CN115851563B - 固定二氧化碳电合成3-羟基丁酸的工程菌及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用合成生物技术设计构建高效利用电能固定CO2并合成3‑羟基丁酸的工程菌的方法与应用。所述设计构建工程菌的方法是以能利用电能和CO2的电活性微生物Geobacter sulfurreducens ACL为底盘，在该底盘菌株中通过质粒方式高效表达异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶与3‑羟基丁酸合成途径相关酶，经实验验证利用该方法所构建的菌株能高效利用电能与CO2合成3‑羟基丁酸。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物技术领域，具体涉及一种利用固定二氧化碳电合成3-羟基丁酸的工程菌及构建方法。
背景技术
微生物电催化过程通过电活性微生物与外界环境进行双向电子与能量交换，以实现环境、能源领域的广泛应用。生物电合成(Microbial electrosynthesis，MES)可直接利用电能驱动微生物还原固定CO2，合成多碳化合物，为可再生新能源转化、精细化学品制备和生态环境保护提供新机遇。但是，现有已知的微生物与电极间的胞外电子传递(Extracellular electron transfer，EET)速率较低，尚难以达到工业化要求；产生的有机化合物主要以C1和C2化合物为主，品位较低，商业价值不高。依赖于现代分子生物学和现代合成生物技术的生物工程，比如优化微生物胞外电子传递链和构建高附加值化合物的合成代谢途径，可提供解决上述两个主要问题的方案。
3-羟基丁酸是许多重要化合物的生产原料，如维生素、抗生素、激素以及香料物质的生产前提。同时该化合物也是生产生物降解塑料的重要原料 ,实现其工业化生产是治理“白色污染”、推动生物降解塑料研究、开发和应用的关键。传统的3-羟基丁酸采用的都是化学合成法，随着绿色化工技术的不断发展，如何采用绿色低碳的第三代生物精炼技术实现传统化学合成法向生物合成法的转变，是行业研究的重点。发明人利用电能固定CO2并实现了异丙醇的生物合成方法，因此考虑采用第三代生物精炼合成方法替代传统的化学合成法，实现3-羟基丁酸的绿色低碳生产路线。
有研究在菌株G. sulfurreducens中表达了Chlorobium limicola柠檬酸裂合酶基因，构建了G. sulfurreducens ACL（Toshiyuku Ueki, Kelly P.Nevin, Trevor L.Woodard, et al. 2018）工程菌株，申请人通过研究发现该菌株能直接利用电能固定CO2，而没有表达柠檬酸裂合酶的菌株G. sulfurreducens是没有利用电能固定CO2的能力。为开展微生物电能利用分子机制以及电合成研究提供了较为理想的底盘生物，本发明正式对该底盘生物进行合成生物设计，实现高效利用电能固定二氧化碳并通过微生物电合成方式转化为3-羟基丁酸，实现该产品的绿色低碳制备。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是利用合成生物技术，通过利用G. sulfurreducensACL底盘生物，通过合成生物学设计构建了高效利用电能固定CO2，并通过微生物电合成方法优化微生物还原性三羧酸循环途径关键步骤，构建高效合成3-羟基丁酸的的合成代谢途径。
基于此，本发明提供一种利用合成生物技术设计构建高效利用电能固定CO2的工程菌的方法，其包括：以电合成菌株G.sulfurreducensACL为底盘过表达异柠檬酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶，获得工程菌。
所述构建工程菌的方法进一步具体包括：
第一步，在底盘菌G.sulfurreducensACL中稳定复制的表达载体pRK- Geo5-ISODH，构建过表达异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的表达载体pRK- Geo5-ISODH-MD，进行质粒构建；
第二步，将所构建的质粒通过接合转移转化到底盘菌G.sulfurreducensACL中。
本发明还提供采用上述构建方法构建的工程菌。
本发明还提供采用上述方法制备的工程菌实现高效利用电能固定CO2的方法，其包括：
将前面制备的过表达异柠檬酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶工程菌接种于H-型微生物燃料电池的阴极，在阳极连续通入N2和CO2构成的混合气以给细菌细胞提供碳源，实现CO2的固定。
本发明还提供一种利用合成生物技术设计构建实现CO2转化为3-羟基丁酸的工程菌的方法，以电合成菌株G.sulfurreducensACL为底盘过表达异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶以及3-羟基丁酸合成途径相关酶，获得工程菌。
所述3-羟基丁酸合成途径相关酶包括乙酰乙酰辅酶A合成酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶以及3-羟基丁酰辅酶A硫酯酶。
所述构建工程菌的方法进一步具体包括：
第一步，在底盘菌G.sulfurreducensACL中稳定复制的表达载体pRK-Geo2i，构建过表达异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶以及经密码子优化3-羟基丁酸合成途径相关酶的表达载体pRK-Geo2i-HB-ISODH-MD，进行质粒构建；
第二步，将所构建的质粒通过接合转移转化到底盘菌G.sulfurreducensACL中。
本发明还提供采用上述构建方法构建的工程菌。
本发明还提供了利用微生物电合成方法实现CO2合成3-羟基丁酸的方法，其包括：将前面制备的工程菌接种到H-型微生物燃料电池的阴极，在阳极连续通入混合气以给细菌细胞提供碳源，实现3-羟基丁酸的合成。
本发明具有的有益技术效果：针对目前利用微生物电合成方法转化CO2为生物燃料生产过程中，转化效率低且产物特性差的问题。本发明根据合成生物学的原理,提供了一种设计构建了高效利用电能与CO2且合成3-羟基丁酸的工程菌株的方法。将提高现有微生物生物电合成生产的效率实现CO2的高效转化。
附图说明
图1 本发明电活性微生物利用电能转化CO2为3-羟基丁酸生化合成途径原理示意图；
图2 本发明提供的pRK-Geo5-ISODH-MD质粒图谱；
图3 本发明提供的pRK-Geo2i-HB-ISODH-MD质粒图谱；
图4 本发明提供的ACL、ACL-ISODH、ACL-ISODH-MD以及 ACL-ISODH-SD 底盘菌株电能效率利用比较。
图5 本发明提供的ACL-ISODH、ACL-HB-ISODH以及ACL-HB-ISODH-MD利用电能合成3-羟基丁酸的效率比较；
图6菌落PCR检测阳性G.sulfurreducens ACL- HB -ISODH-MD菌株电泳图。
具体实施方式
本发明的工作原理如图1所示，还原性三羧酸循环途径中由酮戊二酸转化为异柠檬酸途径耦合了还原力NADPH的利用实现CO2的固定，可通过在底盘细胞中过表达异柠檬酸脱氢酶以提高细胞的电能利用率与CO2的固定效率。申请人在研究过程中，提供了需要优化表达还原性三羧酸循环途径的关键催化步骤（酮戊二酸还原途径）相关的酶-异柠檬酸脱氢酶，该异柠檬酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，通过在底盘细胞G.sulfurreducens ACL中实现相关表达质粒载体过表达异柠檬酸脱氢酶工程菌的构建，优化微生物细胞外电子传递链，提高电子传递效率，实现高效利用电能固定CO2，并转化为异丙醇。
然而采用相同的技术手段提高的电子传递效率，虽然仍然可以实现电能固定CO2，并通过电能作为能量转化为3-羟基丁酸，然而产量极低，无法满足批量化生产需求。为了进一步提升目标产物的产率，发明人推测有可能通过进一步提高底盘菌株的电能利用效率以提高3-羟基丁酸的合成效率。
另一方面，已有采用乙酰乙酰辅酶A、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶以及3-羟基丁酰辅酶A硫酯酶进行微生物发酵技术合成3-羟基丁酸，如图1右侧所示。
申请人通过研究发现采用底盘细胞G.sulfurreducens ACL实现相关表达质粒载体过表达异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶工程菌，实现电能利用效率的进一步提升，同时将上述3-羟基丁酸合成路径相关酶过表达，可以实现由以糖为底物的传统生物发酵方法转为以电能为还原力与CO2为唯一碳源的微生物电合成方法。
本发明提供一种利用合成生物技术提升电能固定CO2效率的工程菌的构建方法，其包括：
第一步，pRK- Geo5-ISODH-MD质粒的构建；
第二步，将所构建的质粒通过接合转移转化G.sulfurreducensACL中。
所述第一步进一步具体为选用可在底盘菌G.sulfurreducensACL中稳定复制的表达载体pRK- Geo5-ISODH，构建过表达异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的表达载体pRK-Geo5-ISODH-MD，进而实现质粒构建。
