CN115975835A - 高产葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了毕赤酵母工程菌和试剂盒及其应用、获得毕赤酵母工程菌的方法、提高毕赤酵母的葡萄糖氧化酶产量的方法和生产葡萄糖氧化酶的方法，所述毕赤酵母工程菌中携带葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因。利用本发明的毕赤酵母工程菌可以实现高产葡萄糖氧化酶，酶活高，为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

Description

高产葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及高产葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，简称GOD，EC 1.1.3.4)具有高效性、专一性、无毒副等优点，能够氧化葡萄糖生成葡萄糖酸，从而产生杀菌、脱氧、去除葡萄糖等特殊效果，被广泛应用于医药、食品、饲料、纺织等多种领域。

目前，国内市场上葡萄糖氧化酶主要是通过黑曲霉和青霉的大规模发酵制得，并且常常伴随着淀粉酶、纤维素酶等多种副产物的产生，给后期目的蛋白的分离纯化工艺带来很大的困难，大大增加工艺生产的成本。

因此，目前生产葡萄糖氧化酶的方法仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题，为此，本发明提出了毕赤酵母工程菌和试剂盒及其应用、获得毕赤酵母工程菌的方法、提高毕赤酵母的葡萄糖氧化酶产量的方法和生产葡萄糖氧化酶的方法，利用本发明的毕赤酵母工程菌可以实现高产葡萄糖氧化酶，酶活高，为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

毕赤酵母兼具原核及真核表达系统的生长繁殖速度迅速、可高水平表达蛋白、能进行翻译后修饰、发酵工艺成熟等优势。因此，发明人将葡萄糖氧化酶基因导入毕赤酵母中，可以表达葡萄糖氧化酶。为了进一步提高葡萄糖氧化酶产量，发明人经过深入研究，中心碳代谢是生物体所需能量的主要来源，并为体内其他代谢提供前体物质，发明人发现通过增强中心碳代谢途径，有助于表达葡萄糖氧化酶基因。进而，发明人经过大量实验筛选出既可以有效地增强中心碳代谢途径且不会阻碍葡萄糖氧化酶基因表达的基因—丙酮酸激酶基因，葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因在毕赤酵母中共表达，有助于毕赤酵母更好地分泌葡萄糖氧化酶，并且酶活高，为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种毕赤酵母工程菌。根据本发明的实施例，所述毕赤酵母工程菌中携带葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因。

根据本发明实施例的毕赤酵母工程菌中，葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因共表达，有助于毕赤酵母更好地分泌葡萄糖氧化酶，并且酶活高，为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述毕赤酵母工程菌；或者，所述试剂盒包括：第一表达载体，所述第一表达载体携带有葡萄糖氧化酶基因；第二表达载体，所述第二表达载体携带有丙酮酸激酶基因。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得前面所述毕赤酵母工程菌的方法。根据本发明的实施例，所述包括：将携带有葡萄糖氧化酶基因的第一表达载体导入毕赤酵母，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为初筛菌株；将携带有丙酮酸激酶基因的第二表达载体导入所述初筛菌株，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为目标毕赤酵母工程菌。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种提高毕赤酵母的葡萄糖氧化酶产量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使毕赤酵母携带葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述毕赤酵母工程菌或者试剂盒在生产葡萄糖氧化酶中的应用。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种生产葡萄糖氧化酶的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述毕赤酵母工程菌进行培养，收集所得培养液中的菌体，分离出葡萄糖氧化酶。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例1的密码子使用率示意图；

图2显示了根据本发明实施例2的重组表达质粒pGAPZαA-GOX4opt结构示意图；

图3和图4显示了根据本发明实施例3的密码子使用率示意图；

图5和图6显示了根据本发明实施例3的GC含量分布示意图；

图7显示了根据本发明实施例3的重组表达质粒pPIC9K-BTS-opt结构示意图；

图8显示了根据本发明实施例4的葡萄糖氧化酶酶活分析示意图；

图9显示了根据本发明实施例9的蛋白电泳图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了毕赤酵母工程菌和试剂盒及其应用、获得毕赤酵母工程菌的方法、提高毕赤酵母的葡萄糖氧化酶产量的方法和生产葡萄糖氧化酶的方法，下面将分别对其进行详细描述。

