL预冷无菌水重悬菌体。随后在4℃、5,000×g下离心10 min，移除上清液并加入100 mL预冷10%甘油（已灭菌）重悬菌体，重复此步骤3次。在4℃、5,000×g下离心15 min，移除上清液并加入1 mL预冷10%甘油（已灭菌）重悬菌体。将菌液以100 μL/管分装于1.5 mL离心管中，并保藏于-80℃冰箱中，待用。
制备好感受态后还需对电击杯进行预处理：用去离子水清洗电击杯后，向电击杯中加入的75%酒精浸泡2 h。弃去酒精，再用去离子水冲洗2~3遍，然后用1 mL的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。加入无水乙醇2 mL于电击杯中，浸泡30 min。弃去无水乙醇，并放置于通风厨内，待乙醇挥发。将清洗好的电击杯放入-20℃冰箱内待用。
电击转化步骤：将0.2 cm的电击杯置于冰上预冷。取10 μL连接产物添加到感受态细菌离心管中，小心混匀，冰上放置10 min。打开电转仪，设置好电击参数（Bacteria，Ec2）。将离心管中的混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电击杯，使混合物均匀进入电击杯的底部。将电击杯插入电击槽后推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后检查时间常数t，正常情况下t应该在4以上。向电击杯中迅速加入900 μL的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5 mL的离心管中。37℃，220~250 rpm复苏1小时。取100 uL转化产物涂布于含100 μg/mL Amp的固体培养基上，放于37℃过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液以1/1的比例加入30%的甘油后混匀，-80℃保存备用。
为保证实验结果的准确性以及实验失败后查找相关问题，该实验需设置对照实验。阳性对照：将连接产物换成载体质粒pETDuet-1。阴性对照：将连接产物换成无菌水。
待上述Amp抗性平板上长出单菌落后，挑取单菌落接种至含100 μg/mL Amp的液体LB培养基中37℃摇瓶培养。通过菌液PCR初步鉴定出阳性重组子，随后搜集鉴定出阳性重组子的菌液提取质粒，通过琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒双酶切产物来确定质粒是否构建成功。检测结果如图4 A所示，结果表明yueD基因已成功插入质粒pETDuet-1的第二个多克隆位点（MCS2），重组质粒pETDuet-1-yueD构建成功。
用限制性内切酶Hind III和EcoR I分别对质粒pETDuet-1-yueD和gapB基因片段进行双酶切，将片段gapB插入质粒pETDuet-1-yueD的第一个多克隆位点（MCS1）上获得重组质粒pETDuet-1-gapB-yueD，具体操作步骤与上文中描述的步骤基本一致。重组质粒pETDuet-1-gapB-yueD双酶切产物检测结果如图4 B所示，结果表明，重组质粒pETDuet-1-gapB-yueD构建成功。
构建重组质粒pET-28a-yfjB：活化并在含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB培养基中培养E. coli DH5α/pET-28a（公知公用）用于提取载体质粒pET-28a。成功提取质粒后，利用限制性内切酶BamH I和Xho I分别处理载体质粒pET-28a和目的片段yfjB，将获得的yfjB基因和线性化载体片段连接得到重组质粒pET-28a-yfjB。具体的酶切、回收、连接、转化等操作与上文中描述方法一致。构建原理图见图5所示。重组质粒pET-28a-yfjB双酶切产物检测结果如图4 C所示，结果表明，重组质粒pET-28a-yfjB构建成功。
实施例3：手性醇高效合成重组菌的构建
沿用实施例2中介绍的方法进行感受态的制备和重组质粒的转染工作。将构建成功的重组质粒pETDuet-1-gapB-yueD通过电转化法导入感受态的表达宿主菌E. coli BL21(DE3)中获得重组菌E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD。然后，再将构建成功的菌E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD制备成感受态细胞，并接受重组质粒pET-28a-yfjB的电转染。电转染后，将菌液涂布于同时含有100 μg/mL Amp和50 μg/mL Kan抗生素的平板上进行筛选，挑取阳性转化子提取质粒并检测。转染成功后将获得重组菌E. coliBL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD&pET-28a-yfjB。