具体实现步骤如下：
第1.1步，将利用Gibson DNA聚集方式将G.sulfurreducens ACL内源的苹果酸脱氢酶与表达载体pRK-Geo5-ISODH连接，构建表达pRK-Geo5-ISODH-MD，并将聚集产物通过电转方式转入E. coli λS17-1中；
第1.2步，利用含有卡那霉素的LB平板中筛选阳性克隆，待克隆生长后，利用菌落PCR方法检测克隆，然后提取质粒送测序，实现pRK-Geo5-ISODH-MD质粒构建。
所述第1.1步进一步具体为以G.sulfurreducens ACL全基因组DNA作为模板，分别根据苹果酸脱氢酶基因序列设计引物MD- F 与MD- R，利用DNA多聚酶Q5扩增基因片段，以pRK-Geo5-ISODH表达载体为模板，根据外源基因插入位点序列设计引物pRK-Geo5-ISODH -F与pRK-Geo5-ISODH-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该质粒片段，然后通过Gibson聚集将片段聚集形成pRK-Geo5-ISODH-MD。
所述第二步进一步具体为在G.sulfurreducens ACL菌株中通过第一步获得的pRK-Geo5-ISODH-MD质粒，通过组成型启动子过表达异柠檬酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶。
具体实现步骤如下：
第2.1步，将携带pRK-Geo5-ISODH-MD质粒的E. coli λS17-1与G.sulfurreducensACL菌株接合，通过接合的方式将pRK-Geo5-ISODH-MD转入G.sulfurreducens ACL菌株中；
第2.2步，利用含有卡那霉素与乙酸-富马酸培养中筛选分别携带
pRK-Geo5-ISODH-MD质粒的G.sulfurreducens ACL克隆，利用菌落PCR方法检测阳性克隆并送测序，实现相关酶的过表达，所得克隆阳性克隆分别命名为菌株ACL -ISODH-MD。
本发明还提供采用上述方法制备的工程菌实现利用电能固定CO2固定的方法，其包括：
第一步，将ACL-ISODH-MD菌株在培养基中培养到指数生长期OD600nm=0.4；
第二步，将第一步获得的指数生长期的过表达相关酶工程菌以10%的接种量接种于H-型微生物燃料电池的阴极，在阳极连续通入N2和CO2构成的混合气以给细菌细胞提供碳源，实现CO2的固定。
本发明还提供利用合成生物技术设计构建实现CO2转化为3-羟基丁酸的工程菌的方法，其包括：
第一步，pRK-Geo2i- HB -ISODH-MD质粒构建；
第二步，异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶以及3-羟基丁酸合成途径相关酶的过表达。
所述3-羟基丁酸合成途径相关酶包括乙酰乙酰辅酶A合成酶SEQ ID NO .2、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶SEQ ID NO .3、3-羟基丁酰辅酶A硫解酶SEQ ID NO .4依次串联。
所述乙酰乙酰辅酶A合成酶SEQ ID NO .2来自于拜氏梭菌、 3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶SEQ ID NO .3来自于丙酮丁醇梭菌、3-羟基丁酰辅酶A硫解酶SEQ ID NO .4来自于大肠杆菌。
所述第一步，可稳定复制的外源质粒pRK-Geo2i通过诱导型启动子表达3-羟基丁酸合成途径且通过组成型启动子过表达异柠檬酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶，进一步具体为：
第1.1步，将异柠檬酸脱氢酶基因、苹果酸脱氢酶基因以及经密码子优化3-羟基丁酸合成途径相关酶基因与载体pRK-Geo2i连接构建表达载体pRK-Geo2i-HB-ISODH-MD，将聚集产物分别通过电转方式转入E. coli λS17-1中；
第1.2步，利用含有卡那霉素的LB平板中筛选阳性克隆；待克隆生长后，利用菌落PCR方法检测克隆，然后提取质粒送测序，获得pRK-Geo2i- HB -ISODH-MD质粒。
所述第二步进一步具体为：
第2.1步，将携带pRK-Geo2i- HB -ISODH-MD质粒的E. coli λS17-1
与G.sulfurreducens ACL菌株接合，通过接合的方式将pRK-Geo2i- HB -ISODH-MD质粒转入G.sulfurreducens ACL菌株中；
第2.2步，分别利用含有卡那霉素与乙酸-富马酸培养中筛选带
pRK-Geo2i- HB -ISODH-MD质粒的克隆，利用菌落PCR方法检测阳性克隆并送测序，所得到的阳性克隆命名为菌株ACL-HB-ISODH-MD。
本发明还提供了利用微生物电合成方法实现CO2合成3-羟基丁酸的方法，其包括：
第一步，将菌株ACL-HB -ISODH-MD在培养基中培养到指数生长期（OD600nm=0.4）；
第二步，将指数生长其的细菌以10%的接种量接种H-型微生物燃料电池的阴极，在阳极连续通入混合气以给细菌细胞提供碳源。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
在下述实施例中，所用的Gibson DNA聚集试剂以及PCR试剂购买于NEB公司、引物购于上海生工生物工程股份有限公司；基因组提取以及质粒提取试剂盒购于天根公司；大肠杆菌E. coli λS17-1菌株以及底盘菌株G.sulfurreducens ACL保存于本实验室；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂。
重组电合成菌株电能利用效率比较
比较例1G.sulfurreducens ACL底盘菌株构建
pUC19-aclBA质粒构建
将含有pUC19质粒的大肠杆菌E. coli Beta 10培养至指数生长中期，取5mL菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。根据外源基因插入位点序列设计引物PUC19-F与PUC19-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该质粒片段。
根据密码子优化的异柠檬酸裂合酶序列以及氯霉素基因序列，根据Gibson DNA片段间的重叠设计引物ACL-F与ACL-R和Cat-F与 Cat-R，以合成的基因片段为模板利用DNA多聚酶Q5分别扩增相关片段。
将G.sulfurreducens PCA(购自美国模式培养物集存库，保藏编号为ATCC-51573)原始菌培养至指数生长中期，取5mL 菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取全基因组DNA。以基因组DNA为模板，利用引物Upstream-F与Upstream-R和Downstream-F与Downstream-R分别利用DNA多聚酶Q5分别扩增上下游同源臂。相关引物如下
PUC19-F: CCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATG
PUC19-R: GTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCG
ACL-F：TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAA
ACL-R: ATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTTTACTTCTTCACGGGCACTTCGCG
Cat-F：ACGTAAGAGGTTCCAACTTTCAC
Cat-R: CGGTGACATCTCCCCATTTTCTATTTTAGGCGCTTGTG
CCTTGCCAGCGAC
Upstream-F: AAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCGT
CATCGCCGCATTCATCTACAAC
Upstream-R: TTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAATGAC
TTACAGCAGAAGTGCCGGGGAAT
Downstream-F: AATAGAAAATGGGGAGATGTCAC
Downstream-R:TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGATACCCGGT CGGTCGTCCCCTGTC
PCR扩增体系为：ddH2O 20uL，全基因组或质粒模板0.5uL，上下游引物各 2.5uL，Q5 PCR mix 25uL。PCR扩增条件：98℃变性5min，30个循环(98℃ 10s，55℃ 5s，72 ℃3min)，最后72℃延伸5min。
将目的基因条带扩增产物纯化后，利用HiFi DNA Assembly 聚集试剂盒将pUC19、异柠檬酸裂合酶基因、氯霉素抗性基因以及上下游同源臂共5个片段基因聚集连接。