毕赤酵母工程菌

在本发明的一个方面，在本发明的一个方面，本发明提出了一种毕赤酵母工程菌。根据本发明的实施例，所述毕赤酵母工程菌中携带葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因。

根据本发明实施例的毕赤酵母工程菌中，葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因共表达，有助于毕赤酵母更好地分泌葡萄糖氧化酶，并且酶活高，为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

根据本发明的实施例，葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉。

根据本发明的实施例，葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行优化而获得的。为了使得来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因能够在毕赤酵母中高效表达，发明人在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，考虑多种因素，包括但不限于密码子使用频率、不同基因区域GC含量的分布、密码子适应指数CAI等，对葡萄糖氧化酶基因进行优化，同时为了后续基因工程操作方便，剔除了EcoRI、SalI、XbaI等限制性内切酶的酶切位点。

根据本发明的实施例，葡萄糖氧化酶基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列。该葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3)进行优化而获得的，其可以在毕赤酵母中高效表达葡萄糖氧化酶基因。

GAACATTTCCAAGTTCCATTGCAACATACTATTTCTCCATGTTCTACTTCCCCACACACTACTCATAACGATTTTAACCATAACATCAACTCTATCCCACACGGTATTACTGATGATCCAAGATCTATTGATAACCAAACCTTCGACTACATTATTGCTGGTGGTGGTTTGACTGGATTGACTTTGGCTGCTAAGTTGGTTGAACAAAAGAAGTACACCGTTTTGGTTATTGAATCCGGATTTTACGCTTGGGAATACGGTCCAAAGATTGATGATTTGAATACTTATGGTCAGGTTTTCGGTTCTTCTGTTGATCATGCTTACGAAACATCTCCACAGTTGGTTGGTAATGATGGTGAGACTGGTTTGGATAAGGATATTAGAATTGTTAGATCCGGTAACGGTTTGGGTGGTTCTACTTTGATTAATGGTGGTACTTGGACTAGACCACATAAGTCTCAGTTGGATTCTTGGGAAGAAGTTTTTGGTAACACTGGTTGGAACTGGGATGCTTTGAAGGGTAAGATGGATGAAATTGAGGTTCCAAGAGATCCTACTTCTGATGATATTACTGAAGGTTCTTTTCATAAGTTCGATGCTAAGTGTCATAACCAACAACCAGGTAAAGGTAAGGTTAAAGTTGGAGCTAGAGACAGAAAGTACGGTTGGTCCCCATTGATTAAGGCTTTGATGCACACTGTTAACTCCACTTACGAAGAAGTTGTTAACCAAAAGGATTTGTGTTGTGGAGATCCAACTGGTGTTTCCATGTTTTTGAACACTTTGACTAACGAGCAGATTAGAACTGACGCTGCTAGATCTTGGTTGAAGCCAATTTTGGATGATGATGAATTGAAGCAATACATTACTGTTTTGACTGGTGAATTGGTTGGTAAGGTTCATTTGGCTGATGCTAACCCATCTGAAACTGGTACAGAATTTAAGGCTAAGGGTGTTGAATTTGGTGTTCATAAGAAGCAAGAGTGGAAGTGGGATGCTTGGGCTAGAAAGGAGGTTTTGTTGGCTGCTGGTTCTACAATTTCTCCATTGATTTTGCAGTGGTCTGGAATTGGTCCAAAGACTTGGTTGGATGCTGCTGGTATTGAACATAAGTTGGAATTGCCAGTTGGTTATAATTTGCAAGATCAGACTACTACCTCTGTTGTTACTAAGCCAAAGCCAGAAGCTAATGGTCAAGGACAAGCTGCTTACTTTGCTACTTTTGCTGAGATTTTTGGTAAGGATGCTTCCGACATGGAAAAATTGTTGAAGGACGATACTGAGTTGGATAAGTGGGCTGAACATACCGTTAACGGACACGGTTTTCCAGATAAGGCTAACTTGTTGAAGCAATATAAGAACTACAGAGATTGGTTGTTGACTGATAAGGTTTCTTACGCTGAGTTGTTTTTGGATACTGATAACTCTACTCATTTCGATTTGTGGAACTTGATTCCATTTACTAGAGGTTACGTTAAGATTTTGGATAACGATCCTTACTTGAGATCTTTTGAGTATAACCCTAGATACTTTGAGAACATCTTGGACTTGAACGGTCAAGCTGCTGCTACCAGATTGGCTAGACAATTGACTAACACTTACGATATGAAGCAATACGTTGATAAGGAGCAGGTTCCAGGTAGATACGTTCCAGAAAACGCTTCTTTGACAGAATGGGCTGATTACGTTAAGCAGAATTACAGAGCTAACTACCATGGTGTTGGTACATGTTCCATGATGAAGAAAGAATTGGGTGGTGTTGTTGATCCAGAAGCTAAAGTTTATGGTGTTGAAGGTTTGAGAGTTGTTGATGGTTCTATTCCACCAACTCAAGTTTCTTCTCACGTTATGACCGTTTTTTACGCTATGGCTGTTAAGATTGCTGAATCTGTTATTAAGGATGCTGGTAATGCT(SEQ ID NO：1)EHFQVPLQHTISPCSTSPHTTHNDFNHNINSIPHGITDDPRSIDNQTFDYIIAGGGLTGLTLAAKLVEQKKYTVLVIESGFYAWEYGPKIDDLNTYGQVFGSSVDHAYETSPQLVGNDGETGLDKDIRIVRSGNGLGGSTLINGGTWTRPHKSQLDSWEEVFGNTGWNWDALKGKMDEIEVPRDPTSDDITEGSFHKFDAKCHNQQPGKGKVKVGARDRKYGWSPLIKALMHTVNSTYEEVVNQKDLCCGDPTGVSMFLNTLTNEQIRTDAARSWLKPILDDDELKQYITVLTGELVGKVHLADANPSETGTEFKAKGVEFGVHKKQEWKWDAWARKEVLLAAGSTISPLILQWSGIGPKTWLDAAGIEHKLELPVGYNLQDQTTTSVVTKPKPEANGQGQAAYFATFAEIFGKDASDMEKLLKDDTELDKWAEHTVNGHGFPDKANLLKQYKNYRDWLLTDKVSYAELFLDTDNSTHFDLWNLIPFTRGYVKILDNDPYLRSFEYNPRYFENILDLNGQAAATRLARQLTNTYDMKQYVDKEQVPGRYVPENASLTEWADYVKQNYRANYHGVGTCSMMKKELGGVVDPEAKVYGVEGLRVVDGSIPPTQVSSHVMTVFYAMAVKIAESVIKDAGNA(SEQ ID NO：3)根据本发明的实施例，丙酮酸激酶基因是通过对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因进行优化而获得的。发明人对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因(SEQ ID NO：4)进行优化，例如剔除了BamHI、DraI、EcoRI、NotI、PshAI等限制性内切酶的酶切位点，以便于后续基因工程操作方便。