同上，将pETDuet-1-yueD质粒转入E. coli BL2l (DE3)中获得了重组菌E. coliBL2l (DE3)/pETDuet-1-yueD（用只含100 μg/mL Amp的抗性平板筛选），用作后续实验的对照。
实施例4：羰基还原酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及NAD激酶的表达
重组菌E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD&pET-28a-yfjB的具体诱导表达步骤如下：
1. 在含Amp（100 μg/mL）和Kan（50 μg/mL）抗生素的LB液体培养基中37℃、220 rpm摇瓶培养E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD&pET-28a-yfjB至OD600值达到0.6~0.8时停止培养。
2.在上述培养基中立即加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG，并将培养条件更换为24℃、150 rpm，进行低温诱导表达，诱导时间为20 h。
3.诱导完成后，4℃、10,000×g离心5 min收集菌体。弃上清，用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬洗涤两次后。
4.收集到的菌体沉淀用0.1 mol/L，pH 7.0的PBS以0.1 g/mL的菌体浓度进行重悬。
5.重悬后的菌体采用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎。破胞条件为：400 W功率下，每个循环工作3 s，间歇5 s，共循环120次。
6.破碎后的混合物经4℃、12,000×g离心20 min，吸取上清液保存。
通过SDS-PAGE垂直电泳检测上清液中是否包含外源羰基还原酶。本实施例中，同步培养诱导菌E. coli BL21/pET-32a作为对照组。
结果如图6所示，SDS-PAGE图像显示在40 kDa，35 kDa，30 kDa左右有明显的条带，经分析分别为基因gapB，yfjB和yueD所表达的目的条带。
实施例5：胞内甘油醛-3-磷酸脱氢酶和NAD激酶酶活检测，以及代谢调控后辅酶NADPH的含量测定
甘油醛-3-磷酸脱氢酶提取液：用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶的提取。组成成分为：40 mMTris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，10%甘油，1 mM PMSF，5 μg/mL亮抑酶肽。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性检测反应液：用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活检测。组成成分为：50 mM 甘氨酸，50 mM 磷酸钾，5 mM EDTA，pH 8.9，1 mM NADP+，1 mM 甘油醛-3-磷酸。
KNDE缓冲液：用于提取NAD激酶。组成成分为：0.1 mmol/L NAD+，1.0 mmol/LK2HPO4-KH2PO4 pH 8.0， 1.0 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5mmol/L DTT。
NADPH酸性提取液：用于细菌胞内NADPH的提取。组成成分：5倍的 0.3 M HCl与1倍的 Tricine-NaOH (pH 8.0)混合。
NADPH碱性提取液：用于细菌胞内NADPH的提取。组成成分：0.3 M NaOH。
（1）甘油醛-3-磷酸脱氢酶的提取与检测：取10 mL诱导后菌液，4℃，10,000×g离心5 min离心收集细胞，加1.6 mL预冷的提取液，用振荡器充分混匀2 min。冰水浴中使用超声波细胞粉碎机超声波破碎10 min（破碎功率400 W，破碎5 s，间隔3 s），4℃，12,000×g离心15 min，取上清液为待测粗酶液。随即将酶活检测反应液与粗酶液分别在25℃恒温水浴中保温平衡5 min，随即向比色杯内依次准确加入1.8 mL反应液和0.2 mL粗酶液。立即摇匀并开始记时，在紫外可见分光光度计中340 nm处，每隔60秒钟读数记录OD值，共记录5 min之内的OD值变化。测定时，空白用蒸馏水代替粗酶液，其余成分均与反应体系相同；酶活力单位的定义为：在最适反应条件下，每分钟生成1 μmol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位（U），即1 U=1 μmol/min。
（2）NAD激酶的提取与检测：菌体用KNDE缓冲液洗涤后称重。1.0 g菌体用10 mL的KNDE缓冲液重悬，然后在冰水中超声破碎细胞10 min，4℃，12,000×g离心10 min收集上清，即是粗酶液。