聚集连接的条件为：pUC19、异柠檬酸裂合酶基因、氯霉素抗性基因以及上下游同源臂PCR扩增片段各1.3 uL，HiFi DNA Assembly mix 10 uL，在50℃反应2小时。利用5 uL聚集产物，通过电转方法转入E. coliE. coli Beta 10感受态细胞中。待平板上长出转化子转化，挑取转化子液体培养，提取质粒利用以下引物检测质粒的正确性。
Check-acl-F：CCCAGTCACGACGTTGTAAAAC；
Check-acl-R：AAACAGCTATGACCATGATTACG。
G.sulfurreducens ACL菌株的构建
将前面制备的携带pUC19-aclBA质粒的E. coli Beta 10过夜培养于含有卡纳霉素的LB培养基中，取5mL菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，尽弃培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。在37℃下，利用Nde Ⅰ酶切5-10微克质粒DNA，将质粒线性化, 酶切体系为质粒5uL，Nde Ⅰ 1 uL， buffer 2uL以及ddH2O 11uL，共20 uL。
然后利用1微克线性化的质粒，通过电转方法将线性化质粒转入G.sulfurreducens感受态细胞中，电极完毕后将细胞转接于5毫升乙酸-富马酸的液体培养基中恢复4-6小时，然后将细菌涂布于含有氯霉素的乙酸-富马酸的液体培养基中，待平板上长出克隆，挑取紫色的克隆测序在含有氯霉素的液体培养基中培养。利用引物检测克隆的正确性，构建的重组菌株命名为G.sulfurreducens ACL。
Strain-ACL-F：GGCCGCAAGTTCTAGTCGTA；
Strain-ACL-R：TTCAGCTGACATCGACAGCA；
比较例2 菌株G.sulfurreducens ACL-ISODH的构建
pRK-Geo5-ISODH质粒构建
将G.sulfurreducens ACL原始菌培养至指数生长中期，取5mL 菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取全基因组DNA。 将含有pRK-Geo5质粒的大肠杆菌E. coli λS17-1培养至指数生长中期，取5mL菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。以G.sulfurreducens ACL全基因组DNA作为模板，根据异柠檬酸脱氢酶序列设计引物ISODH- F 与ISODH- R，利用DNA多聚酶Q5扩增该基因片段；以pRK-Geo5表达载体为模板，根据外源基因插入位点序列设计引物pRK-Geo5-F与pRK-Geo5-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该质粒片段；
设计特异性引物如下：
pRK-Geo5-F: CATATGAATTCTCGAGGTACCACGTGG；
pRK-Geo5-R: TGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATC；
ISODH- F: TAACAATTTCACACAGGAAACAATGGCCACCCA
CAAGATCATC；
ISODH- R: CCACGTGGTACCTCGAGAATTCATATGCTAGATGGCGTCGATGATGGCGTTC。
PCR扩增体系为：dd H2O 20uL，全基因组模板0.5uL，上下游引物各 2 .5uL，Q5PCR mix 25uL。PCR扩增条件：98℃变性5min，30个循环(98℃ 10s，55℃ 5s，72 ℃ 3min)，最后72℃延伸5min。
重组高效利用电能固定CO2菌株G.sulfurreducens ACL-ISODH的构建
将目的基因条带扩增产物纯化后，利用HiFi DNA Assembly 聚集试剂盒将pRK-Geo5与异柠檬酸脱氢酶基因SEQ ID NO .1聚集连接。
聚集连接的条件为：pRK-Geo5与异柠檬酸脱氢酶基因PCR扩增片段各5 uL，HiFiDNA Assembly mix 10 uL, 在50℃反应2小时。利用5 uL聚集产物，通过电转方法转入E. coli λS17-1感受态细胞中。待平板上长出转化子转化，挑取转化子液体培养，提取质粒利用以下引物检测克隆的正确性，并将PCR产物送生工测序：
ISODH-F1-F:TACTACCACCCCGACGCCGCCAA；
ISODH-F1-R：TGCAGCTAGCACCGGTACGTA；
ISODH-F2-F： AGGCTTTACACTTTATGCTTC；
ISODH-F2-R： ACGATGGGCAGCAGGGAGTA。
利用以上引物扩增这两个片段间的约150bp的序列以检测克隆的正确性。
将前面制备的携带pRK-Geo5-ISODH质粒的E. coli λS17-1过夜培养于含有卡纳霉素的LB培养基中，取1毫升过夜培养的大肠菌菌液在5,000g下离心2分钟，弃上清。取1毫升OD600nm为0.4的G.sulfurreducens ACL细菌，在厌氧箱中加入含有大肠杆菌沉淀的离心管中混匀，然后在5,000g 下离心2分钟，弃上清。利用100微升新鲜的培养基悬浮细菌沉淀，然后将悬液滴到不含抗性的固体培养基中，培养8小时后。最后将结合后的细菌涂布于含有卡那霉素抗性的固体平板上培养。待平板上长出克隆，挑取紫色的克隆测序在含有卡那霉素的液体培养基中培养。利用引物ISODH-F1-F与ISODH-F1-R以及ISODH-F2-F与ISODH-F2-R检测克隆的正确性，构建的重组菌株命名为G.sulfurreducens ACL-ISODH。
比较例3 菌株G.sulfurreducens ACL-ISODH-SD的构建
pRK-Geo5-ISODH-SD质粒构建
将G.sulfurreducens ACL原始菌培养至指数生长中期，取5mL 菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取全基因组DNA。将含有pRK-Geo2-ISODH质粒的大肠杆菌E. coli λS17-1培养至指数生长中期，取5mL菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。以G.sulfurreducens ACL全基因组DNA作为模板，根据琥珀酸脱氢酶序列设计引物SD -F 与SD-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该基因片段；以pRK-Geo5-ISODH表达载体为模板，根据外源基因插入位点序列设计引物pRK-Geo5-ISODH-SD-F与pRK-Geo5-ISODH- SD-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该质粒片段；
设计特异性引物如下：
pRK-Geo5-ISODH-SD -F: TACCTCAAGTCTCTCTGCAAATAGCATATGAATTCTCGAGGTACCACGTGG；
pRK-Geo5-ISODH-SD -R: ACAGAACTCGTGAACAGTTGCATACT
GATCTTCCTCCTTTAGCAGATATG；
SD-F:
CATATCTGCTAAAGGAGGAAGATCAGTATGCAACTGTTCACGAGTTCTGT；
SD-R: CCACGTGGTACCTCGAGAATTCATATG
CTATTTGCAGAGAGACTTGAGGTA。
PCR扩增体系为：dd H2O 20uL，全基因组模板0 .5uL，上下游引物各 2 .5uL，Q5PCR mix 25uL。PCR扩增条件：98℃变性5min，30个循环(98℃ 10s，55℃ 5s，72 ℃ 3min)，最后72℃延伸5min。
菌株G .sulfurreducens ACL-ISODH-SD的构建
将目的基因条带扩增产物纯化后，利用HiFi DNA Assembly 聚集试剂盒将pRK-Geo5-ISODH与琥珀酸脱氢酶SD聚集连接。
聚集连接的条件为：pRK-Geo5-ISODH与琥珀酸脱氢酶基因PCR扩增片段各5 uL，HiFi DNA Assembly mix 10 uL, 在50℃反应2小时。利用5 uL聚集产物，通过电转方法转入E. coli λS17-1感受态细胞中。待平板上长出转化子转化，挑取转化子液体培养，提取质粒利用以下引物检测克隆的正确性，并将PCR产物送生工测序：
ISODH-SD-F1-F:CATCGACGCCATCTAGTGACGTAG ；
ISODH-SD -F1-R：GCCGTCGTTCGGGTAGTTCTT ；
利用以上引物扩增这两个片段间的约1000bp的序列以检测克隆的正确性，成功扩增出这2个片段。表明所获克隆是正确的。
将前面制备的携带pRK-Geo5-ISODH-SD质粒的E. coli λS17-1过夜培养于含有卡纳霉素的LB培养基中，取1毫升过夜培养的大肠菌菌液在5,000g下离心2分钟，弃上清。取1毫升OD600nm为0.4的G.sulfurreducens ACL细菌，在厌氧箱中加入含有大肠杆菌沉淀的离心管中混匀，然后在5,000g 下离心2分钟，弃上清。利用100微升新鲜的培养基悬浮细菌沉淀，然后将悬液滴到不含抗性的固体培养基中，培养8小时后。最后将结合后的细菌涂布于含有卡那霉素抗性的固体平板上培养。待平板上长出克隆，挑取紫色的克隆测序在含有卡那霉素的液体培养基中培养。利用引物ISODH-SD -F1-F与ISODH-SD -F1-R检测克隆的正确性，构建的重组菌株命名为ACL-ISODH-SD。