根据本发明的实施例，丙酮酸激酶基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列。

ATGTCCACCTCTTCCAAATTGGGTTGGTTGTCCAAGTTGGATGTTTCTTCTACCCCAGAGAGAAATTTGAGAAGATCCTCTATTATTGGTACCATTGGTCCAAAGACTAACTCTCCAGAAGTTTTGGTTTCTTTGAGACAGGCTGGTTTGAACATTGTTAGAATGAACTTTTCACACGGATCATACGAATACCATCAATCTGTTGTTGATAACGCTAGAAAGTCTGAAGAAATTTATCCAGGTAGACCATTGGCTATTGCTTTGGATACTAAGGGTCCAGAAATCAGAACCGGTACAACCAAGGGTGAAACTGACTACGCTATTCCAATGGGTCACGAGATGATTTTTACTACCGATTTGTCCTTTGCTAAGTCCTCTGATGATAAAGTTATGTTTATCGACTACAAGAACATCACCAAGGTTATTGAACCTGGTAAGATTATTTACGTTGATGATGGAGTTTTGTCTTTTGAAGTTTTGGAAGTTGTTGATGAAAACACTTTGAAGGTTAGATCTATTAACGCTGGTGCTATTTCTTCTCACAAGGGTGTTAACTTGCCTAACACTGATGTTGATTTGCCTGCTTTGTCTGAGAAGGATAAGCAAGATTTGAGATTTGGTGTTAAGAACAAGGTTAACATGGTTTTTGCTTCTTTTATCAGATGTGCTAACGATATTAAGGAAATTAGACATGTTTTGGGTGAGGATGGTAAGCAGATTCAAATTATTGCTAAGATTGAGAACCAGCAGGGTGTTAACAATTTTGATGAAATTTTGGAGGTTACCGATGGTGTTATGGTTGCTAGAGGTGATTTGGGTATTGAGATTCCAGCTCCACAAGTTTTTGTTGTTCAGAAGCAGTTGATTGCTAAGTGTAACTTGGCTGGTAAGCCAGTTATTTGTGCTACTCAGATGTTGGAATCCATGACTTACAATCCAAGACCAACCAGAGCTGAAGTTTCTGATGTTGGTAACGCTATTTTGGATGGTGCTGATTGTGTTATGTTGTCTGGTGAAACTGCTAAAGGTAACTATCCACATGAAGCTGTTGCTATGATGCATCATACCGCTTTGATTGCTGAGTCTGCTATTGCTTACTTGCCACATTATAATGAAATCAAGGATTTGGCTAGAGGATTGATTAATACAGTTGAAACCATTGCTATCGCTGCTGTTTCTGCTCATTTTGAGCAGAACGCTAAGGCTATTGTTGTTTTGTCTACTTCTGGTACTTCCGCTAGAATGATTTCTAAGTACAGACCAAACTGTCCAATTTTGATGGTTACTAGAAATGATGAAGCTGCTAGATACTCCCATTTGTACAGAGGTGTTTATCCATTTATTTACAAGCAAGAAGTTAACGACAACTGGCAACAAGATGTTGAGGAAAGATTGCAGTATGCTATTACTGAAGCTATTGGTATGGGTATTTTGAAGAAGGGTGATGCTATTGTTGCTGTTCAAGGTTGGACTAAGGGATTGGGTCATACTAATACTATGAGAGTTGTTTTTGCT(SEQ ID NO：2)ATGTCAACTTCTTCAAAACTTGGATGGCTATCCAAACTGGATGTATCATCCACTCCAGAGCGCAATCTTCGCCGATCTTCCATTATTGGTACGATTGGTCCTAAGACTAACAGTCCAGAAGTACTTGTCAGTCTGAGACAGGCTGGGCTTAATATTGTTAGAATGAACTTCTCTCATGGTTCTTACGAGTACCATCAATCAGTTGTGGACAATGCCAGAAAATCAGAGGAAATATATCCTGGTAGACCGCTTGCAATTGCTTTGGACACCAAGGGTCCTGAAATCAGAACAGGAACTACCAAAGGTGAAACAGATTATGCAATTCCTATGGGACATGAAATGATATTCACCACAGATTTGTCTTTCGCAAAGTCTAGCGATGACAAAGTGATGTTCATTGATTATAAGAACATTACAAAGGTTATTGAACCTGGAAAGATTATTTATGTGGATGATGGTGTTCTTTCATTTGAAGTTTTAGAAGTCGTTGATGAAAACACTCTCAAAGTCAGATCTATCAATGCTGGTGCAATTTCATCCCATAAAGGTGTCAATTTACCTAACACAGACGTGGACTTGCCAGCTCTTAGTGAAAAAGACAAGCAAGATCTGAGGTTTGGTGTGAAAAACAAAGTCAACATGGTATTTGCATCCTTCATTCGTTGTGCTAATGATATCAAGGAGATTCGCCATGTTCTCGGAGAAGATGGCAAACAGATCCAGATTATTGCTAAGATTGAGAACCAGCAAGGAGTTAACAATTTTGATGAAATCCTGGAAGTCACTGATGGTGTCATGGTCGCTAGAGGAGATCTAGGTATTGAAATCCCTGCACCTCAGGTATTTGTTGTTCAGAAGCAATTGATTGCCAAGTGCAATCTGGCAGGTAAACCCGTAATCTGTGCTACCCAAATGTTAGAATCTATGACTTACAATCCTAGGCCAACAAGAGCCGAGGTTTCGGACGTTGGAAATGCTATTTTGGATGGCGCCGATTGTGTGATGTTATCCGGGGAAACTGCCAAGGGAAACTACCCTCATGAGGCTGTTGCTATGATGCACCACACTGCTCTAATTGCAGAGTCAGCTATTGCTTACCTTCCACACTACAACGAAATCAAGGATCTTGCTCGTGGTCTTATTAACACAGTTGAAACTATTGCTATTGCCGCTGTTTCTGCTCACTTTGAACAAAATGCCAAGGCCATTGTTGTGCTTTCTACTTCAGGAACTTCAGCAAGAATGATTTCTAAGTATAGACCGAATTGCCCAATCCTTATGGTAACCAGAAATGATGAGGCAGCAAGATATTCTCATCTCTATCGTGGAGTATATCCATTCATCTATAAACAGGAAGTTAATGATAACTGGCAACAAGATGTTGAAGAACGTTTACAATATGCCATCACTGAAGCCATTGGCATGGGAATATTGAAAAAAGGTGATGCTATCGTTGCAGTACAGGGGTGGACCAAGGGACTGGGTCACACCAATACTATGCGCGTTGTTTTTGCT(SEQ ID NO：4)