NAD激酶酶活测定反应体系见下表，反应分两步测定：第一步为NAD激酶的酶促反应阶段，按照NAD激酶酶活反应体系加入各个成分后，先37℃水浴2 min，然后在30℃水浴反应1 h，这一阶段NAD激酶催化NAD+和ATP反应生成NADP+和ADP；第二步，将上一步的反应液沸水浴5 min，终止酶促反应冰上冷却，若反应体系中有悬浮蛋白则12,000×g离心10 min收集上清，加入50 mmol/L的6-磷酸葡萄糖100 μL，混匀后测OD340值，然后加入0.05 U/μL的6-磷酸葡萄糖脱氢酶10 μL，在37℃水浴反应10 min，测OD340值，这一阶段6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖和NADP+反应生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH。酶活力单位的定义为：在最适反应条件下，每分钟生成1 μmol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位（U），即1 U=1 μmol/min。
（3）胞内NADPH的提取和检测：先收集50 mL诱导后的菌液到离心管内，离心弃上清，加入4 mL 碱性提取液，超声波破碎1 min（破碎功率200 W，破碎2 s，间隔1 s），煮沸5min，冰浴中冷却后，10,000×g，4℃离心10 min，取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，10,000×g 4℃离心10 min，取上清液冰上保存供测定NADPH含量。
NADPH的检测：采用液相色谱法检测NADPH的含量。色谱柱：Welch Xtimate C18（4.6×250 mm, 5 μm）。流动相：流动相A：磷酸二氢钠缓冲液（取NaH2PO4•2H2O 7.825 g加超纯水溶解，用6 mol/L氢氧化钠调节pH至 6.6，后加超纯水定容到1000 mL，用0.22 μm微孔滤膜（水系膜）过滤）；流动相B：乙腈（色谱级）。运行程序如下：
时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)
0 97 3
10 90 10
15 40 60
20 97 3
流速：1 mL/min；柱温：25℃；检测波长：260 nm；进样量：20 μL。
检测结果如图7所示：在引入NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶后，检测到的酶活得到了大幅度的提升，同时NADPH的浓度也提高到了原来的1.53倍。接着，在过表达NAD激酶后，其酶活提高了2.41倍，NADPH的浓度也再次得到了提高。在两种技术手段的共同作用下，NADPH的浓度最终提高到了原来的2.34倍。
实施例6：重组菌催化还原苯乙酮等羰基化合物高效合成手性醇的应用
为了进一步的验证辅酶NADPH调控系统的应用能力，将全细胞作为催化剂来实现模式底物苯乙酮的催化转化，具体过程如下：将0.5 mL的重组菌种子液接种于50 mL（250 mL摇瓶）液体LB抗性培养基中，37℃培养至OD600nm为0.6~0.8时，加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG，24℃、150 rpm诱导表达20 h。诱导完成后，4℃、10,000×g离心5 min收集菌体，然后用0.05 mol/L，pH=6.5的PBS(磷酸盐缓冲液)重悬洗涤两次后，以0.1 g/mL的菌体浓度重悬细胞。取10 mL重悬液置于干净的摇瓶中，加入5%(w/v)的葡萄糖，40 mmol/L的底物苯乙酮。将摇瓶放入摇床中，设置好转速和温度，进行反应。
产物回收过程如下：反应1 h后，取0.8 mL 反应液，加入0.8 mL 萃取溶剂乙酸乙酯和2 μL内标物苯甲醛于2 mL 离心管中，置漩涡混合仪上充分振荡3 min，10,000×g 离心10 min 使溶液分层，提取上清于新的离心管中。萃取2 次，将两次萃取的上清液混合于2mL离心管中，加无水硫酸钠干燥，置于4℃冰箱保存，待分析。
产物检测与分析：采用气相色谱（岛津GC-2010）对苯乙酮还原产物进行定性和定量分析。色谱柱为RT-βDEXm毛细管手性柱（长度为30 m，内径为0.25 mm，膜厚为0.25 mm），检测器为氢离子火焰检测器（FID）。气相色谱检测条件为：以N2为载气，进样体积1μl，流速1.5 mL/min，分流比30:1，进样口温度为220℃，FID检测器温度为220℃；柱温采用程序升温，初温设置为90℃，保留2 min，以5℃/min升温至150℃，再保留6 min。
以内标法定量检测底物、产物浓度，计算不对称还原反应的产率（Yield）和对映体过量值（e.e.）：
其中：C sub 表示反应初始时底物浓度，C pro 表示反应结束时产物浓度；C S 和C R 分别表示反应结束时S型和R型产物浓度。