实施例1 菌株G.sulfurreducens ACL-ISODH-MD的构建
pRK-Geo5-ISODH-MD质粒构建
将G.sulfurreducens ACL原始菌培养至指数生长中期，取5mL 菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取全基因组DNA。将含有pRK-Geo2-ISODH质粒的大肠杆菌E. coli λS17-1培养至指数生长中期，取5mL菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。以G.sulfurreducens ACL全基因组DNA作为模板，根据苹果酸脱氢酶序列设计引物MD -F 与MD-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该基因片段；以pRK-Geo5-ISODH表达载体为模板，根据外源基因插入位点序列设计引物pRK-Geo5-ISODH-F与pRK-Geo5-ISODH-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该质粒片段；
设计特异性引物如下：
pRK-Geo5-ISODH-F:GAGCCTCGTCGACAGCCTCAAGTAACATATGA
ATTCTCGAGGTACCACGTGG；
pRK-Geo5-ISODH-R:TTAGCAGATATGTGTACTTCCTACGTCACTAG
ATGGCGTCGATGATGGCGTTC；
MD-F:TGACGTAGGAAGTACACATATCTGCTAAAGGAGGAAGATC
AGTATGGCACGTAAGAAGATTGCTCTCATTGGTGGTGGC
CAGATCGG；
MD-R:CACCACGTGGTACCTCGAGAATTCATATGTTACTTGAGG
CTGTCGACGAGGCT。
PCR扩增体系为：dd H2O 20uL，全基因组模板0 .5uL，上下游引物各 2 .5uL，Q5PCR mix 25uL。PCR扩增条件：98℃变性5min，30个循环(98℃ 10s，55℃ 5s，72 ℃ 3min)，最后72℃延伸5min。
重组高效利用电能固定CO2菌株G .sulfurreducens ACL-ISODH-MD的构建
将目的基因条带扩增产物纯化后，利用HiFi DNA Assembly 聚集试剂盒将pRK-Geo5-ISODH与苹果酸脱氢酶MD聚集连接。
聚集连接的条件为：pRK-Geo5-ISODH与苹果酸脱氢酶基因PCR扩增片段各5 uL，HiFi DNA Assembly mix 10 uL, 在50℃反应2小时。利用5 uL聚集产物，通过电转方法转入E. coli λS17-1感受态细胞中。待平板上长出转化子转化，挑取转化子液体培养，提取质粒利用以下引物检测克隆的正确性，并将PCR产物送生工测序：
ISODH-MD-F1-F:CATCGACGCCATCTAGTGACGTAG ；
ISODH-MD -F1-R：GAATTCATATGTTACTTGAGGCTG ；
利用以上引物扩增这两个片段间的约1000bp的序列以检测克隆的正确性，成功扩增出这2个片段，表明所获克隆是正确的。所获质粒图谱如图2所示。
将前面制备的携带pRK-Geo5-ISODH-MD质粒的E. coli λS17-1过夜培养于含有卡纳霉素的LB培养基中，取1毫升过夜培养的大肠菌菌液在5,000g下离心2分钟，弃上清。取1毫升OD600nm为0.4的G.sulfurreducens ACL细菌，在厌氧箱中加入含有大肠杆菌沉淀的离心管中混匀，然后在5,000g 下离心2分钟，弃上清。利用100微升新鲜的培养基悬浮细菌沉淀，然后将悬液滴到不含抗性的固体培养基中，培养8小时后。最后将结合后的细菌涂布于含有卡那霉素抗性的固体平板上培养。待平板上长出克隆，挑取紫色的克隆测序在含有卡那霉素的液体培养基中培养。利用引物ISODH-MD -F1-F与ISODH-MD -F1-R检测克隆的正确性，构建的重组菌株命名为ACL-ISODH-MD。
实施例2 重组电合成菌株电能利用的测定
将制备的重组电合成菌株G.sulfurreducens ACL、G.sulfurreducens ACL-ISODH、G.sulfurreducens ACL-ISODH-SD以及G.sulfurreducens ACL-ISODH-MD分别培养到指数生长期（OD600nm=0.4）以10%的接种量接种于MFC型的阴极中，每个菌株分别接种4个MFC的阴极。MFC的阴极与阳极由大小为65平方厘米石墨碳构成，电极悬浮于MFC的腔室。每个MFC包含有200毫升培养基，MFC的阴极与阳用Nafion 117离子交换膜分隔。利用电位仪对给MFC提供 400mV的电压，同时在阳极连续通入N2：CO2（80：20）的混合气以给细菌细胞提供碳源。在24小时内测定不同细菌对电能的消耗，结果见图4 ，相对于单一过表达的ISODH工程菌株，同时过表达ISODH与SD的工程菌株具有相同水平的电能利用效率。同时过表达ISODH与MD的工程菌株ACL-ISODH-MD电能利用效率为最高，在20小时电能的利用率可达35000库伦，显著高于菌株ACL-ISODH-SD、ACL-ISODH、ACL电能利用率，从而选择该菌株为底盘用于后续的合成3-羟基丁酸。
3-羟基丁酸产量比较
比较例4 电合成3-羟基丁酸菌株G.sulfurreducens ACL-HB的构建
pRK-Geo2i-HB质粒构建
将含有pRK-Geo2i质粒的大肠杆菌E. coli λS17-1培养至指数生长中期，取5mL菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。根据外源基因插入位点序列设计引物pRK-Geo2i-F与pRK-Geo2i-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该质粒片段。
根据G.sulfurreducens ACL细菌基因组密码子偏好性，优化3-羟基丁酸合成途径相关基因序列，然后合成乙酰乙酰辅酶A合成酶SEQ ID NO .2、3-羟基乙酰辅酶A脱氢酶SEQID NO .3、3-羟基乙酰辅酶A硫解酶 SEQ ID NO .4，具体合成序列见下文，根据每个合成基因的序列以及Gibson DNA片段间的重叠设计引物，以合成的基因片段为模板利用DNA多聚酶Q5分别扩增相关片段。
pRK-Geo2i-F: ATATGAATTCTCGAGGTACCACGTG；
pRK-Geo2i-R: GGCTTGTTCACCTCCGTTTGGTTTG；
SEQ ID NO .2- F：CAAACCAAACGGAGGTGAACAAGCCATGAAG
GAGGTGGTGATCGCCTCCGCC；
SEQ ID NO .2- R：CATGTTACGTGCTCTCCTTGGATCCTTAGCACTT
CTCCAGCAGGATGGCG；
SEQ ID NO .3- F：GGATCCAAGGAGAGCACGTAACATGAAGAA
GGTGTGCGTGATCGG；
SEQ ID NO .3- R：GATTCTTTCTCTCCTGATGCCTCACTTG
GAGTAGTCGTAGAAGCC；
SEQ ID NO .4- F：GGCATCAGGAGAGAAAGAATCATGTC
CCAAGCCCTGAAGAACCTG；
SEQ ID NO .4- R：CGTGGTACCTCGAGAATTCATATTCAG
TTGTGGTTCCGCATCACGC。
PCR扩增体系为：ddH2O 20uL，全基因组或质粒模板0 .5uL，上下游引物各 2.5uL，Q5 PCR mix 25uL。PCR扩增条件：98℃变性5min，30个循环(98℃ 10s，55℃ 5s，72 ℃3min)，最后72℃延伸5min。
将目的基因条带扩增产物纯化后，利用HiFi DNA Assembly 聚集试剂盒将pRK-Geo2i与3-羟基丁酸合成途径相关基因片段共4个片段基因聚集连接。
聚集连接的条件为：pRK-Geo2i与3-羟基丁酸合成途径相关基因片段PCR扩增片段各1.3 uL，HiFi DNA Assembly mix 10 uL,在50℃反应2小时。利用5 uL聚集产物，通过电转方法转入E. coli λS17-1感受态细胞中。待平板上长出转化子转化，挑取转化子液体培养，提取质粒利用引物以下引物检测质粒的正确性。
Check-F1-F：CACGCCTCGGGCGGCATAAC；
Check-F1-R：ACATGTTCTCCATGCCGCCGG；
Check-F2-F：ATGTCCGCCGAGAAGGCCAAG；
Check-F2-R：CACCTTGTCGGGCCGCTTGGT；
Check-F3-F：TGATGAAGCTGGTGGAGGTGATC；
Check-F3-R：ATTTGCGTCTCGGAGGGCAGC；
Check-F4-F：AAGGACAAGTTCATCTGCGACC；
Check-F4-R：AAGCGGATGCCGGGAGCAGAC。
重组电合成3-羟基丁酸菌株G.sulfurreducens ACL-HB的构建