根据本发明的实施例，第一表达载体选自pGAPZαA。pGAPZαA具有甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,GAP)启动子，相较于诱导型启动子，可以在细胞生长的同时表达对于细胞没有毒性的外源蛋白，表达所需周期短，可显著提高生产效率。并且它在发酵过程中还不需要更换非甲醇碳源，从而避免了储藏和运输大量甲醇的成本和危险。

根据本发明的实施例，第二表达载体选自pPIC9K。由此，既可实现BTS基因的高拷贝，也可通过更换碳源调控蛋白丙酮酸激酶的表达与否。

根据本发明的实施例，pPIC9K预先被去除α-factor信号肽序列。

试剂盒

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述毕赤酵母工程菌，和/或，所述试剂盒包括：第一表达载体，所述第一表达载体携带有葡萄糖氧化酶基因；第二表达载体，所述第二表达载体携带有丙酮酸激酶基因。第一表达载体和第二表达载体导入毕赤酵母中，可以获得前面所述的毕赤酵母工程菌，实现高产葡萄糖氧化酶。

根据本发明的实施例，试剂盒中包含的物质可存在如下三种情况：1)含有毕赤酵母工程菌；2)含有第一表达载体和第二表达载体；3)含有毕赤酵母工程菌、第一表达载体和第二表达载体。

根据本发明的实施例，葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉。

根据本发明的实施例，所述葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行优化而获得的。

根据本发明的实施例，所述丙酮酸激酶基因是通过对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因进行优化而获得的。

根据本发明的实施例，所述葡萄糖氧化酶基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，所述丙酮酸激酶基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；。

根据本发明的实施例，所述第一表达载体选自pGAPZαA。

根据本发明的实施例，所述第二表达载体选自pPIC9K。

根据本发明的实施例，所述pPIC9K预先被去除α-factor信号肽序列。

需要说明的是，前面针对毕赤酵母工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。

获得毕赤酵母工程菌的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得前面所述毕赤酵母工程菌的方法。根据本发明的实施例，所述包括：将携带有葡萄糖氧化酶基因的第一表达载体导入毕赤酵母，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株；将携带有丙酮酸激酶基因的第二表达载体导入上步筛选出的菌株，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为目标毕赤酵母工程菌。

根据本发明实施例的方法中，将携带有葡萄糖氧化酶基因的第一表达载体导入毕赤酵母，在含有不同浓度抗生素的平板培养基中进行培养，挑出生长的菌落，测定其葡萄糖氧化酶产量，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为初筛菌株，将携带有丙酮酸激酶基因的第二表达载体导入初筛菌株，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为最终的目标毕赤酵母工程菌。

需要说明的是，前面针对毕赤酵母工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该获得赤酵母工程菌的方法，在此不再赘述。

提高毕赤酵母的葡萄糖氧化酶产量的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种提高毕赤酵母的葡萄糖氧化酶产量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使毕赤酵母携带葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因。如前所述，葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因共表达，有助于毕赤酵母更好地分泌葡萄糖氧化酶，并且酶活高，为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