结果如图8所示，在引入NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶调控EMP途径后，重组菌的还原能力得到了提升，S-苯乙醇的产率从14%提高到了32%；同时，两种技术手段的共同作用下，S-苯乙醇的产率最终提高到了53%，与调控辅酶NADPH再生之前相比提高了3.78倍。全细胞催化反应结果验证了本发明提出的代谢调控手段在提高辅酶NADPH上的有效性。随后，将重组菌E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gapB-yueD&pET-28a-yfjB应用与不同前手性羰基化合物的催化转化，结果如下表所示，结果证明了其作为生物催化剂在生物催化手性醇合成应用中的优异性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 杨忠华
罗伟
杜慧君
王天赐
侯亚利
<120> 一种手性醇高效生产重组菌的构建方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
gggaattcca tatggaactt tatatcatca ccggag 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ccgctcgagc aaaaactctt taatatcata aatgcg 36
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
ccggaattcg atgaaggtaa aagtagcg 28
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
cccaagcttt tatacagcag acgg 24
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
cgcggatccg cgatgaataa tcatttcaag tg 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
cgcctcgagc cgttagaata atttttttga cc 32

Claims (9)

1.一种手性醇高效生产重组菌的构建方法，其特征在于：
A1：在大肠杆菌中引入高效羰基还原酶基因yueD表达系统，所述yueD基因的GeneID为936558；
A2：利用pET28a-yfjB过表达NAD激酶基因yfjB，同时通过引入依赖NADP+的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapB改造重组大肠杆菌EMP途径，所述yfjB基因的GeneID为947092、gapB基因的GeneID为937393。
2.根据权利要求1所述的一种手性醇高效生产重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：获取羰基还原酶基因yueD，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapB片段和NAD激酶基因yfjB片段；
S2：将步骤S1中获得的yueD和gapB片段插入共表达载体，获得含有yueD和gapB片段的重组质粒；
S3：将步骤S2中获得重组质粒导入表达宿主菌，得到重组菌。
S4：将步骤S1中获得的yfjB片段插入表达载体，将含有yfjB片段的表达载体导入步骤S3中获得的重组菌中。
3.根据权利要求2所述的一种手性醇高效生产重组菌的构建方法，其特征在于：步骤S1中，所述羰基还原酶基因yueD来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (strain 168)。
4.根据权利要求2所述的一种高效合成手性醇生物催化剂重组菌的构建方法，其特征在于：步骤S1中，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapB来源于Bacillus subtilis (strain168)。
5.根据权利要求2所述的一种手性醇高效生产重组菌的构建方法，其特征在于：步骤S1中，所述NAD激酶基因yfjB来源于大肠杆菌E. coli K-12 MG1655。
6.根据权利要求2所述的一种手性醇高效生产重组菌的构建方法，其特征在于：步骤S2中所述共表达载体为pETDuet-1。
7.根据权利要求2所述的一种手性醇高效生产重组菌的构建方法，其特征在于：步骤S3中所述表达宿主菌为大肠杆菌E. coli BL21(DE3)。
8.根据权利要求2所述的一种手性醇高效生产重组菌的构建方法，其特征在于：步骤S4中所述NAD激酶基因yfjB片段的表达载体为pET-28a。
9.一种利用如权利要求1-8任一所述的一种手性醇高效生产重组菌的构建方法构建的重组菌为生物催化剂在催化还原羰基化合物合成手性醇中的应用。
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