将携带pRK-Geo2i-HB质粒的E. coli λS17-1过夜培养于含有卡纳霉素的LB培养基中，取1毫升过夜培养的大肠菌菌液在5,000g下离心2分钟，弃上清。取1毫升OD600nm为0.4的G.sulfurreducens ACL细菌，在厌氧箱中加入含有大肠杆菌沉淀的离心管中混匀，然后在5,000g 下离心2分钟，弃上清。利用100微升新鲜的培养基悬浮细菌沉淀，然后将悬液滴到不含抗性的固体培养基中，培养8小时后。最后将结合后的细菌涂布于含有卡那霉素抗性的固体平板上培养。待平板上长出克隆，挑取紫色的克隆测序在含有卡那霉素的培养基中培养。利用引物Check-F1-F与Check-F1-R 以及Check-F4-F 与Check-F4-R引物对检测克隆的正确性。构建的重组菌株命名为G.sulfurreducens ACL-HB。
比较例5 菌株G.sulfurreducens ACL- HB -ISODH的构建
pRK-Geo2i- HB -ISODH质粒构建
将含有pRK-Geo2i质粒的大肠杆菌E. coli λS17-1培养至指数生长中期，取5mL菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。根据外源基因插入位点序列设计引物pRK-Geo2i-F与pRK-Geo2i-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该质粒片段。
根据G.sulfurreducens ACL细菌基因组密码子偏好性，优化3-羟基丁酸合成途径相关基因序列，然后合成乙酰乙酰辅酶A合成酶SEQ ID NO .2、3-羟基乙酰辅酶A脱氢酶SEQID NO .3、3-羟基乙酰辅酶A硫解酶 SEQ ID NO .4，具体合成序列见下文，根据每个合成基因的序列以及Gibson DNA片段间的重叠设计引物，以合成的基因片段为模板利用DNA多聚酶Q5分别扩增相关片段。
将含有pRK-Geo5-ISODH质粒的大肠杆菌E. coli λS17-1培养至指数生长中期，取5mL菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。根据异柠檬酸脱氢酶序列以及Gibson DNA片段间的重叠设计引物SEQ ID NO.1- F 与SEQ IDNO.1-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该基因片段与组成型启动子区域；其它引物分别扩增3-羟基丁酸合成途径相关基因：
pRK-Geo2i-F: ATATGAATTCTCGAGGTACCACGTG；
pRK-Geo2i-R: GGCTTGTTCACCTCCGTTTGGTTTG；
SEQ ID NO .1- F：TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATG
TGTGGAATTGTGAGCGGATAAC；
SEQ ID NO .1- R：CCACGTGGTACCTCGAGAATTCATATCT
AGATGGCGTCGATGATGGCGTTCAG；
SEQ ID NO .2- F：CAAACCAAACGGAGGTGAACAAGCCAT
GAAGGAGGTGGTGATCGCCTCCGCC；
SEQ ID NO .2- R：CATGTTACGTGCTCTCCTTGGATCCTT
AGCACTTCTCCAGCAGGATGGCG；
SEQ ID NO .3- F：GGATCCAAGGAGAGCACGTAACATGA
AGAAGGTGTGCGTGATCGG；
SEQ ID NO .3- R： GATTCTTTCTCTCCTGATGCCTCACTT
GGAGTAGTCGTAGAAGCC；
SEQ ID NO .4- F：GGCATCAGGAGAGAAAGAATCATG
TCCCAAGCCCTGAAGAACCTG；
SEQ ID NO .4- R：TACGAGCCGATGATTAATTGTCAATC
AGTTGTGGTTCCGCATCACGCC。
PCR扩增体系为：ddH2O 20uL，全基因组或质粒模板0 .5uL，上下游引物各 2.5uL，Q5 PCR mix 25uL。PCR扩增条件：98℃变性5min，30个循环(98℃ 10s，55℃ 5s，72 ℃3min)，最后72℃延伸5min。
将目的基因条带扩增产物纯化后，利用HiFi DNA Assembly 聚集试剂盒将pRK-Geo2i、3-羟基丁酸合成途径相关基因片段与异柠檬酸脱氢酶共5个片段基因聚集连接。
聚集连接的条件为：pRK-Geo2i、3-羟基丁酸合成途径相关基因片段与异柠檬酸脱氢酶基因PCR扩增片段各1.3 uL，HiFi DNA Assembly mix 10 uL,在50℃反应2小时。利用5uL聚集产物，通过电转方法转入E. coli λS17-1感受态细胞中。待平板上长出转化子转化，挑取转化子液体培养，提取质粒利用引物以下引物检测质粒的正确性。
Check-F1-F：CACGCCTCGGGCGGCATAAC；
Check-F1-R：ACATGTTCTCCATGCCGCCGG；
Check-F2-F：ATGTCCGCCGAGAAGGCCAAG；
Check-F2-R：CACCTTGTCGGGCCGCTTGGT ；
Check-F3-F：GATGAAGCTGGTGGAGGTGAT；
Check-F3-R：CGGCATCGTCTTTTGATGCTC；
Check-F4-F：GCTGAAGGACAAGTTCATCTGC；
Check-F4-R：GTTGGGCAGCTTGATGATGTTG；
Check-F5-F：ACCGCAGGTAGCCCTCCTTCA ；
Check-F5-R：CGTCAGCGGGTGTTGGCGGG。
利用以上引物检测克隆的正确性。
重组电合成3-羟基丁酸菌株G.sulfurreducens ACL- HB-ISODH的构建
将携带pRK-Geo2i-HB -ISODH质粒的E. coli λS17-1过夜培养于含有卡纳霉素的LB培养基中，取1毫升过夜培养的大肠菌菌液在5,000g下离心2分钟，弃上清。取1毫升OD600nm为0.4的G.sulfurreducens ACL细菌，在厌氧箱中加入含有大肠杆菌沉淀的离心管中混匀，然后在5,000g 下离心2分钟，弃上清。利用100微升新鲜的培养基悬浮细菌沉淀，然后将悬液滴到不含抗性的固体培养基中，培养8小时后。最后将结合后的细菌涂布于含有卡那霉素抗性的固体平板上培养。待平板上长出克隆，挑取紫色的克隆测序在含有卡那霉素的培养基中培养。利用引物Check-F1-F与Check-F1-R 以及Check-F5-F 与Check-F5-R引物对检测克隆的正确性。构建的重组菌株命名为G.sulfurreducens ACL-HB -ISODH。
比较例6 重组电合成3-羟基丁酸菌株G.sulfurreducens ACL- HB -ISODH-MD的构建
pRK-Geo2i- HB -ISODH-MD质粒构建
将含有pRK-Geo2i- HB -ISODH质粒的大肠杆菌E. coli λS17-1培养至指数生长中期，取5mL菌液，6000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。根据外源基因插入位点序列设计引物pRK-Geo2i- HB -ISODH-F与pRK-Geo2i- HB -ISODH-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该质粒片段。根据苹果酸脱氢酶序列以及Gibson DNA片段间的重叠设计引物MD-F1-F 与MD-F1-R，利用DNA多聚酶Q5扩增该基因片段；
(如序列表中序列所示)；
HB -ISODH-F：ATATGAATTCTCGAGGTACCACGTG；
HB -ISODH-R： TTAGCAGATATGTGTACTTCCTACGTCAC
TAGATGGCGTCGATGATGGCGTTCAGGGCGGC；
MD-F1-F: TGACGTAGGAAGTACACATATCTGCTAAAGGAGGAAGAT
CAGTATGGCACGTAAGAAGATTGCTCTCATTGGTGGTG；
MD-F1-R: CACGTGGTACCTCGAGAATTCATATTTACTTGAGGCTGT
CGACGAGGCTC。
PCR扩增体系为：ddH2O 20uL，全基因组或质粒模板0 .5uL，上下游引物各 2.5uL，Q5 PCR mix 25uL。PCR扩增条件：98℃变性5min，30个循环(98℃ 10s，55℃ 5s，72 ℃3min)，最后72℃延伸5min。
将目的基因条带扩增产物纯化后，利用HiFi DNA Assembly 聚集试剂盒将pRK-Geo2i- HB -ISODH与苹果酸脱氢酶聚集连接。
聚集连接的条件为：pRK-Geo2i- HB -ISODH与苹果酸脱氢酶基因PCR扩增片段各1.3 uL，HiFi DNA Assembly mix 10 uL,在50℃反应2小时。利用5 uL聚集产物，通过电转方法转入E. coli λS17-1感受态细胞中。待平板上长出转化子转化，挑取转化子液体培养，提取质粒利用引物以下引物检测质粒的正确性。
ISODH-MD-F2-F: CGACGCCATCTAGTGACGTAGGAAG；
ISODH-MD-F2-R: CCTCGAGAATTCATATTTACTTGAGGCTGTC。
利用以上引物扩增片段间的约1000bp的序列以检测克隆的正确性，成功扩增出这个片段。所获质粒图谱如图3。
所获重组电合成3-羟基丁酸菌株G.sulfurreducens ACL- HB -ISODH-MD的构建