根据本发明的实施例，所述葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉。

根据本发明的实施例，所述葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行优化而获得的。

根据本发明的实施例，所述丙酮酸激酶基因是通过对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因进行优化而获得的。

根据本发明的实施例，所述葡萄糖氧化酶基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，所述丙酮酸激酶基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，所述方法包括：将携带有葡萄糖氧化酶基因的第一表达载体导入毕赤酵母，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为初筛菌株；将携带有丙酮酸激酶基因的第二表达载体导入所述初筛菌株，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株并收集菌株中的葡萄糖氧化酶。

根据本发明的实施例，所述第一表达载体选自pGAPZαA。

根据本发明的实施例，所述第二表达载体选自pPIC9K。

根据本发明的实施例，所述pPIC9K预先被去除α-factor信号肽序列。

需要说明的是，前面针对毕赤酵母工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该提高毕赤酵母的葡萄糖氧化酶产量的方法，在此不再赘述。

应用

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述毕赤酵母工程菌或者试剂盒在生产葡萄糖氧化酶中的应用。利用前面所述毕赤酵母工程菌或者试剂盒可以实现高产葡萄糖氧化酶，并且酶活高，为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

需要说明的是，前面针对毕赤酵母工程菌和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该应用，在此不再赘述。

生产葡萄糖氧化酶的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种生产葡萄糖氧化酶的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述毕赤酵母工程菌进行培养，收集所得培养液中的菌体，分离出葡萄糖氧化酶。由此，利用前面所述毕赤酵母工程菌可以实现高产葡萄糖氧化酶，并且酶活高，为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

需要说明的是，前面针对毕赤酵母工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该生产葡萄糖氧化酶的方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1黑曲霉葡萄糖氧化酶基因序列优化设计

以黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因GOX4(编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3)为模板，在不改变其蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率、不同基因区域GC含量的分布、密码子适应指数CAI等，对葡萄糖氧化酶基因序列进行多种策略的优化。同时为后续基因工程操作方便，剔除了EcoRI、SalI、XbaI等限制性内切酶的酶切位点，优化后的GOX4序列如SEQ ID NO：1所示，由北京擎科生物科技有限公司合成。

实施例2葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母菌株的构建和筛选

利用同源重组构建重组载体pGAPZαA-GOX4opt，重组载体用化学法转入大肠杆菌DH5α，转化菌液涂布在含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，最终获得含有GOX4opt基因的重组表达质粒pGAPZαA-GOX4opt(图2)，用双酶切验证。

将重组质粒pGAPZαA-GOX4opt用DarI单酶切后电击转化Pichia pastoris X33感受态细胞，在含有不同浓度的G418抗生素平板上(浓度依次为：0.25、0.5、2.0、4.0、8.0mg/ml)进行梯度筛选，结合高通量筛选找到与葡萄糖氧化酶产量呈正相关的GOX4基因高拷贝菌株，并经过鉴定命名为Pichia pastoris X33-pGAPZαA-GOX4opt。

实施例3葡萄糖氧化酶分泌型增强菌株的构建

参照实施例1的方法优化毕赤酵母来源丙酮酸激酶基因BTS(name:PAS_chr2-1_0769，Gene ID:NC_012964.1，SEQ ID NO：4)，即在不改变其蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率(图3和图4)、不同基因区域GC含量的分布(图5和图6)、密码子适应指数CAI等，对葡萄糖氧化酶基因序列进行多种策略的优化。为后续基因工程操作方便，剔除了BamHI、DraI、EcoRI、NotI、PshAI等限制性内切酶的酶切位点，优化后的BTS基因序列如SEQ ID NO：2所示，由北京擎科生物科技有限公司合成。

采用同源重组的方式将BTS记忆克隆到中间载体pPIC9K(去除α-factor信号肽序列)上获得重组表达质粒pPIC9K-BTS-opt(图7)，将重组表达质粒转化Pichia pastorisX33-pPGAPZαA-GOX4opt菌株，经筛选鉴定获得一株葡萄糖氧化酶产量最高的重组菌Pichiapastoris X33-pPGAPαA-GOX4opt/pPIC9K-BTSopt。