将携带pRK-Geo2i-HB -ISODH-MD质粒的E. coli λS17-1过夜培养于含有卡纳霉素的LB培养基中，取1毫升过夜培养的大肠菌菌液在5,000g下离心2分钟，弃上清。取1毫升OD600nm为0.4的G.sulfurreducens ACL细菌，在厌氧箱中加入含有大肠杆菌沉淀的离心管中混匀，然后在5,000g 下离心2分钟，弃上清。利用100微升新鲜的培养基悬浮细菌沉淀，然后将悬液滴到不含抗性的固体培养基中，培养8小时后。最后将结合后的细菌涂布于含有卡那霉素抗性的固体平板上培养。待平板上长出克隆，挑取紫色的克隆测序在含有卡那霉素的培养基中培养。利用引物ISODH-MD-F2-F与ISODH-MD-F2-R引物对检测克隆的正确性, 如电泳图6中1-2泳道所示，成功扩增出这个片段，泳道3显示是阴性克隆。表明所获克隆是正确的。构建的重组菌株命名为G.sulfurreducens ACL- HB -ISODH-MD。
实施例2 重组菌株3-羟基丁酸产量比较
将比较例5、比较例6和比较例7制备的重组电合成菌株G.sulfurreducens ACL-HB、G.sulfurreducens ACL-HB -ISODH和G.sulfurreducens ACL-HB -ISODH-MD分别培养到指数生长期（OD600nm=0.4）以10%的接种量接种于MFC型的阴极中，每个菌株分别接种4个MFC的阴极。MFC的阴极与阳极由大小为65平方厘米石墨碳构成，电极悬浮于MFC的腔室。每个MFC包含有200毫升培养基，MFC的阴极与阳用Nafion 117离子交换膜分隔。利用电位仪对给MFC提供 400mV的电压，同时在阳极连续通入N2：CO2（80：20）的混合气以给细菌细胞提供碳源。在24小时内测定ACL- HB -ISODH菌株, ACL- HB -ISODH-MD菌株和ACL- HB菌株利用电能与CO2生产3-羟基丁酸的产量，结果见图5，采用底盘细胞G.sulfurreducens ACL，利用Gibson DNA聚集方式将密码子优化3-羟基丁酸合成途径相关酶基因与载体pRK-Geo2i构建表达载体pRK-Geo2i- HB，随着时间推移，不能实现3-羟基丁酸的合成，而采用本发明将异柠檬酸脱氢酶基因以及经密码子优化3-羟基丁酸合成途径相关酶基因与载体pRK-Geo2i连接构建表达载体pRK-Geo2i- HB -ISODH能生产少量的3-羟基丁酸，但是其产量低仅为3mM，不能满足生产的实际需求。为了进一步提升目标产物的产率，我们推测有可能通过进一步提高底盘菌株的电能利用效率以提高3-羟基丁酸的合成效率，并因此设计了在同时过表达异柠檬酸脱氢酶基因，苹果酸脱氢酶以及3-羟基丁酸合成途径的菌株ACL- HB -ISODH-MD，其合成目标产物的效率最高，可达36mM。
异柠檬酸脱氢酶SEQ ID NO .1 (如序列表中序列所示)
ATGGCCACCCACAAGATCATCTGGACCGAGATCGACGAGGCCCCCGCCCT 50
GGCCACCTACTCCCTGCTGCCCATCGTGCAGGCCTTCACCAAGGGCACCG 100
GCGTGGAGGTGGAGACCCGGGACATCTCCCTGGCCGGCCGGATCATCGCC 150
AACTTCCCCGAGAACCTGACCGACGCCCAGAAGATCCCCGACTTCCTGAC 200
CCAGCTGGGCGAGCTGACCCAGTCCCCCGAGGCCAACATCATCAAGCTGC 250
CCAACATCTCCGCCTCCGTGCCCCAGCTGAAGGAGGCCATCAAGGAGCTG 300
CAGGACCAGGGCTACAACGTGCCCGACTACCCCGAGGACCCCAAGAACGA 350
CGCCGAGAAGGAGATCAAGGAGCGGTACGCCAAGGTGCTGGGCTCCGCCG 400
TGAACCCCGTGCTGCGGGAGGGCAACTCCGACCGGCGGGCCCCCCTGTCC 450
GTGAAGAACTTCTCCAAGAAGAACCCCCACAAGCTGTCCCCCTGGTCCCC 500
CGACTCCAAGGCCCACGTGGCCCACATGACCGGCGGCGACTTCTACGGCA 550
ACGAGAAGTCCGTGACCGTGGGCAACGGCGGCGAGTTCAAGATCGAGTTC 600
GTGGACAAGAACGGCAAGGTGACCGCCTTCAAGGAGAAGCTGACCGCCTC 650
CAAGGGCGAGATCCTGGACGGCACCTTCATGTCCAAGAAGGCCCTGTGCC 700
AGTTCTACGCCGAGCAGATCGAGGACGCCAAGAACAAGGACCTGCTGCTG 750
TCCCTGCACCTGAAGGCCACCATGATGAAGGTGTCCGACCCCATCATGTT 800
CGGCCACGCCGTGTCCGTGTTCTACAAGGACGTGTTCGACAAGCACGCCG 850
ACACCTTCAAGCAGCTGGGCGTGAACCCCAACATGGGCCTGGGCGACCTG 900
TACAAGAAGATCGAGTCCCTGCCCGCCGCCAAGCGGGCCGAGATCGAGGC 950
CGACATCGCCGCCGTGTACGGCAAGCGGCCCAAGCTGGCCATGGTGGACT 1000
CCGACAAGGGCATCACCAACCTGCACGTGCCCAACGACATCATCGTGGAC 1050
GCCTCCATGCCCGTGGTGGTGCGGGACGGCGGCAAGATGTGGGGCCCCGA 1100
CGGCCAGCTGCACGACACCAAGGCCATGATCCCCGACCGGTGCTACGCCA 1150
CCATGTACCGGGAGATCATCGAGGACTGCCAGAAGCACGGCGCCTTCAAC 1200
CCCGCCACCATGGGCTCCGTGCCCAACGTGGGCCTGATGGCCCAGAAGGC 1250
CGAGGAGTACGGCTCCCACCCCACCACCTTCGAGATCCCCGCCGACGGCA 1300
CCGTGCGGGTGGTGACCGCCGACGGCACCGTGCTGATGGAGCACCAGGTG 1350
GAGGCCGGCGACATCTGGCGGATGTCCCGGGTGAAGGACATCCCCATCCA 1400
GGACTGGGTGAAGCTGGCCGTGAACCGGGCCCGGGCCACCGGCGCCCACG 1450
CCATCTTCTGGCTGGACAAGTCCCGGGCCCACGACGCCCAGGTGATCGCC 1500
AAGGTGGAGAACTACCTGAAGAACCACGACACCACCGGCCTGGAGATCAA 1550
GGTGCTGCCCCCCGTGGAGGCCATGCGGTACTCCCTGGAGCGGATCCGGA 1600
AGGGCCTGGACACCATCTCCGTGACCGGCAACGTGCTGCGGGACTACCTG 1650
ACCGACCTGTTCCCCATCCTGGAGCTGGGCACCTCCGCCAAGATGCTGTC 1700
CATCGTGCCCCTGCTGGCCGGCGGCGGCCTGTTCGAGACCGGCGCCGGCG 1750
GCTCCGCCCCCAAGCACGTGCAGCAGTTCGTGAAGGAGGGCTACCTGCGG 1800
TGGGACTCCCTGGGCGAGTTCTCCGCCCTGGCCGCCTCCCTGGAGCACCT 1850
GGGCACCTCCTTCAAGAACGACAAGGCCCTGGTGCTGGCCGAGACCCTGG 1900
ACCAGGCCATCGCCAAGTTCCTGGACAACAACAAGTCCCCCGCCCGGAAG 1950
GTGGGCCAGATCGACAACCGGGGCTCCCACTTCTACCTGGCCATGTACTG 2000
GGCCGAGGCCCTGGCCGCCCAGACCAAGGACGCCGAGCTGCAGGCCAAGT 2050
TCGCCCCCATCGCCAAGCAGCTGCAGGAGAACGAGGCCAAGATCAACGAG 2100
GAGCTGATCGGCGCCCAGGGCAAGCCCGTGGACATGGGCGGCTACTACCA 2150
CCCCGACGCCGCCAAGGTGGCCAAGGCCATGCGGCCCTCCGCCGCCCTGA 2200
ACGCCATCATCGACGCCATCTAG 2223
乙酰乙酰辅酶A合成酶SEQ ID NO .2 (如序列表中序列所示)
ATGAAGGAGGTGGTGATCGCCTCCGCCGTGCGGACCGCCATCGGCTCCTA 50
CGGCAAGTCCCTGAAGGACGTGCCCGCCGTGGACCTGGGCGCCACCGCCA 100
TCAAGGAGGCCGTGAAGAAGGCCGGCATCAAGCCCGAGGACGTGAACGAG 150
GTGATCCTGGGCAACGTGCTGCAGGCCGGCCTGGGCCAGAACCCCGCCCG 200
GCAGGCCTCCTTCAAGGCCGGCCTGCCCGTGGAGATCCCCGCCATGACCA 250
TCAACAAGGTGTGCGGCTCCGGCCTGCGGACCGTGTCCCTGGCCGCCCAG 300
ATCATCAAGGCCGGCGACGCCGACGTGATCATCGCCGGCGGCATGGAGAA 350
CATGTCCCGGGCCCCCTACCTGGCCAACAACGCCCGGTGGGGCTACCGGA 400
TGGGCAACGCCAAGTTCGTGGACGAGATGATCACCGACGGCCTGTGGGAC 450
GCCTTCAACGACTACCACATGGGCATCACCGCCGAGAACATCGCCGAGCG 500
GTGGAACATCTCCCGGGAGGAGCAGGACGAGTTCGCCCTGGCCTCCCAGA 550
AGAAGGCCGAGGAGGCCATCAAGTCCGGCCAGTTCAAGGACGAGATCGTG 600
CCCGTGGTGATCAAGGGCCGGAAGGGCGAGACCGTGGTGGACACCGACGA 650
GCACCCCCGGTTCGGCTCCACCATCGAGGGCCTGGCCAAGCTGAAGCCCG 700
CCTTCAAGAAGGACGGCACCGTGACCGCCGGCAACGCCTCCGGCCTGAAC 750
GACTGCGCCGCCGTGCTGGTGATCATGTCCGCCGAGAAGGCCAAGGAGCT 800
GGGCGTGAAGCCCCTGGCCAAGATCGTGTCCTACGGCTCCGCCGGCGTGG 850
ACCCCGCCATCATGGGCTACGGCCCCTTCTACGCCACCAAGGCCGCCATC 900
GAGAAGGCCGGCTGGACCGTGGACGAGCTGGACCTGATCGAGTCCAACGA 950
GGCCTTCGCCGCCCAGTCCCTGGCCGTGGCCAAGGACCTGAAGTTCGACA 1000
TGAACAAGGTGAACGTGAACGGCGGCGCCATCGCCCTGGGCCACCCCATC 1050
GGCGCCTCCGGCGCCCGGATCCTGGTGACCCTGGTGCACGCCATGCAGAA 1100
GCGGGACGCCAAGAAGGGCCTGGCCACCCTGTGCATCGGCGGCGGCCAGG 1150
GCACCGCCATCCTGCTGGAGAAGTGCTAA 1179
3-羟基丁烯酰辅酶A脱氢酶SEQ ID NO .3
ATGAAGAAGGTGTGCGTGATCGGCGCCGGCACCATGGGCTCCGGCATTGCCCAAGCCTTCGCCGCCAAGGGCTTCGAGGTGGTGCTGCGGGACATCAAGGACGAGTTCGTGGACCGGGGCCTGGACTTCATCAACAAGAACCTGTCCAAGCTGGTGAAGAAGGGCAAGATCGAGGAGGCCACCAAGGTGGAGATCCTGACCCGGATCTCCGGCACCGTGGACCTGAACATGGCCGCCGACTGCGACCTGGTGATCGAGGCCGCCGTGGAGCGGATGGACATCAAGAAGCAGATCTTCGCCGACCTGGACAACATCTGCAAGCCCGAGACCATCCTGGCCTCCAACACGTCCTCCCTGTCCATCACCGAGGTGGCCTCCGCCACCAAGCGGCCCGACAAGGTGATCGGCATGCACTTCTTCAACCCCGCCCCCGTGATGAAGCTGGTGGAGGTGATCCGGGGCATCGCCACCTCCCAAGAGACCTTCGACGCCGTGAAGGAGACCTCCATCGCCATCGGCAAGGACCCCGTGGAGGTGGCCGAGGCCCCCGGCTTCGTGGTGAACCGGATCCTGATCCCCATGATCAACGAGGCCGTGGGCATCCTGGCCGAGGGCATCGCCTCCGTGGAGGACATCGACAAGGCCATGAAGCTGGGCGCCAACCACCCCATGGGCCCCCTGGAGCTGGGCGACTTCATCGGCCTGGACATCTGCCTGGCCATCATGGACGTGCTGTACTCCGAGACCGGCGACTCCAAGTACCGGCCCCACACCCTGCTGAAGAAGTACGTGCGGGCCGGCTGGCTGGGCCGGAAGTCCGGCAAGGGCTTCTACGACTACTCCAAGTGA
3-羟基乙酰辅酶A硫解酶SEQ ID NO .4
ATGTCCCAAGCCCTGAAGAACCTGCTGACCCTGCTGAACCTGGAGAAGATCGAGGAGGGGCTGTTCCGCGGGCAGTCCGAGGACCTCGGCCTGCGGCAAGTCTTCGGGGGCCAAGTCGTCGGCCAAGCCCTGTACGCCGCCAAGGAGACCGTGCCCGAGGAGCGGCTGGTGCACTCCTTCCACTCCTACTTCCTGCGGCCCGGCGACTCCAAGAAGCCCATCATCTACGACGTGGAGACCCTGCGCGATGGCAACAGCTTCAGCGCCCGGCGGGTGGCCGCCATTCAGAACGGCAAGCCCATCTTCTACATGACCGCCTCCTTCCAAGCCCCGGAGGCCGGGTTCGAGCATCAAAAGACGATGCCGTCCGCCCCCGCGCCGGACGGGCTGCCCTCCGAGACGCAAATCGCGCAGTCCCTGGCCCACCTGCTGCCCCCCGTGCTGAAGGACAAGTTCATCTGCGACCGGCCCCTGGAGGTGCGGCCCGTGGAGTTCCACAACCCCCTGAAGGGCCACGTGGCGGAGCCCCACCGCCAAGTGTGGATCCGCGCGAACGGGAGCGTGCCCGACGACCTGCGGGTGCATCAGTACCTGCTGGGCTACGCCTCCGACCTGAACTTCCTGCCCGTGGCCCTGCAGCCCCACGGCATCGGCTTCCTGGAGCCCGGCATTCAGATCGCCACCATCGACCACTCCATGTGGTTCCACCGGCCCTTCAACCTGAACGAGTGGCTGCTCTATAGCGTCGAGTCCACCTCCGCGAGCTCCGCGCGGGGCTTTGTGCGGGGCGAGTTCTACACCCAAGACGGCGTGCTGGTGGCCTCCACCGTGCAAGAGGGCGTGATGCGGAACCACAACTGA
苹果酸脱氢酶SEQ ID NO .5
ATGGCACGTAAGAAGATTGCTCTCATTGGTGGTGGCCAGATCGGTGGTGTGCTTGCTCAACTCTGCGCTCTCCGTGAACTTGGCGACGTCGTCCTGTTCGATATCGTAGAAGGCCTTCCCCAGGGGAAATGCCTGGATATCGCCGAAGCTTCTCCTGTTGACGGCTTTGACGTCTGCCTGAAGGGTACCAACAGCTACGAGGATATCGCTGGCGCCGACGTTGTCATCGTGACTGCGGGCCTTCCCCGTAAGCCCGGCATGAGCCGTGACGACCTCATCGAGGTCAACTCCAAGATCATGACGTCGGTTGCCGAGGGGATCAAGCAGTACGCACCCAATTCCTTCGTGATTGTAATTTCCAACCCTCTGGACGCCATGGTTACCCTCTGCCAGAAGGTCACCGGTTTCCCCTACAACCGCGTCATCGGTCAGGCCGGAGTTCTCGACTCCGCCCGTTTTGCCACCTTCATCGCCTGGGAACTTGGCGTGTCCGTAAAGGACGTCACCGCCATGACTCTTGGCGGCCACGGCGACGACATGGTGCCGCTGGTTCGCTACGCCAGCGTCAAAGGTATCCCGGTCATGGAACTCCTTGAGCGCAAGTACGGCAGTAAGGAGAAGGCGAAGGAAGTCATGGACGCCATGGTCAACCGTACCCGTCTGGCGGGCGGCGAAGTCGTTGCCCTCCTCAAGACCGGTTCCGCCTTCTACAGCCCTGCGTCCAGCGCCATTGCCATGGCCGAGTCTATCCTCAAGGATCAGAAGCGGGTTCTTCCGACCTGTGCCTACCTCCAGGGAGAGTTCGGTGTCAACGGCTACTATGTGGGCGTACCCTGCGTGCTCGGCGAGAAGGGTATCGAGAATATCATTGAGTTCTCTCTCGACGCAGAAGAACAAGCGATGATGGACAAGTCGGTCGCAGCGGTAAAGAGCCTCGTCGACAGCCTCAAGTAA
琥珀酸脱氢酶SEQ ID NO .6