实施例4重组菌的酶活测定和蛋白电泳

发酵菌株为实施例1的黑曲霉、实施例2和实施例3中构建的毕赤酵母工程菌，发酵条件及方法如下：

黑曲霉及实施例2构建的毕赤酵母工程菌：挑取单菌落于YPD培养基中进行摇瓶培养并转接两次，制备一级种子液、二级种子液，培养条件为30℃、180r·min^-1，在确定菌株无污染的情况下，以10％的接种量接种至装液量为20％的100mL锥形瓶中，发酵7天，每隔24h取样检测葡萄糖氧化酶酶活。

实施例3构建的毕赤酵母工程菌：挑取单菌落接种至10mL液体YPD培养基，在30℃、180r·min-1的条件下培养OD600到1.3～1.5之间，取5mL菌液转接至50mL BMGY培养基培养24h。再取2mL菌液接种至装液量为20mL的100mL锥形瓶中，发酵培养基为BMMY培养基，于30℃、180r·min^-1条件下进行发酵培养7天，每隔24h取样测定酶活并每隔48h补加一次1％的无菌甲醇。

培养基：YPD培养基(1L)：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取物10g，斜面培养基添加琼脂20g。BMGY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，甘油10mL，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)。诱导培养基为BMMY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，甲醇5ml，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)。

由图8可知，Pichia pastoris X33-pPGAPZαA-GOX4opt菌株的葡萄糖氧化酶酶活为6.93U/mL，与野生型黑曲霉菌株相比提高了10倍。酶活产量最高的是Pichia pastorisX33-pPGAPαA-GOX4opt/pPIC9K-BTSopt菌株，产量达到了11.12U/mL，与Pichia pastorisX33-pPGAPZαA-GOX4opt菌株相比提高了1.6倍，与野生型黑曲霉相比提高了16倍。

对GOD酶活表现最高的菌株Pichia pastoris X33-pPGAPαA-GOX4opt/pPIC9K-BTSopt上清液进行蛋白电泳(SDS-PAGE)，得到一条分子量大小约为70kDa的蛋白条带(图9)，与理论值相符合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌中携带葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因。

2.根据权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述丙酮酸激酶基因是通过对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述丙酮酸激酶基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因是通过连接至第一表达载体上导入毕赤酵母；所述丙酮酸激酶基因是通过连接至第二表达载体上导入毕赤酵母；

任选地，所述第一表达载体选自pGAPZαA；

任选地，所述第二表达载体选自pPIC9K；

任选地，所述pPIC9K预先被去除α-factor信号肽序列。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述毕赤酵母工程菌；和/或

所述试剂盒包括：

第一表达载体，所述第一表达载体携带有葡萄糖氧化酶基因；

第二表达载体，所述第二表达载体携带有丙酮酸激酶基因。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述丙酮酸激酶基因是通过对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述丙酮酸激酶基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述第一表达载体选自pGAPZαA；

任选地，所述第二表达载体选自pPIC9K；

任选地，所述pPIC9K预先被去除α-factor信号肽序列。

5.一种获得权利要求1或2所述毕赤酵母工程菌的方法，其特征在于，包括：

将携带有葡萄糖氧化酶基因的第一表达载体导入毕赤酵母，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为初筛菌株；

将携带有丙酮酸激酶基因的第二表达载体导入所述初筛菌株，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为目标毕赤酵母工程菌。

6.一种提高毕赤酵母的葡萄糖氧化酶产量的方法，其特征在于，包括：

使毕赤酵母携带葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述丙酮酸激酶基因是通过对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述丙酮酸激酶基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

将携带有葡萄糖氧化酶基因的第一表达载体导入毕赤酵母，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为初筛菌株；

将携带有丙酮酸激酶基因的第二表达载体导入所述初筛菌株，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株并收集菌株中的葡萄糖氧化酶；

任选地，所述第一表达载体选自pGAPZαA；

任选地，所述第二表达载体选自pPIC9K；

任选地，所述pPIC9K预先被去除α-factor信号肽序列。

9.权利要求1或2所述毕赤酵母工程菌或者权利要求3或4所述试剂盒在生产葡萄糖氧化酶中的应用。

10.一种生产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括：利用权利要求1或2所述毕赤酵母工程菌进行培养，收集所得培养液中的菌体，分离出葡萄糖氧化酶。

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