ATGCAACTGTTCACGAGTTCTGTGGGAAGAAAAGTTCTGATGGCGATTACCGGCCAGTTCATGGTTCTGTTCGTCATCGTCCACATGCTTGGCAACTCATCCATCTTCATCCCCGGAGGCATCAATGCCTACGCGGAGCACCTGCACGCCCTTCCGCCCCTAGTCTGGGCCTTCCGTCTCGTCATGCTGGTTGCGGCAGGTATCCATATTCTGTTCGGTATCCAGCTGAGCCTTGAGAACCGCGCCGCCAACCCCGACACCTATGCGGTCAAGAATTACAAGAAGGCCACCATGGGGAGCCTGAGCATGCTGTACACAGGCCTCCTTTTGCTGTCCTTCATTATTTATCACCTCCTCCACTTCACCATCCGCGCTACCCCCGACATCAAGCTCGGCGTAGACAGCCTGGGCCGTTTCGATGTCTTCGGTATGGTGACCAACAGCTTCTCCCACGGCATTATCGCGTTCATTTACATCGCGGCCATGGTGGTTCTGTTTCTCCACCTCTCCCACGGAATCCAGAGCTTCTTCCAGACCATGGGGTGGAACAACGACAAGTCACTTCCGGTGTTCAGCAAAATCGGCATGATTGCCGCCGTGGTTCTGCTCCTCGGCTATGCGACCATCCCGTTCGTCATCGTCACCGGCATTCTGAAAGGTTAGGGGGTTCATAGTGATACTCGACGGAAAATGTCCGACAGGGCCAATTGAGAAAACGTGGGACAAGCACCGCTTCGACATGAAGCTGGTCAACCCCGCCAACAAGCGCAAGTACAAGATTCTCGTCGTCGGAACCGGTCTTGCCGGTGGTGCAGCCGCTGCATCGCTGGGTGAACTCGGTTACAACGTTGAGGCGTTCTGTTATCAGGACAGCCCGCGGCGCGCGCACTCCATTGCCGCCCAGGGCGGTATCAACGCAGCCAAGAACTACCCGAACGACGGCGACAGCATCTACCGTCTCTTCTATGACACCATCAAGGGCGGCGACTTCCGCGCCCGTGAAGCCGATGTCTGGCGCCTCGCTCAGGTGTCCAATAATATCATCGATCAGTGCGTAGCTCAGGGTGTACCCTTTGCCCGTGACTATGCCGGCTACCTGGACAACCGCTCCTTTGGCGGCGCCCAGGTTTCCCGTACCTTCTATGCCCGGGGGCAGACGGGGCAACAGCTGCTGCTGGGCGCCTATTCCGCTCTTGCTCGCCAGATCAAGGCCGGTACCGTCAAGATGTTCCCTCGCACCGAAATGCTTGATCTTGTTGTTGTAGACGGCGAGGCCAAAGGGATCACGATTCGCGATCTGGTCACCGGCGAGATCCGCACCCATGTGGGCGATGCGGTTGTTCTTTGCACCGGCGGCTACGTAAACGTCTTCTACCTCTCCACCAACGCAATGGGGTGCAGCGTTACCGCAGCCTGGAAGGCCCACAAGAAAGGCGCCTTCTTCGCCAACCCCTGTTACACCCAGATTCACCCGACCTGCATTCCGCAGCATGGTGACAAGCAATCCAAGCTCACCCTCATGTCCGAGTCGCTCCGTAACGACGGCCGCTGCTGGGTGCCCAAGAAGCAGGGGGACAACCGTGCACCGGGCCAGATTCCCGACGAGGACCGCGACTACTACCTGGAGCGGAAGTACCCCTCCTTCGGAAACCTTGCTCCCCGTGACATCGCGTCCCGCGCCGCCAAGGAACAGTGCGACGACAACCGTGGCGTCGGACCGGGCGGACGTGGCGTCTATCTTGACTTCGCCTCCTCCATTCAGCGCCTTGGTGAGAGCACCATCCGTGAGCGTTACGGCAACCTCTTCGAAATGTATGAGAAGATCACCGACGAGAACGCCTATAAGGTTCCGATGCGGATCTATCCGGCTCCGCACTACTCCATGGGCGGTCTCTGGGTCGATTACAACTGCATGAGCAACGTGCCGGGCCTCTTCGTTCTGGGTGAAGCCAACTTCTCGGTGCATGGAGCGAACCGTCTCGGCGCCAGCGCACTCATGCAGGGGCTTGCCGACGGCTACTTCGTCATCCCCTACACTATCGCCGACTACCTTGCCCGTATTACCCCGGGCAAAGTCAAGGCGGATCATCCGGAGTGCAAGAAATCGGTTGAGGATGTTAATAACGACCTCAAGAAGTTCGTGTCGATCAACGGCAAGAAGACGGTCACCGAGTTCCACCGCGAACTGGGCAAGATCATGTGGAACAACGTCGGTATGGCCCGGAGCGAGGAGAGCTGCAAGGAGGCACTCAAGGTAATCCCGCAGATCCGTGAGGAGTTCTGGAAGAACGTGAAGGTTAGCGGCTCCGGTGCTGAGTTCAACCAGCAGCTTGAGAACGCTGGCCGCGTAGCCGACTTCCTGGAGTTTGCCGAGCTCATGACGCTGGATGCCCTCCATCGCAACGAGTCCTGCGGCGGGCACTTCCGGGTCGAGCACCAGATGCCCGACGGCGAGGCCAAGCGGGACGACGAGAACTACTGCTATGCCGCCGCCTGGGAGTTCAAGGGTGTCGGCAAAGAGCCCGAGCTTCACAAGGAGCCGCTGAAGTTTGAAAACGTCCACCTTGCTATAAGGAGCTACAAATAATGAGCCATCACGACAAGAATATGACTCTTACCCTTCATGTCTGGCGCCAGAAGGGACCGAAGGACCCGGGGAAATTCGAGGTCTACGAGGCGAAAGACGTCAGTCCCGACCAGTCGTTCCTCGAAATGCTCGACGACGTCAACGAGGAACTCATCAAGCAGGGGAAGGACCCCATCGCCTTCGATCACGACTGCCGTGAGGGTATCTGCGGCATGTGCTCCCAGGTAATCAACGGCATTCCACATGGCGGCATGGACCGGACAACGGTTTGTCAGCTCCACATGCGGATGTTCAAGAATGGCGATGCCATCTACATCGAGCCGTGGCGTGCCCGCGCATTCCCGATCATCAAGGATCTGGTCGTTGACCGGGGAGCCCTCGACACCATTATCCAAGCAGGCGGCTACACATCGGCCCATACCGGCGGAGTTGCCGACGGCAATGCCCTTCTCATCCCGAAGGACGATGCCGATTACGCCATGGACGCTGCCGAGTGCATCGGCTGTGGTGCTTGCGTGGCAGGCTGCCCCAACGGGTCGGCTATGCTGTTCACCTCTGCCAAGGTGTCGCAGCTTGCGGTCCTGCCGCAGGGCAAAGCCGAAGCCACCCGTCGTGTCAAGGCAATGACCGAGACCTTGCAGGAGTGCGGTTTCGGTAACTGTACCAACCACTACGAGTGCCAGGCTGCGTGTCCCAAGGGGATCAACGTGAAGTTCATCGCTACGCTGAACAGGGAGTACCTCAAGTCTCTCTGCAAATAG
Claims (8)
1. 一种构建利用电能固定CO2的工程菌的方法，其包括：以电合成菌株G.sulfurreducens ACL为底盘过表达异柠檬酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶，获得工程菌。
2.如权利要求1所述的构建利用电能固定CO2的工程菌的方法，其特征在于：进一步具体包括，
第一步，构建过表达异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的表达载体pRK- Geo5-ISODH-MD；
第二步，将所构建的质粒通过接合转移转化到底盘菌G.sulfurreducens ACL中。
3.采用权利要求1或2所述构建方法构建的工程菌。
4.一种实现利用电能固定CO2的方法，其特征在于，包括：
将权利要求3所述工程菌接种于H-型微生物燃料电池的阴极，在阳极连续通入N2和CO2构成的混合气以给细菌细胞提供碳源，实现CO2的固定。
5. 一种构建实现CO2转化为3-羟基丁酸的工程菌的方法，其特征在于：以电合成菌株G.sulfurreducens ACL为底盘过表达异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶以及3-羟基丁酸合成途径相关酶，获得工程菌，所述3-羟基丁酸合成途径相关酶包括乙酰乙酰辅酶A合成酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶以及3-羟基丁酰辅酶A硫酯酶。
6.如权利要求5所述构建实现CO2转化为3-羟基丁酸的工程菌的方法，其特征在于，进一步包括：
第一步，构建过表达异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶以及经密码子优化3-羟基丁酸合成途径相关酶的表达载体pRK-Geo2i-HB-ISODH-MD；
第二步，将所构建的质粒通过接合转移转化到底盘菌G.sulfurreducens ACL中。
7.采用权利要求5或6所述构建方法构建的工程菌。
8.利用微生物电合成方法实现CO2合成3-羟基丁酸的方法，其特征在于，包括：将权利要求7所述工程菌接种到H-型微生物燃料电池的阴极，在阳极连续通入混合气以给细菌细胞提供碳源，实现3-羟基丁酸的合成。
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